مقالة منهجية

تقييم الوظيفي للأعصاب البيولوجية في الثقافات الشبكية من الخلايا الجذعية المستمدة من الجهاز العصبي المركزي الخلايا العصبية

11.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52361

⸱

فبراير 5, 2015

 ,  ,  , 
1Research Division, Cellular Molecular Biology Branch, United States Army Medical Research Institute of Chemical Defense

في هذه المقالة

ملخص

يتم وصف بروتوكول مخصص لتمييز خلايا ES للفأر إلى مجموعات محددة من الخلايا العصبية عالية النقاء التي تظهر نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية وسلوك الشبكة الناشئ. يوضح التحليل الفيزيولوجي الكهربي فقدان انتقال الشبكي بعد التعرض للأنماط المصلية للسموم العصبية / A- / G والسموم العصبية للكزاز.

الملخص

تم الدراسات العلاجية والآلية للأعصاب المطثية المستهدفة presynaptically (الأنابيب النانوية الكربونية) محدودة بسبب الحاجة إلى وجود نموذج قائم على خلية قابلة للأن تنتج نقاط الاشتباك العصبي عاملة ويخضع الاستجابات الفسيولوجية للتسمم. نحن هنا وصف طريقة بسيطة وقوية للتمييز كفاءة خلايا الفئران الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) في الأنساب محددة من النشطة synaptically، الخلايا العصبية المتصلة بالشبكة. بعد بروتوكول التمايز 8 يوم، الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ESNs) بسرعة تعبير عن وتجزئة البروتينات neurotypic، تشكل الأشكال التضاريسية العصبية وتطوير الاستجابات الكهربائية الجوهرية. قبل 18 يوما بعد التمايز (DIV 18)، ESNs يحمل glutamatergic نشط وγ الغاما حمض (GABA) نقاط الاشتباك العصبي ergic والسلوكيات شبكة الناشئة التي تتميز مثير: التوازن المثبطة. لتحديد ما إذا كان التسمم مع الأنابيب النانوية الكربونية يعادى وظيفيا متشابك العصبي، وبالتالي تكرار عشره في الجسم الحي الفيزيولوجيا المرضية هي المسؤولة عن المظاهر السريرية للتسمم أو مرض الكزاز، تم استخدام خلية كاملة المشبك التصحيح الكهربية لقياس التيارات عفوية مصغرة مثير آخر متشابك (mEPSCs) في ESNs تتعرض لعصبي الكزاز (خيمة) أو عصبي البوتولينوم (بونت) الأنماط المصلية / A- / G. في جميع الحالات، عرضت ESNs فقدان شبه كاملة من النشاط متشابك في غضون 20 ساعة. وظلت الخلايا العصبية مخمورا قابلة للحياة، كما يتبين من دون تغيير إمكانات غشاء يستريح والاستجابات الكهربائية الجوهرية. لمزيد من تميز حساسية هذا النهج، تم قياس الآثار التي تعتمد على جرعة من السكر على النشاط متشابك 20 ساعة بعد إضافة بونت / A. أدى التسمم مع 0.005 PM بونت / A في إنقاص كبير في mEPSCs، مع تركيز مثبط متوسط ​​(IC 50) من 0.013 PM. مقارنات بين جرعات متوسط ​​تشير إلى أن القياسات الوظيفية لتثبيط متشابك هي أسرع وأكثر تحديدا وأكثر حساسية من كمينالمقايسات الانقسام أو مقايسة الماوس الفتك. هذه البيانات التحقق من صحة استخدام جانب synaptically، الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية خلية للكشف محددة للغاية وحساسة من الأنابيب النانوية الكربونية.

المقدمة

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو تقييم وظيفيا النشاط متشابك في الثقافات شبكات الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية تتعرض لأعصاب المطثية. وهذا هو أول مظاهرة من نموذج مستمد في المختبر أن يعيد ظيفيا pathophysiologies المسؤولة عن المظاهر السريرية للالتسمم الغذائي ويؤكد ESNs كنموذج مناسبة للكشف عن الأنابيب النانوية الكربونية، وفحص العلاجي والدراسات الميكانيكية.

BoNTs للأعصاب البكتيرية القاتلة للغاية التي تنتجها أعضاء المطثيات. بما في ذلك اقترح مؤخرا بونت / H، وقد وصفت ثمانية أنماط مصلية بونت متميزة مستضديا (/ A- / H) 1،2. يتم التعبير عن كل الأنماط المصلية إلى 150 كيلو دالتون الببتيدات التي هي في مرحلة ما بعد translationally رصدت لإنتاج dichain تتكون من 100 كيلو دالتون السلسلة الثقيلة (HC) و 50 كيلو دالتون ضوء سلسلة (LC) ويربطها به السندات ثاني كبريتيد 3. وHC يتوسط ملزم لمستقبلات قبل المشبكي والأنف والحنجرةراي من السم في الخلايا العصبية عن طريق الإلتقام متشابك. أثناء معالجة endosomal، وHC يخضع الهيكلية إعادة تنظيم لتشكيل المسام في الغشاء حويصلة، وتسهيل النبات من LC في العصارة الخلوية قبل المشبكي. وLC ثم يستهدف تحديدا ويشق للذوبان N-حساسة -ethylmaleimide الانصهار مرفق البروتين مستقبلات (كمين) البروتينات في المقصورة قبل المشبكي: SNAP-25 (بونت / A، / C، / E)، VAMP2 (بونت / B، / D، / F، / G) أو syntaxin (بونت / C) 1. انشقاق أي من هذه البروتينات كمين يمنع الجمعية من الآلات إيماس متشابك، وبالتالي عرقلة الافراج عن الناقلات العصبية. هذا المزيج من استهداف الخلايا العصبية كفاءة وتوطين قبل المشبكي يجعل BoNTs السموم أقوى معروفة، بجرعات قاتلة الإنسان المقدرة منخفضة تصل إلى 0،1-1 نانوغرام / كغ 1.

فحوصات الكيمياء الحيوية يمكن استخدامها للكشف عن وجود أو نشاط CNT خطابات الاعتماد مع حساسية عالية. ومع ذلك، فشلت هذه الأساليب إلى interrogate قدرة السم لربط، أدخل، وتفعيل وظيفة داخل الخلايا العصبية، وبالتالي هي التدابير غير المباشرة وربما مضللة من وجود السم النشط. في المقابل، المقايسات الفنية للتسمم مثل فحص الماوس الفتك (MLA) تقييم شامل لقدرة الأنابيب النانوية الكربونية للتفاوض جميع مراحل امتصاص وتفعيل بنجاح، وتوفير تقييمات أكثر ذات الصلة ومحددة من النشاط السم. في حين أن MLA هو الذهب مستوى الكشف بونت، وهو الأسلوب في الجسم الحي الذي يستخدم الموت باعتبارها نقطة نهاية وبالتالي لديه فائدة محدودة كمنصة البحث. لقد عانى محاولات لتطوير النماذج القائمة على خلية من CNT التسمم مناسبة للدراسات الميكانيكية والفحص العلاجي أيضا قيودا كبيرة. في حين الثقافات الخلايا العصبية الأولية توفر درجة عالية من الأهمية الفسيولوجية، معقد استخدامها من قبل عدد من العوامل، بما في ذلك تكاليف الموارد عالية، والعائد المنخفض نسبيا، وجود عدة الفرعية العصبيةأنواع والرقابة التنظيمية والإدارية واسعة تشارك مع استخدام الحيواني. كبديل للالخلايا العصبية الأولية، استخدمت خطوط الخلايا العصبية (التي يمكن أن يتسبب في اعتماد العصبية التي تشبه الخلايا الخصائص التي كتبها التحفيز الكيميائي) مثل neuroblastomas والخلايا أليفة الكروم الكظرية كنماذج في المختبر من التسمم. وبما أن هذه الخلايا هي مثقف بشكل مستمر قبل الاستقراء، فهي تدرجية عالية، وبالتالي مناسبة تماما للنهج المعتدل الإنتاجية. ومع ذلك، أهميتها مشكوك منذ الظواهر التي يسببها غير متجانسة عادة، هي سيئة حساسة لتشارك المركز الوطني وتفشل في معرض السلوكيات العصبية الحرجة، بما في ذلك عدم القدرة على تشكيل المقصورات قبل وبعد متشابك أن التجمع في نقاط الاشتباك العصبي يعمل 4. في غياب المقصورات قبل المشبكي سليمة من الناحية الفسيولوجية، ومجموعة كاملة من السم: التفاعلات العصبية لا يمكن تكرارها والقياسات وبالتالي الوظيفية للتسمم وليس من الممكن 5. لار من المستغرب، ومحاولات لإجراء دراسات الآلية أو فحص المخدرات للBoNTs باستخدام خطوط الخلايا العصبية التي يسببها أسفرت عن النتائج التي تتعارض مع في الجسم الحي والدراسات الخلايا العصبية الابتدائية 6.

وقد اقترح التي تنبع قد توفر الجهاز العصبي المركزي (CNS) الخلايا العصبية المشتقة من خلية منصة تستند خلية الجيل المقبل للبحث بونت الذي يجمع بين أهمية الخلايا العصبية الأولية مع مرونة خطوط خلايا مستنبتة 7-10. على وجه الخصوص، تم العثور على الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الماوس (ESNs) أن تكون حساسة للغاية لجرعات الفسيولوجية للبونت / A- / G وتكرار كثير في استجابات الجسم الحي إلى التسمم، بما في ذلك persistences التفاضلي، محسنة النشاط التسمم، والنمط المصلي potencies -specific 5،8،11. وتشير هذه السلوكيات التي في آليات الجسم الحي من بونت امتصاص وتجهيز والاتجار والنشاط يتم حفظها في ESNs. ومع ذلك، وتثبيط النشاط. متشابكذ هو مظهر من مظاهر توقيع التسمم الغذائي، وبالتالي يدل على فقدان النشاط متشابك التالية التسمم عن طريق الأنابيب النانوية الكربونية من الضروري قبل الختامية التي ESNs هي مناسبة في اشتقاق نموذج قائم على خلية المختبر للدراسات CNT.

لقياس آثار التسمم مع الأنابيب النانوية الكربونية على النشاط متشابك، تم استخدام خلية كاملة التصحيح، المشبك الكهربية لقياس التيارات الأحادي المشبك في المعالجة المركبة أو CNT المعاملة DIV 21 + ESNs. وجدنا أن التسمم من ESNs مع بونت / A- / G أو خيمة تسبب فقدان> 95٪ من النشاط متشابك في غضون 20 ساعة في جميع الحالات. بإجراء مزيد من توصيف 20 ساعة بعد التسمم مع بونت / A كشفت عن وجود تأثير تعتمد على الجرعة على النشاط متشابك، مع الحد من الكشف أدناه 0.005 PM وقيمة IC 50 من 0.013 PM. وتشير هذه النتائج إلى أن حساسية والإطار الزمني للكشف الكهربية من التسمم وتحسنت بشكل كبير خلال مقارنة القائم على طخة مناعية آناlyses من SNAP-25 الانقسام والحية المقايسات الماوس الفتك، مما يدل على أن القياسات الوظيفية للتسمم في الثقافات الخلايا العصبية نشطة synaptically قد تسهل طرق أكثر حساسية ومحددة وسريعة لتوصيف الاستجابة الخلوية لبونت.

البروتوكول

1. التكيف من المجالس الاقتصادية والاجتماعية لتغذية خالية من خلية تعليق الثقافة

  1. المجالس الاقتصادية والاجتماعية ذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية حتى تبقى شظية من الجليد.
  2. باستخدام الماصة P1000، ونقل بلطف 1-2،5 × 10 6 فصل المجالس الاقتصادية والاجتماعية إلى طبق المعالجة ثقافة غير الأنسجة التي تحتوي على 10 مل من قبل تحسنت المتوسطة ESC. احتضان في ترطيب حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 20 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
  3. بعد 20 ساعة، وغسل الخلايا عن طريق نقل بلطف ثقافة تعليق إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل باستخدام 10 مل الماصة المصلية. بيليه المجالس الاقتصادية والاجتماعية لمدة 3 دقائق في 200 × ز. أثناء الدوران، إضافة 10 مل من الطازجة المتوسطة ESC إلى طبق المنخفض التصاق.
  4. نضح طاف، مع الحرص على تجنب طرد بيليه الخلية، وإضافة 1 مل المتوسطة ESC الطازجة إلى الخلية بيليه. نقل الخلايا إلى طبق البكتيري باستخدام الماصة P1000 والعودة إلى الحاضنة.
  5. مراقبة الخلايا يوميا حتى تصبح المجاميع مرئية للعين المجردة (عادة من 4 - 8 أيام (د)، وسوف يكون الركام 0.2- 0.5 ملم). إذا المجاميع ليست واضحة بعد 4 د، كرر الخطوة 1.3. مرة واحدة المجاميع مرئية، فصل والحفاظ على المجالس الاقتصادية والاجتماعية كما هو موضح في القسم 2.

2. ESC الركض والصيانة

  1. نقل ESC المجاميع إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل باستخدام العقيمة 10 مل الماصة والسماح المجاميع ليستقر على بيليه الصغير (عادة 3-5 دقيقة). نضح طاف، والحرص على تجنب تعطيل بيليه الخلية، وغسل الركام مع 5 مل PBS. وعلى الرغم من خطورة الاستيطان ويوصى، وخلايا بيليه بدلا من ذلك في 100 x ج لمدة 2.5 دقيقة بدلا من ذلك لتوفير الوقت.
  2. نضح PBS وإضافة 500 ميكرولتر التربسين. احتضان المجاميع في التربسين لمدة 3 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. إضافة 500 ميكرولتر المتوسطة ESC لتخفيف التربسين وبلطف يسحن 10 مرات مع الماصة P1000 لتفريق المجاميع. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  3. بيليه فصل الخلايا لمدة 3 دقائق في 200 x ج و resuspend الخلايا إلى تركيز النهائي من 1.07 × 10 خلية / مل في ESC المتوسطة. نقل 150 ميكرولتر (1.5 × 10 6 خلايا) إلى 10 مل من الطازجة المتوسطة ESC في 10 سم طبق البكتيري والعودة إلى الأنسجة ثقافة حاضنة لمدة 48 ساعة. يمكن أن تكون متباينة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الزائدة، cryopreserved عند 1 - 5 × 10 6 خلية / مل في 90٪ ESC المتوسطة تستكمل مع 10٪ DMSO، أو التخلص منها.
  4. مرور المجاميع كل 48 ساعة. سوف المجاميع جاهزة للمرور تكون مرئية بشكل واضح، بأقطار تزيد على 0.5 مم.
    يتم إنجاز ذوبان وثقافة، خلايا تكييفها تعليق cryopreserved في الخطوات 1،2-1،4: ملاحظة. سوف المجاميع يكون جاهزا للالركض داخل 48-72 ساعة.

3. العصبية التمايز

ملاحظة: إجراء الخطوات 3،1-3،5 قبل الظهر وخطوة 3.7 بعد الظهر. ويقدم لمحة عامة عن الإجراءات التمايز في الشكل 1A.

  1. فصل المجالس الاقتصادية والاجتماعية كما هو الحال في الخطوات 2،1-2،5. نقل 350 ميكرولتر (3.5 × 10 6) من فصلالمجالس الاقتصادية والاجتماعية د إلى 10 سم طبق مرفق منخفضة تحتوي على 25 مل التمايز المتوسطة. وضع على شاكر المداري المقرر أن 30 - 45 دورة في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. هذا هو اليوم الأول من التمايز، يوم يطلق عليه في المختبر (DIV) -8.
    ملاحظة: إن استخدام طبق مرفق منخفضة للغاية يزيد من تكلفة الطريقة، ولكن تنتج عوائد أكبر قليلا من أطباق بتري البكتيرية منذ المجاميع يمكن أن تلتزم في بعض الأحيان إلى أطباق بتري. إذا فضلت الأحجام صحن مختلفة، وأحجام المتوسطة وأعداد الخلايا يمكن زيادتها وفقا لذلك.
  2. بعد 48 ساعة (DIV -6)، استخدام 25 مل الماصة لنقل المجاميع خلية التفريق إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة على الفور جديدة 25 مل من التمايز المتوسط ​​إلى طبق بيتري.
  3. سماح المجاميع ليستقر على 2-5 دقيقة، مما ينتج عنه بيليه واضحة على أن يكون من 1 - 2 مم عميق. تجاهل الخلايا واحد أو المجاميع الصغيرة المتبقية في تعليق. نضح بعناية المتوسطة ونقل مليرة لبنانية بيليه إلى طبق بتري باستخدام P1000. وضع على دوار شاكر في حاضنة زراعة الأنسجة.
  4. في DIV -4 كرر الخطوة 3.2. سوف يكون بيليه 2-4 ملم عميق. استبدال 30 مل التمايز المتوسطة تستكمل مع 6 ميكرومتر جميع العابر حمض الريتينويك (RA) إلى طبق بتري. العودة إلى دوار شاكر في حاضنة زراعة الأنسجة ل48 ساعة إضافية.
  5. في DIV -2 كرر الخطوة 3.3. سوف بيليه أن تكون من 4 - 8 ملم عميقة في هذه المرحلة.
  6. في DIV -1، وإعداد الأسطح الطلاء كما هو الحال في القسم 4.
  7. في DIV 0، ذوبان الجليد 5 مل من قبل aliquoted والمجمدة مجلس الشعب trypsinization المتوسطة عند 37 درجة مئوية لمدة من 5 - 10 دقيقة ومكان في نسيج الثقافة هود. باستخدام الماصة 25 مل، ونقل التفريق المجاميع إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. سماح المجاميع ليستقر والمتوسطة نضح بعناية. غسل بيليه مرتين مع 10 مل PBS، والسماح للمجاميع ليستقر بين يغسل.
  8. بعد غسل PBS الثاني، إضافة 5 مل من مجلس الشعب trypsinization المتوسطة لبيليه واحتضان عند 376؛ C لمدة 5 دقائق. نفض الغبار بلطف الأنبوب بعد 2.5 دقيقة.
  9. إضافة 5 مل من 0.1٪ فول الصويا مثبط التربسين (STI) لإبطال نشاط التربسين وتخلط بواسطة قلب. يسحن بلطف 10-15 مرات مع الماصة 10 مل المصلية حتى يتم إنتاج تعليق خلية متجانسة نسبيا.
  10. نقل ببطء تعليق الخلية إلى مصفاة الخلية 40 ميكرون أو 70 ميكرون وضعت في الجزء العلوي من 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. مرة واحدة وقد تم تصفيتها كل تعليق، إضافة 1 مل من N2 المتوسطة لغسل الخلايا المتبقية من خلال تصفية وبيليه تعليق خلية فصلها لمدة 6 دقائق في 200 × ز.
  11. نضح المتوسطة من دون إزعاج بيليه. غسل الخلايا مرتين مع 10 مل المتوسطة N2، التكوير خلايا لمدة 5 دقائق في 200 x ج والطحن بين يغسل مع P1000. قبل غسل الثاني، عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  12. Resuspend الخلايا في N2 المتوسطة في 1 × 10 7 خلايا لكل ESNs مل و لوحة في مناطق ذات كثافة خلية من 150،000 - 200،000 خلية / سم 2.
  13. نقل بلات حديثاإد ESNs لترطيب حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 والحفاظ كما في القسم 5.

4. إعداد الثقافة السطوح لتصفيح العصبية السلائف في DIV 0

  1. إعداد أطباق الأنسجة المعالجة الثقافة لا يقل عن 1 يوم قبل الطلاء. إضافة polyethyleneimine كافية (PEI، و 25 ميكروغرام / مل في H العقيمة 2 O) أو بولي-D-ليسين (PDL؛ 100 ميكروغرام / مل في H العقيمة 2 O) لتغطية علاج الأنسجة ثقافة الأطباق البلاستيكية واحتضان O / N في 37 ° C.
  2. صباح الطلاء، وغسل الأطباق مرتين مع المزدوج المقطر H 2 O ومرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. بعد غسل النهائي، إضافة يكفي المتوسطة N2 لتغطية الطبق (على سبيل المثال، 1 مل لكل بئر من صحن 12-جيدا أو 4 مل لكل 6 سم طبق).
  3. إعداد 18 ملم coverslips الزجاج على الأقل يوم واحد قبل الطلاء الخلايا العصبية. coverslips نظيفة عن طريق لمدة 4 دقائق لتنظيف البلازما.
  4. نقل على الفور coverslips تنظيفها إلى بارافيلم غسلها الإيثانول في الجزء السفلي منطبق العقيمة كبير وإضافة 400 ميكرولتر من PEI أو PDL الحل، الذي أعد كما في الخطوة 4.1. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة.
  5. في الصباح، وغسل coverslips ثلاث مرات بالماء وإضافة 5 ميكروغرام / مل laminin في برنامج تلفزيوني لمدة 1 - 3 ساعة على 37 درجة مئوية. قبل النأي الخلايا العصبية، نضح laminin وعلى الفور نقل ساترة لبئر من صحن 12-جيدا تحتوي على 1 مل من المتوسط ​​مجلس الشعب، ويجري التأكد من الحفاظ على الجانب المعالج مواجهة.
  6. متجر أطباق وcoverslips عند 37 درجة مئوية حتى الشخصيات مستعدة لوحة.

5. الحفاظ على الخلايا العصبية

  1. في DIV 1، نضح المتوسطة واستبدالها مع N2 مستنبت.
  2. في DIV 2 و 4، نضح المتوسطة واستبدالها مع الثقافة B27 المتوسطة.
  3. في DIV 8، نضح المتوسطة واستبدالها مع الثقافة B27 المتوسطة التي تحتوي على مثبطات الإنقسامية للقضاء على تلوث الخلايا غير العصبية.
  4. في DIV 12، استبدال ثقافة B27 المتوسطة.
  5. لا تقم بإزالة DIV12 + ESNs من 5٪ CO 2 حتى جاهزة للاستخدام.

6. تثبيط تقاس من متشابك بالإرسال (ميست) الفحص لقياس التيارات مصغرة مثير بعد متشابك

تنبيه: أعصاب المطثية هي أكثر المواد السامة المعروفة، مع LD الإنسان يقدر بنحو 50 قيم منخفضة تصل إلى 0،1-1 نانوغرام / كغ. الحصول على الموافقات اللازمة قبل استخدام هذه السموم واستخدام الاحتياطات المناسبة.

  1. تمييع بعناية بونت / A إلى 100X التركيز النهائي المطلوب في ESN مستنبت ودافئة إلى 37 درجة مئوية. إضافة حجم مناسب من السم لDIV 21 + ESN الثقافات، دوامة الطبق الثقافة، والعودة إلى الحاضنة.
  2. إذا كان سيتم تحليل خلايا أكثر من 4 ساعات بعد التسمم، إضافة السم إلى الطبق ودوامة دون إزالة من 5٪ CO 2، مثل مباشرة في الحاضنة أو في ثابت CO 2 غرفة.
  3. في نقطة زمنية مناسبة، aspiraالشركة المصرية للاتصالات ESN مستنبت ويغسل مرتين مع العازلة تسجيل خارج الخلية (إرب). إضافة 4 مل من ERB تستكمل مع 5.0 ميكرومتر سم الأسماك الرباعية الأسنان و 10 ميكرومتر bicuculline، وعرقلة امكانات العمل واستعداء GABA A نشاط مستقبلات، على التوالي.
  4. نقل الطبق إلى الكهربية تلاعب. مطلوب لا نضح ولا التحكم في درجة الحرارة للمقايسة ميست.
  5. سحب الزجاج البورسليكات باستخدام مجتذب ممص مكروى لإنتاج ماصة تسجيل مع 5-10 mΩ المقاومة وملء مع العازلة تسجيل داخل الخلايا. تراجع بلطف شغل ماصة تسجيل في siliconizing كاشف قبل التسجيل.
  6. باستخدام حقنة مليئة بالهواء، وتوفير الضغط الايجابي كما هو خفض تسجيل ماصة في ERB. بعد الهبوط بلطف تسجيل ماصة على سوما من الخلايا العصبية ليتم تسجيلها، وإزالة الضغط الايجابي وتشكيل gigaseal. تقليل الجهد لعقد -70 بالسيارات. تطبيق بعناية الضغط السلبي لكسر في تكوين خلية كاملة.
  7. التبديل إلى المشبك الحالي لرصد وتسجيل يستريح غشاء المحتملة. دون تعديل لإمكانات تقاطع السائلة، فإن إمكانات غشاء الراحة ما بين -67 إلى -82 بالسيارات.
  8. إجراء المستمر -70 بالسيارات تسجيل الجهد المشبك ل4-5 دقيقة للكشف عن مصغرة مثير التيارات ما بعد المشبكية (mEPSCs).
  9. تحليل 4 دقائق من البيانات المسجلة للكشف mEPSC باستخدام برنامج الكشف عن ارتفاع مع الإعدادات التالية: عتبة، 5؛ فترة للبحث كحد أقصى المحلي، 10،000 μsec. الوقت قبل ذروة لخط الأساس، 5،000 μsec. فترة للبحث وقت الاضمحلال، 20،000 μsec. جزء من الذروة إلى إيجاد الوقت الاضمحلال، 0.37، فترة إلى متوسط ​​خط الأساس، 1،000 μsec. العتبة منطقة، 20؛ عدد من النقاط لمتوسط ​​الذروة، 1؛ اتجاه الذروة، سلبي.
  10. جمع وحفظ المعلومات عن الأحداث الكشف عنها. تقسيم عدد من الأحداث الكشف عنها في 4 دقائق و 240 لتحديد وتيرة mEPSC في هرتز.
  11. جمع ترددات mEPSC عن 8-12 تابعسيادة القانون والأمن و8-12 عينات بونت المعاملة لكل حالة التعرض. تحليل التردد ضد السن و-الكثير مطابقة الضوابط. تحديد الدلالة الإحصائية لل٪ تثبيط النشاط متشابك باستخدام باتجاه واحد ANOVA الاختبار واختبار ما بعد خاص-Dunnett ل.

النتائج

لقد قمنا بتطوير بروتوكول تمايز تمكن الإنتاج الاقتصادي لكميات كبيرة من الخلايا العصبية الجذعية نقية للغاية المستمدة من الخلايا من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس (المفصل في الشكل 1A) 8،11. وقد استخدمت هذه الطريقة على مدى فترة من السنوات للتمييز بتكاثر المتولدة من القطاع الخاص والمتاحة تجاريا خطوط ESC إلى الخلايا العصبية الأنساب محددة 12-14. وتشمل العناصر الحاسمة في هذا البروتوكول (1) التكيف من المجالس الاقتصادية والاجتماعية لالمغذية ثقافة تعليق خالية من الخلايا. (2) الصيانة المناسبة للثقافات تعليق. و (3) التمايز في ظل ظروف الدوارة. الانتقال إلى ثقافة تعليق يقلل بشكل كبير من الوقت وتكلفة الصيانة ESC، ويغني عن الحاجة لإزالة الخلايا المغذية قبل التمايز. وبعد التكيف تعليق، Oct3 / 4 التعبير يتسق خلال 30 على الأقل الممرات، مشيرا إلى أن التكيف تعليق لا يغير التعبير عن علامات تعدد القدرات (الشكل 1B-D ). المجالس الاقتصادية والاجتماعية هي مناسبة للتمايز الخلايا العصبية مرة واحدة العائد خلية باستمرار يتجاوز 1 × 10 7 خلايا في المرور. ويحدث هذا عادة في غضون عشر الممرات بعد التكيف تعليق أو خمس فقرات بعد ذوبان المجالس الاقتصادية والاجتماعية التي كانت سابقا تكييفها تعليق. تم العثور على التناوب الميكانيكية التفرقة المجاميع أيضا أن تكون حاسمة لزيادة العائد الخلايا العصبية. إضافة شاكر دوارة القضاء تشكيل فائقة الكلي، وزيادة قابلية الإجمالية وإنتاج زيادة ~ 300٪ في محصول الخلايا الاصلية العصبية (الشخصيات) في DIV 0 (الشكل 1E).

يبدأ تمايز نموذجي مع 3.5 × 10 6 المجالس الاقتصادية والاجتماعية في DIV -8 وتنتج 115 × 10 6 الشخصيات في DIV 0، ما يقرب من 60٪ من الذي سوف البقاء على قيد الحياة وتصبح الخلايا العصبية. تتكون ال 40٪ المتبقية الخلايا غير العصبية ويتم التخلص إلى حد كبير بالحرمان المصل بين DIV 0 - 1. ويمكن إزالة عدد صغير من استمرار الدبقية التي كتبها إضافة INH الإنقساميةibitors من DIV 2-4 أو DIV 8 - 12. كثافة تصفيح أمر بالغ الأهمية في DIV 0؛ والخلايا العصبية مطلي قليلة جدا لا تتجاوز 2 أسابيع البقاء على قيد الحياة. في غضون أيام من الطلاء، والخلايا العصبية متباينة يحمل الأشكال التضاريسية العصبية وتجزئة البروتينات neurotypic، مثل MAP2 علامة somatodendritic وعلامة محور عصبي تاو (الشكل 2A). يمكن تحديدها من قبل DIV 14 سينابسينات-1 + نقاط وعلى واجهات محواري تغصني، توحي تشكيل المشبك. وهذا يتفق مع التعبير عن البروتينات علامة متشابك قبل DIV 7 8،11. تستمر الأشكال التضاريسية العصبية إلى أن تنضج من خلال DIV 21، وعند هذه الثقافات الوقت يحمل العرش محواري تغصني تفصيلا ونقاط ومتشابك كبيرة (الشكل 2A). إذا حافظت على نحو ملائم، لا تزال قابلة للحياة ESNs ونشطة لمدة 4 أسابيع على الأقل بعد الطلاء.

التنميط التعبير طولية باستخدام RNA-التسلسل أيد أدلة الصرفي وبروتيوميك من الخلايا العصبية مواصفات لد إنضاج 11،15. علامات التمثيلية للتطور التنموي أظهرت ملامح التعبير مرحلة معينة، بما في ذلك Oct3 / 4، Nestin، DCX، NeuN وKCC2 (الشكل 2B). بواسطة DIV 0، أعرب ESNs نسخ وفيرة من البروتينات الهيكلية الخلايا العصبية محددة، بما في ذلك MAP2 وتاو. وتمشيا مع النتائج السابقة، وقد لوحظت علامات لاثنين فقط من الأنواع الفرعية العصبية: الدماغ المتوسط ​​/ الدماغ المؤخر الخلايا العصبية glutamatergic، معربا عن vGluT2 وinterneurons GABAergic 8. في المقابل، أظهرت مجموعة واسعة من glutamatergic وGABAergic علامات زيادات حادة في التعبير بين DIV 0 وDIV 7، بما في ذلك البروتينات كمين قبل متشابك اللازمة لإطلاق سراح العصبي. المستقبلات العصبية اللازمة لاستجابات ما بعد المشبكية. والبروتينات السقالات اللازمة لحبل هذه المستقبلات على غشاء بعد المشبكي. الخلايا العصبية يحمل الخصائص الكهربائية الجوهرية الناضجة التي كتبها DIV 14 و عفوية مصغرة تيارات ما بعد متشابك مثير كتبها DIV16 16.

تم استخدام تثبيط تقاس من متشابك بالإرسال (ميست) فحص لتقييم تأثير التسمم على النشاط متشابك. وبمقارنة الترددات mEPSC بين DIV حالة سكر والمعالجة السيارة 24 + ESNs، ويوفر ميست قياس الكمي ومحددة من التسمم بناء على تثبيط وظيفي من النشاط متشابك (الشكل 3A). وقد استخدم ميست لقياس آثار بونت / A- / G أو خيمة على النشاط متشابك في ESNs في 20 ساعة بعد إضافة حمام من كل السموم. أضيفت السموم في تركيز يعادل 10 أضعاف قيمة EC 50، والتي سبق تحديدها من خلال تحليل طخة مناعية من كمين البروتين انشقاق 11. جميع السموم خفضت الترددات mEPSC إلى أقل من 5٪ من الضوابط المعالجة السيارة. كانت تخفيضات في أسعار متشابك لا تعزى إلى موت الخلايا أو ردود الجوهرية تتغير منذ كانت ESNs مخمورا قابلة للمصححة، أطلقت إمكانات العمل المتكررةردا على حقن الحالي وعرضت أي تغيير كبير في يستريح غشاء المحتملة (الشكل 3B، C).

لمقارنة حساسية ميست إلى الأساليب القائمة للكشف عن الأنابيب النانوية الكربونية والحد من الكشف وتركيز مثبط متوسط ​​(IC 50) تم تحديد 20 ساعة بعد إضافة بونت / A إلى ESNs. التسمم من قبل ما لا يزيد عن 0.005 PM بونت / A تنتج انخفاض كبير إحصائيا في وتيرة mEPSC، حيث بلغت قيمة IC 50 من 0.013 PM وإسكات كاملة من النشاط متشابك فوق 12:05 (الشكل 4A). هذه القيمة IC 50 يتوافق مع ما يقرب من 0.5 الماوس وحدة قاتلة / مل، مما يوحي بأن ميست هو ضعف حساسة و2- إلى 4 أضعاف أسرع من MLA في الكشف عن وجود بونت / A. القياسات طخة مناعية من SNAP-25 انشقاق أنتجت قيمة EC 50 من 12:38 وجرعة كشف تقل عن 0.05 مساء، مشيرا إلى أن ميست هو ما يقرب من 30 أضعاف أكثر حساسيةمن الكشف القائم على طخة مناعية من البروتينات كمين المشقوق (الشكل 4B).

figure-results-1
لا تزال الشكل 1. ESNs-تكييفها تعليق مستقرة ميتوتيكلي وسرعة علامات تعدد القدرات. (A) رسم تخطيطي للصيانة ESC والتمايز. تم وضع علامة على وجود أو عدم وجود حمض الريتينويك (RA) أو عامل مثبط سرطان الدم (LIF) من قبل + أو -. ويرد مقارنة بين أيام في المختبر (DIV) ومراحل تطور الكلاسيكية (DS) للثقافات الخلايا العصبية الابتدائية 17. معدلات (B) انتشار لR1، D3 وخطوط الخلايا C57BL / 6J ES استقرار خمسة ممرات بعد التحول إلى ثقافة تعليق. (C) التدفق الخلوي البيانات تظهر أي تغيير جوهري في Oct3 / 4 التعبير في R1، D3 وخطوط الخلايا C57BL / 6J ES قياس أكثر من 25 فقرات في الثقافة تعليق (ن = 6 لكل منهما). (D) غلة خلية الفعلية خلال الركض الروتينية للحصول على خط R1 ESC-تكييفها تعليق قياسها بين الممرات 5 و 30 (خط أسود). وتعرض العوائد التراكمية النظرية إذا يتم تجاهل أي خلايا أثناء الركض أيضا (خط أحمر). (E) وصور برايت مجال DIV 0 المجاميع المنتجة في إطار ثابت (يسار) أو شروط الدوارة (يمين). شروط دوارة تنتج المجاميع كروية دون التكتل وارتفعت غلة NPC 3 أضعاف (P <0.001، قررت استخدام اختبار t الطالب) 11. * يشير إلى P <0.05. لقد تم تعديل هذا الرقم من هوبارد وآخرون 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. المورفولوجية، والعلاقات العامةدليل oteomic وtranscriptomic من مواصفات العصبية ونضوج (A) كيمياء سيتولوجية مناعية من DIV 7 - 49 DIV يوضح تشجر العصبية وظهور نقاط ومتشابك في واجهات محواري تغصني. وصفت محاور مع تاو (الأخضر)، وصفت التشعبات مع MAP2 (الحمراء)، وصفت مقصورات قبل متشابك مع سينابسينات (أبيض)، وهي ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). (B) التنميط التعبير طولية من الجينات تمثيلية يدل التنموي التعبير مراحل محددة وتحديد الأنواع الفرعية العصبية. وأعرب جميع النصوص الجين كرقم تقريبي من النصوص لكل خلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. ESNs تحت. اذهب تثبيط النشاط متشابك عند تعرضها للبونت / AG وخيمة (A) آثار التمثيلية من ESNs جمعت 20 ساعة بعد إضافة حمام من ~ 10 × 50 EC قيم بونت / A - / G، وخيمة أو مركبة. كل عصبي تخفيض النشاط متشابك من قبل أكثر من 95٪ بالمقارنة مع مجموعة المقارنة. ظلت (ب) الخلايا العصبية مخمورا قادرة على إطلاق الجزائرية المتكررة ردا على إزالة إستقطاب حقن الحالي (كما هو موضح لبونت / A، ولكن لوحظ في جميع الثقافات مخمورا) و (C) عرضت أية تغييرات في يستريح غشاء السلبي المحتمل (C، N> 18 لكل معاملة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. تحديد حساسية MIST في بونت / A المعاملةESNs. (A) القياسات ميست من النشاط متشابك 20 ساعة بعد إضافة حمام من بونت / A. أظهرت تمثيلية شرائح أثر الجهد المشبك انخفاضا في وتيرة mEPSC التالية بونت / A التعرض (الجانب الأيسر). الكميات من التردد mEPSC (شريط الرسم البياني، الجانب الأيمن، ن = 20 للضوابط، ن = 11-22 لكل جرعة) يؤكد انخفاض تعتمد على الجرعة في وتيرة mEPSC. تم تحديد تركيز مثبط متوسط ​​مع المربعات الصغرى تناسب من الانحدار غير الخطية باستخدام منحدر متغير أربعة المعلمة (R 2> 0.91). ملاحظة الحد من الكشف عن طريق MIST في ESNs هو 0.005 على الأقل مساء. (B) بونت / A التسمم النتائج ESNs في الانقسام من SNAP-25 كما تصور من قبل التحولات التنقل هلام (وصمة عار التمثيلية الغربية على الجانب الأيسر مع الكمي شريط الرسم البياني يظهر من SNAP-25 انشقاق على الحق، ن = 4) . لاحظ انخفاض حساسية باستخدام كمين البروتين الانقسام (SNAP-25)، ونقطة نهاية (EC 50 0.36 مساء) مقابل ميست (IC 50 من 0.013 م). * يشير إلى P <0.05. *** يشير إلى P <0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

المعيار الذهبي الحالي للكشف عن CNT، وتحديد النمط المصلي والكميات هو MLA. وMLA يستجوب مجموعة كاملة من المضيف: انشقاق تفاعلات السم اللازمة لالتسمم تحدث في الجسم الحي (على سبيل المثال، السم ملزمة لمستقبلات سطح الخلية، واستيعاب للمجمع السم مستقبلات، LC النبات إلى السيتوبلازم، LC بوساطة من الركيزة و تثبيط العصبي متشابك) 18. ومع ذلك، على الرغم من أن MLA تقدم نموذجا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للتسمم، فمن موارد كثيفة، يمكن مرتبك من الملوثات وينطوي على أعداد كبيرة من الفئران مع الموت باعتباره نقطة النهاية. بدلا من ذلك، المقايسات خلية القاعدة للكشف بونت والكميات اقتصرت على الثقافات الخلايا العصبية الأولية، والتي تتطلب أيضا استخدام الحيواني، أو خطوط الخلايا العصبية، التي لا تشكل نقاط الاشتباك العصبي وتظهر عادة سيئة الحساسية للأعصاب 8. وحتى الآن، فإن معظم قياسات سكر في الوقد اعتمدت منصات خلية القاعدة جنوب شرقي على الكشف عن انشقاق بروتين من SNAP-25، VAMP1 / 2 أو syntaxin-1 11. وهذه مشكلة لأنه قد ثبت أن بروتين كمين الانقسام أن تكون مرتبطة غير خطي مع تثبيط متشابك في الجسم الحي، وبالتالي قد لا تمثل بدقة التسمم أو الشفاء من التسمم 19،20.

ومن شأن نظام النموذج القائم على خلية مثالية للكشف عن CNT (ط) أن يكون القائم على الخلايا العصبية. (ب) أن يقترن synaptically مع الاستجابات الكهربائية neurotypic. (ج) تكون حساسة للغاية لجميع الأنماط المصلية CNT أو فرعية. و (د) عرض التدرجية، والإنتاجية وفحص الأوقات التي تعادل أو المحسنة خلال MLA، بتكلفة أقل، ودون الحاجة إلى استخدام الحيوانات. لتلبية هذه الاحتياجات، قمنا بتطوير طريقة لإنتاج كميات كبيرة من التخصيب والثقافات شبكية لglutamatergic والخلايا العصبية GABAergic من المتاحة تجاريا خطوط الماوس ESC. نحن بعد ذلك وضعت الفحص ميست لتحديدتثبيط متشابك ردا على التسمم مع خيمة وبونت / A- / G. بينما يمكن إجراء الفحص ميست على أية مجموعة من السكان الخلايا العصبية نشطة synaptically (على سبيل المثال، الخلايا العصبية الأولية أو شرائح الدماغ)، حاليا ESNs هي فقط في المختبر المستمدة نموذج الخلايا العصبية التي تطور بتكاثر السلوكيات شبكة الناشئة وبالتالي فهو مناسب للمقايسة ميست.

تنتج كميات كافية من الخلايا العصبية من النسب المحددة للدراسات CNT المطلوبة العديد من الابتكارات في الثقافة ESC والتمايز. أولا، من خلال تحديد للزراعة والمجالس الاقتصادية والاجتماعية التي يمكن البقاء على قيد الحياة تعليق-التكيف، فإننا التخلص من احتمال تلوث بواسطة الخلايا المغذية، والحاجة إلى تنقية الخلايا المغذية من المجالس الاقتصادية والاجتماعية في بداية التمايز. على الرغم من أن الآليات الجزيئية الكامنة وراء تعليق-التكيف غير معروفة، لا تزال المجالس الاقتصادية والاجتماعية-تكييفها تعليق النشطة ميتوتيكلي والاحتفاظ بها Oct3 / 4 التعبير وستظل العصبية. باستخدام هذه الطريقة، ~ 1.5 × 10 7 Eوعادة ما يتم استردادها اللجان الدائمة كل ممر. ثانيا، تم زيادة إنتاج الشخصيات ~ 300٪ من خلال دمج الإثارة الميكانيكية لمنع التكتل خلال التمايز، وزيادة ظاهريا الوصول إلى المغذيات الداخلية للركام. وخلال هذه العملية، وجدنا أن المصل المستخدمة للثقافة ESC وتمايز الخلايا العصبية هو العنصر الأكثر أهمية في الحفاظ على المجالس الاقتصادية والاجتماعية العصبية. للحصول على أفضل نجاح، ونحن نوصي تعليق التكيف خلايا ES لبعضها الكثير من المصل وتخزين المصل عند -20 درجة مئوية إلى دعم الثقافة ESC وتمايز الخلايا العصبية من خلال تاريخ انتهاء الصلاحية.

كما هو الحال مع معظم الثقافات النشطة synaptically، DIV 14 + ESNs هي عرضة للتغيرات مفاجئة في درجة الحموضة، وحتى التعرض قصيرة إلى الغلاف الجوي CO 2 يمكن تركيزات يؤدي إلى العصبية خلال 24 ساعة. للتجارب التي تتطلب العلاج الثقافات تليها حضانات O / N أو أكثر، يجب أن تعامل الخلايا العصبية مباشرة دائم طن الحاضنة أو نقلها إلى ثابت CO 2 غرفة قبل التجريب.

مجموعة متنوعة من التقنيات وأكدت تكوين الخلايا العصبية والخلايا العصبية النضج، بما في ذلك المحكمة الجنائية الدولية، النسخي وخلية كاملة التصحيح، المشبك الكهربية. وكانت التغيرات الزمانية في التعبير الجيني والخلايا العصبية التشكل بما يتفق مع التقدم السريع من خلال مراحل تطور الخلايا العصبية، وDIV 16، عرضت ESNs مثير والمثبطة تيارات ما بعد متشابك مصغرة مع شبكة الناشئة السلوكيات 16. اقترح دليل على النشاط متشابك أن ESNs قد تكرار pathophysiologies المسؤولة عن المظاهر السريرية للالتسمم الغذائي والكزاز. وهذا ما أكده باستخدام ميست لإظهار أن التسمم مع بونت / A- / G أو خيمة ضعاف الترددات mEPSC التي كتبها> 95٪ مقارنة مع الخلايا العصبية المعالجة المركبة أو غير المعالجة.

وأشارت قياسات لحساسية ميست لبونت / أ أ المثبطة متوسطتركيز (IC 50) من 0.013 PM (ما يعادل 0.5 الماوس وحدة قاتلة / مل) وحد من الكشف أدناه 0.005 م، قياس في 20 ساعة بعد إضافة حمام. وبناء على هذه القيم، ميست هو تقريبا ضعف حساسة مثل و2-4 مرات أسرع من MLA و 30 أضعاف أكثر حساسية من الكشف القائم على طخة مناعية من المشقوق SNAP-25.

بشكل جماعي، وهذه البيانات تشير إلى أن السكان بالشبكة من الخلايا العصبية الجذعية المشتقة من خلية تقدم، نموذج قائم على خلية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للتسمم. جنبا إلى جنب مع أساليب محسنة لاستخلاص الثقافات ESN الشبكية من المجالس الاقتصادية والاجتماعية-تكييفها تعليق، يجب استخدام ميست تقلل من الحاجة إلى التجارب على الحيوانات والمساوئ المرتبطة بها والتكاليف والمخاوف الأخلاقية للMLA في الوقت الذي توفر مقياسا أكثر سرعة، حساس ونوعي ل التسمم. وعلى الرغم من خلية كاملة التصحيح، المشبك الكهربية هي طريقة منخفضة الإنتاجية لتحديد وجود أعصاب النشطة، وهو يقدم القرار، وجمعية مهندسي البترولإد الذي لا يمكن تحقيقه باستخدام الطرق الجزيئية. كما توفر هذه النتائج دليل على أن تطبيق الأساليب التي تعتمد على النشاط لتقييم النشاط متشابك وربما تمكن سلوك الشبكة الكشف السريع ومحددة من أعصاب. ان مثل هذه النهج إنتاجية أعلى جعل الدراسات الميكانيكية، وفحص العلاجي أو المقايسات التشخيصية الممكنة لمجموعة واسعة من وكلاء neuromodulatory، بما في ذلك الأنابيب النانوية الكربونية.

الإفصاحات

وقد أودعت حكومة الولايات المتحدة طلبين دوليين للبراءات يتضمنان الطرائق الموصوفة في هذه المقالة: PCT/US2014/22042، بعنوان "طرق الكشف عن السموم العصبية باستخدام النشاط المشبكي"؛ و PCT / US13 / 40641 ، بعنوان "الكشف عن السموم باستخدام الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية".

شكر وتقدير

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمعهد الصحة الوطني للحساسية والأمراض المعدية (IAA عدد AOD12058-0001-0000) ووكالة الدفاع لتقليص التهديد - علوم المشتركة ومكتب التكنولوجيا، الطبية S & T قسم (أرقام المنح CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 وCBM.THRTOX.01.RC.014). تم إجراء هذا البحث أثناء احتجازهم PB تهديد الدفاع للحد من جائزة الوكالة الوطنية للمجلس البحوث زمالة البحوث وعقد KH جائزة المجلس الوطني للبحوث زمالة أبحاث. نشكر أنجيلا آدكنز وKaylie Tuznik (USAMRICD) للحصول على المساعدة التقنية؛ وسيندي Kronman (USAMRICD) للحصول على المساعدة التحريرية. الآراء الواردة في هذا المقال هي آراء أصحابها ولا تعكس السياسة الرسمية لوزارة الجيش، وزارة الدفاع، أو الحكومة الأمريكية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>الجدول 1. ESC و ESN< / strong>
Knockout DMEMLife Technologies10829-018الوسائط: ESC culture medium
الصياغة والملاحظات: 500 مل
100x MEM NEAALife Technologies11140-050الوسائط: تخزين في 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى شهر واحد
الصياغة والملاحظات: 6 مل
200 مل L-Alanyl-L-GlutamineATCC30-21156 مل
ES مؤهل FBSللخلايا الجذعية التطبيقيةASM-500790 مل
100x المضادات الحيويةSigma-AldrichA59553 مل
55 مل 2-mercaptoethanolLife Technologies21985-0231.1 مل
107< / sup> الوحدات / مل LIFميليبورESG110760 مو ؛ L
Knockout DMEMLife Technologies10829-018الوسائط: ESC التمايز المتوسط
الصياغة والملاحظات: 436.6 مل
100x MEM NEAALife Technologies11140-050الوسائط: تخزين في 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى شهر واحد
الصياغة والملاحظات: 5 مل
200 مل L-Alanyl-L-GlutamineATCC30-21155 مل
مصل معتمد من ESCالخلايا الجذعية التطبيقيةASM-500750 مل
100x المضادات الحيويةSigma-AldrichA59552.5
مل 55 ملي 2-mercaptoethanolLife Technologies21985-0230.9 مل
Dulbecco's PBSSigma-AldrichD8537Media: NPC التربسينية المتوسطة
الصياغة والملاحظات: 100 مل
0.5 م EDTA (18.3٪)Sigma-Aldrich3690الوسائط: تجميد في 5 مل aliquote
الصياغة والملاحظات: 0.266 مل
TrypsinSigma-AldrichT880250 مجم
بولي إيثيلين إيثيلين (PEI)Sigma-AldrichP3143الوسائط: حلول طلاء الأسطح
الصياغة والملاحظات: 2.5 & micro; جم / مل في H2< / sub>0
بولي د-ليسين (PDL)سيجما ألدريتشP7280الوسائط: استخدم في غضون 1 أسبوع < / > الصياغة والملاحظات: 100 & مايكرو; جم / مل في H2< / sub>0
LamininSigma-AldrichL20205 & micro ؛ جم / مل في H2< / sub>0
DMEM / F12 + GlutaMAXLife Technologies10565-018الوسائط: وسط ثقافة NPC
الصياغة والملاحظات: 492.5 مل
100x فيتامينات N2Life Technologies17502-048الوسائط: تخزين في 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى شهر واحد
الصياغة والملاحظات: 5 مل
100x مضادات حيويةSigma-AldrichA59552.5 mL
[header]
Neurobasal ALife Technologies10888-022الوسائط: ESN culture medium
الصياغة والملاحظات: 482.5 مل
50x فيتامين B27Life Technologies17504-044الوسائط: تخزين في 4 درجات ؛ C لشهر واحد
الصياغة والملاحظات: 10 مل
200 ملي L-Alanyl-L-GlutamineATCC30-21155 مل
100x المضادات الحيويةSigma-AldrichA59552.5 مل
5-fluoro-2'-deoxyuridine (5FDU)Sigma-AldrichF0503الوسائط: 2000x مثبطات الانقسام الحجمي aliquot وتخزينها في -20 درجة ؛ C
الصياغة والملاحظات: dd 150 ملغ 5FDU و 350 ملغ يوريدين إلى 10 مل Neurobasal A. مرشح معقم ، aliquot وتجميد. استخدم 2000x في وسيط ثقافة ESN.
UridineSigma-AldrichU3003
TrypLE Express TrypsinLife Technologies12605-010الوسائط: متفرقات
الصياغة والملاحظات: يخزن في متجر RT
DMSOSigma-AldrichD8418في
الصويا مثبط التربسين (STI) متجرSigma-AldrichT6414في -20 درجة ؛ مخزن
الإيثانولسيجما-ألدريتشE7023في
RT حمض الأسكوربيكسيجما-ألدريتشA4403قم بإعداد مخزون 100 ملي مولار عن طريق إذابة 100 مجم من حمض الأسكوربيك في 5.7 مل من مزيج DMSO / الإيثانول 50:50.
حمض الريتينويك (RA)سيجما ألدريتشR2625أعد تعليق 15 مجم RA في 9 مل 50:50 DMSO / الإيثانول. مكمل غذائي يحتوي على 1 مل من مخزون حمض الأسكوربيك 100 مل. Aliquot وتخزينها في -80 درجة مئوية مستقرة لمدة 6 شهور.
<قوي>الجدول 2. MIST < / strong>
NaClSigma-Aldrich71386الوسائط: المخزن المؤقت للتسجيل خارج الخلية
التركيز النهائي (مللي ميغاو): 58.44
ميجاوات: 140
كيلو كولسيجما ألدريتش60135الوسائط: (ERB ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.3 ، 315 مللي مدراس)
التركيز النهائي (مللي مولار): 74.56
ميجاوات: 3.5
NaH 2< / sub>PO4< / sub>Sigma-AldrichS3139الوسائط: مستقر عند 4 درجات ؛ C لمدة 6 أشهر على الأقل
التركيز النهائي (مللي مولار): 119.98
ميجاوات: 1.25
CaCl 2< / sub>Sigma-Aldrich21115التركيز النهائي (مللي مولار): 110.98
ميجاوات: 2
MgCl 2< / sub>Sigma-Aldrich63069التركيز النهائي (مللي مولار): 95.21
ميجاوات: 1
D-glucoseSigma-AldrichG8644التركيز النهائي (مللي موغايست): 180.16
ميجاوات: 10
HEPESSigma-AldrichH0887التركيز النهائي (مللي مو): 238.3
ميجاوات: 10
K-gluconateSigma-AldrichP1847الوسائط: المخزن المؤقت للتسجيل داخل الخلايا
التركيز النهائي (مللي مو): 234.5
ميجاوات: 140
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش71386الوسائط: (IRB ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.3 ، 320 مللي واط)
التركيز النهائي (مللي مو): 58.44
ميجاوات: 5
Mg-ATPSigma-AldrichA9187الوسائط: مستقرة عند 4 درجات ؛ C لمدة 6 أشهر على الأقل
التركيز النهائي (mM): 507.18
ميجاوات: 2
Li-GTPSigma-AldrichG5884التركيز النهائي (مللي مولار): 523.18
ميجاوات: 0.5
CaCl2< / sub>Sigma-Aldrich21115الوسائط: مستقر عند 4 درجات ؛ C لمدة 6 أشهر على الأقل
التركيز النهائي (mM): 110.98
ميجاوات: 0.1
MgCl 2< / sub>Sigma-Aldrich63069الوسائط: مستقر عند 4 درجات ؛ C لمدة 6 أشهر على الأقل
التركيز النهائي (مللي مولار): 95.21
ميجاوات: 1
EGTASigma-AldrichE3889380.35
HEPESSigma-AldrichH0887الوسائط: مستقرة عند 4 درجات ؛ C لمدة 6 أشهر على الأقل
التركيز النهائي (مللي مولار): 238.3
ميجاوات: 10
بيكوكولينتوكرس131الوسائط: متفرقات
التركيز النهائي (ملي): 0.01
ميجاوات: 417.85
CNQXSigma-AldrichC239التركيز النهائي (مللي مو): 0.01
ميجاوات: 276.12
السموم الرباعيةالسيجما ألدريتشA8001التركيز النهائي (مللي مولار): 0.005
ميجاوات: 645.74
BoNT / A- / GMETABIOLOGICSN / Aالوسائط:
التركيز النهائي (mM): TBD
ميجاوات: 150,000
توكسين الكزازSigma-AldrichT3194التركيز النهائي (mM): TBD
ميجاوات: 150,000
SigmacoteSigma-AldrichSL-2التركيز النهائي (mM): N / A
ميجاوات: N / A
<قوي>الجدول 3. المعدات والبرمجيات
MiniAnalysis (الإصدار 6.0.7)Synaptosoft، Inc.برنامج الكشف عن الأحداث N / A
Igor Pro (الإصدار 6.22A)WaveMetricsN / Aبرنامج لتصور التسجيلات
برنامج PatchmasterHekaN / Aبرنامج الحصول على البيانات
Olympus IX51 المجهر المقلوبأوليمبوسN / A
معالج دقيقأداة SutterMPC-365
مكبر للصوتHekaECB10USB
مجتذب ماصة دقيقةSutter InstrumentP-1000
أنابيب شعرية البورسليكات SutterInstrumentB150-86-10Corning 7740
أغطية زجاجية 18 ممفيشر12-545-84
منظف البلازماHarrickPlasma PDC-32G
مصفاة خلية (40 & micro; م)فيشر08-771-1
ستوفال بيلي راقصة شاكرفيشر15-453-211
أطباق منخفضة الالتصاقفيشر05-539-101كورنينج 3262
أطباق بكتيريةVWR25384-302100 × 15 ملم
RT فول

المراجع

  1. Simpson, L. L. Identification of the major steps in botulinum toxin action. Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).
  2. Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).
  3. Singh, B. R. Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting. Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).
  4. Larsen, J. C. U. S. Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions. Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).
  5. McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).
  6. Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).
  7. Pellett, S., et al. Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).
  8. Mesngon, M., McNutt, P. Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons. Toxins. 3, 489-503 (2011).
  9. Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
  10. Whitemarsh, R. C., et al. Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection. Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).
  11. Hubbard, K. S., et al. High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research. BMC Neurosci. 13, 127(2012).
  12. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).
  13. Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
  14. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
  15. Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs. F1000Research. 2 (35), (2013).
  16. Gut, I. M., et al. Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury. PLoS One. 8, e64423(2013).
  17. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).
  18. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  19. Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction. The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).
  20. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction. Muscle & Nerve. 50, 206-215 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تقييم الوظيفي للأعصاب البيولوجية في الثقافات الشبكية من الخلايا الجذعية المستمدة من الجهاز العصبي المركزي الخلايا العصبية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.