مقالة منهجية

وProteoliposome القائم على الدفق الفحص تحديد خصائص جزيء واحدة من الكلور - القنوات وأنظمة نقل

DOI:

10.3791/52369

⸱

أبريل 20, 2015

 , 
1Department of Anesthesiology, Weill Cornell Medical College, 2Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, 3Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تستخدم

البروتينات لدراسة القنوات المنقاة والناقلات المعاد تشكيلها في بيئة كيميائية حيوية محددة جيدا. يتم توضيح إجراء تجريبي لقياس التدفق بوساطة هذه البروتينات. يتم وصف خطوات تحضير البروتينات ، وإجراء التسجيلات ، وتحليل البيانات لتحديد الخصائص الوظيفية للبروتين المعاد تكوينه كميا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تميزت السنوات ال 15 الماضية بانفجار في القدرة على الإفراط في التعبير عن بروتينات الغشاء وتنقيتها من الكائنات بدائية النواة وكذلك من حقيقيات النوى. كانت هذه الزيادة مدفوعة إلى حد كبير بالدفع الناجح للحصول على معلومات هيكلية عن بروتينات الغشاء. ومع ذلك ، فإن القدرة على استجواب هذه البروتينات وظيفيا لم تتقدم بنفس المعدل وغالبا ما تقتصر على المقايسات النوعية ذات القيمة الكمية المحدودة ، مما يحد من الرؤى الميكانيكية التي يمكن أن تقدمها. يتم وصف اختبار للتحقيق الكمي في نشاط النقل لقنوات Cl أو الناقلات المعاد تشكيلها. يعتمد الاختبار على قياس معدل تدفق Cl- من البروتينات بعد إضافة K + ionophore valinomycin لتحويل إمكانات الغشاء. يتم استخدام قطب كهربائي حساس للأيونات لمتابعة المسار الزمني لتدفق الأيونات من البروتينات المعاد تكوينها بالبروتين المطلوب. هذه الطريقة مناسبة للغاية للدراسات الميكانيكية ، لأنها تسمح بالتحديد الكمي للخصائص الرئيسية للبروتين المعاد تشكيله ، مثل معدل النقل الوحدوي ، وجزء البروتين النشط والكتلة الجزيئية للوحدة الوظيفية. يمكن أيضا استخدام الاختبار لتحديد تأثير مركبات الجزيئات الصغيرة التي تمنع / تنشط البروتين المعاد تكوينه بشكل مباشر ، وكذلك لاختبار التأثيرات المعدلة لتكوين الغشاء أو الكواشف المعدلة للدهون. حيثما أمكن ، وجد أن المقارنة المباشرة بين النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تتفق بشكل جيد مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام مناهج الفيزيولوجيا الكهربية. تم توضيح هذه التقنية باستخدام CLC-ec1 ، وهو مبادل H + / Cl- من نوع CLC ، كنظام نموذجي. يمكن استخدام مقايسة التدفق لدراسة أي قناة / ناقل موصل إلى Cl ، وبأقل قدر من التغييرات ، يمكن تكييفه لدراسة أي بروتين ينقل الأيونات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في اثنين العقود الماضية القدرة على بإفراط وتنقية البروتينات النقل الغشاء قد زاد بشكل كبير: القنوات الأيونية، والآن تنقيته النقل الابتدائية والثانوية بشكل روتيني من النظم التعبير مغاير وكذلك المصادر الطبيعية. ويجري باستمرار تطوير مناهج جديدة لمراقبة التعبير، وتحسين وتسهيل استخراج وتعزيز الاستقرار من هذه البروتينات 1-5. وكانت هذه الاختراقات التكنولوجية دورا أساسيا في إحداث انفجار المعلومات الهيكلية المستوى الذري على بروتينات الغشاء الذي، بدوره، وتعزيز فهمنا للقواعد الهيكلية وظيفتها. في المقابل، فإن قدرتنا على تحقيق في الخصائص الوظيفية لبروتينات المنقى لا تزيد بنفس المعدل، حتى أنه في بعض الحالات ويرافق المعلومات الهيكلية عالية الدقة من خلال بيانات وظيفية نوعية، مما يحد من قدرتنا على اختبار كميا التنبؤات القائمة على بنية. وبالتالي، فإن التنطن من المقايسات الفنية الكمية وتعميم هو خطوة رئيسية نحو استجلاء هذه الأسس الميكانيكية للوظيفة البروتين الغشاء.

نحن هنا وصف مقايسة هروب رأس المال التي يمكن استخدامها لتحديد كميا الخصائص الفنية الرئيسية لتنقية وإعادة تشكيل الكلور - القنوات والنقل. المبادئ الأساسية للمقايسة يمكن تعميمها على مجموعة متنوعة من أنظمة النقل، فضلا عن البروتينات غير نقل أيون. وأعيد الجسيمات الشحمية مع تنقية الكلور - قناة / النقل في وجود الكلور كبير - التدرج (الشكل 1A، B). CL - يبدأ هروب رأس المال من خلال إضافة لحامل الأيون للسماح لتدفق مكافحة أيون، في حالتنا K + حامل الأيون valinomycin، الذي إنتقل الجهد الذي أنشأه الكلور - التدرج وتعيين غشاء المحتملة الأولية إلى إمكانية التوازن K + 6،7. دون رانه حامل الأيون لا صافي الكلور كبير - يحدث هروب رأس المال، كما منعت من قبل جيل من إمكانات عبر الغشاء. وكميا وصف البيانات بواسطة معلمتين قابلة للقياس (الشكل 1C): τ، ثابت وقت الكلور - هروب رأس المال، وو 0، وجزء من الجسيمات الشحمية لا تحتوي على البروتين النشط. من τ وو 0 من الكلور الوحدوي - معدل النقل، وجزء من البروتينات النشطة والكتلة الجزيئية للمجمع نشط يمكن أن تستمد 8. ويتضح هنا باستخدام تقنية proteoliposomes تشكيلها مع CLC-EC1، وتتميز كذلك CLC من نوع H + / CL - مبادل من هيكل معروف وظيفة. وتعميم هذا الاختبار بسهولة إلى قنوات أو النقل مع مختلف الانتقائية الأيونية أو التي تعتمد على وجود التيار الكهربائي و / أو بروابط النشاط. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد ما إذا جزيئات صغيرة تؤثر بشكل مباشر على البروتين المعاد،ل quantitate آثار هذه المركبات وكيفية تكوين غشاء أو الكواشف-تعديل المادة الدهنية تؤثر على وظيفة من القنوات وشركات النقل تشكيلها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الدهون

  1. قسامة الدهون المبلغ المطلوب في أنبوب الزجاج واضحة. أنت ترى. القولونية استخراج الدهون القطبي، ولكن معظم التراكيب الدهون يمكن استخدامها. إذا كانت الدهون هي في شكل مسحوق، و resuspend لهم في الكلوروفورم إلى تركيز من 20 ملغ / مل. تجفيف الدهون في RT تحت N 2 الغاز حتى يتبخر كل المذيبات.
  2. Resuspend والدهون في البنتان وجففها مرة أخرى وجود تدفق مستمر من الغاز N 2 لإزالة بقايا آثار من الكلوروفورم. الجاف حتى تبخرت كل المذيبات. بينما التجفيف، وتناوب بلطف الأنبوب بحيث يتم توزيع الدهون في فيلم موحدة تغطي ثلث السفلي من أنبوب بدلا من تشكيل كتلة كثيفة في الجزء السفلي.
  3. إضافة المخزن المؤقت إعادة تحتوي المنظفات (300 ملي بوكل، 50 ملي حمض الستريك، 25 ملي K 2 هبو 4، ودرجة الحموضة 4.5، 35 ملي CHAPS) لإذابة الدهون. استخدام المنظفات معتدل الأخرى لهذه الخطوة إذا كان البروتين هو متسامح سيئة لCHAPS.
  4. Resuspenد الدهون إلى الوضوح باستخدام sonicator حمام الماء. تزج الأنبوب في وسط sonicator باث الماء في أقصى قدر من السلطة وباختصار (30 ثانية-1 دقيقة) نبضات قصيرة (30 ثانية-1 دقيقة) مؤقتا. وينبغي أن تصبح الحل واضح.
    ملاحظة: درجة النهائية من الوضوح حققت تعتمد على تكوين الدهون المحددة المستخدمة. بعض الاختلاف دفعة إلى دفعة في هذه الخطوة، حتى بين الدهون متطابقة اسميا، ممكن أيضا. ومن المقرر أن تشتت الضوء من قبل الجزيئات الكبيرة في التعليق، والتي يمكن إزالتها عن طريق الطرد المركزي الضباب المتبقية.
  5. احتضان الدهون معلق في RT 20-60 دقيقة.

2. تشكيل Proteoliposome

ملاحظة: العديد من الاستراتيجيات التي يمكن أن تستخدم لادخال البروتين المنظفات تذوب في الجسيمات الشحمية. لCLC-EC1 غسيل الكلى يعمل بشكل جيد وبالتالي فهي طريقة اختيار 6،9،10.

  1. إضافة البروتين النقي إلى المطلوب البروتين إلى الدهون (P / L) نسبة (معبرا عنها ميكروغرام س و البروتين / ملغ الدهون). اختيار نسبة P / L يعتمد على الغرض من التجربة.
    1. إذا كان الهدف هو تقييم النشاط من البروتين من الفائدة، وإعادة تشكيل في ارتفاع P / L'الصورة لتعظيم إشارة، حيث أن كل الحويصلية تحتوي على نسخ متعددة من البروتين. لقياس النشاط و / أو معدل النقل الوحدوي من البروتين، وإعادة تشكيل في نظام التخفيف بواسون في انخفاض P / L'الصورة، بحيث يكون لكل حويصلة تحتوي في المتوسط ​​1 البروتين. راجع الخطوة 7 و مناقشة لأكثر في عمق تحليل متى تستخدم كل نظام.
  2. لتحديد القيم المثلى P / L لمختلف الأنظمة، إجراء المعايرة كاملة من النشاط بوصفها وظيفة من تركيز البروتين 8،11-13. ومع ذلك، لأي البروتين التي الوزن الجزيئي (MW، أعرب في كيلو دالتون) وحدة نشطة هو معروف يمكن استخدام القيم L P / التالية كما تخمينات أولية:
    خريج "/>
    figure-protocol-1
  3. تحميل البروتين والدهون الخليط في أنبوب غسيل الكلى قبل المبللة أو الكاسيت. وضع الجهاز غسيل الكلى في دورق يحتوي على 500-1،000x حجم المخزن المؤقت الدهون إعادة (أي 1 L عازلة لل1 مل من الدهون إعادة تعليق) تحت التحريك لطيف.
    1. تغيير عازلة 3-4 مرات على فترات> 3 ساعة. في كل تغيير الحل، وغسل كاسيت / أنابيب والكأس مع الماء المقطر وملء كوب مع العازلة إعادة الطازجة. تشمل 1-2 O / N فترات لتغيير الحل. يعتمد العدد الدقيق ومدة التغيرات حل على الدهون الدقيق والمنظفات المستخدمة.
  4. بعد الخطوة الأخيرة هي كاملة، وإزالة الجسيمات الشحمية من السفينة غسيل الكلى، وقسامة لهم في أنابيب وفلاش تجميد لهم في السائل N 2 أو التجميد في -80 ° C.

3. تسجيل مجموعة المتابعة

<ص الطبقة = "jove_content"> ملاحظة: تسجيل انشاء (الشكل 2A) ويتكون من مجلسين (اسطوانات مسطحة القاع، ~ 3-4 حجم مل)، والكلور - (انظر أدناه) الكهربائي، ودرجة الحموضة متر مع التناظرية أو الإخراج الرقمي الكهربائية، والتحويل الرقمي، وجهاز كمبيوتر مع برنامج الحصول المناسب.
  1. ربط الكلور - القطب إلى متر الرقم الهيدروجيني، والإخراج للمتر الرقم الهيدروجيني إلى التحويل الرقمي التي يتم توصيلها إلى الكمبيوتر. وضع القطب المرجع في غرفة واحدة وسلك إعادة ترميز في الآخرين (الشكل 2B).
    ملاحظة: قطبية من الأسلاك هو الصحيح إذا ΔV كال (انظر الخطوة 6.4 و 7.2) موجبة.
  2. ضع غرف على طبق من ذهب ضجة مع بقضيب في تسجيل غرفة (الشكل 1B). تأكد من أن بقضيب لا تلمس القطب.
  3. ربط الدوائر باستخدام جسر أجار (الشكل 2B) (100 ملي بوكل و 2٪ الاغاروز). تخزين الجسور أجار في 100 ملي بوكل. لى>

4. إعداد الكلور - الكهربائي

  1. خذ غير عاملة القطب درجة الحموضة القديم و-possibly-. كسر طلاء الزجاج لتكشف تماما أسلاك الفضة.
  2. إزالة بعناية طلاء من الأسلاك الفضة باستخدام شفرة المشرط. تنظيف الأسلاك باستخدام كميات وفيرة من H 2 O وETOH.
  3. يتم تغطية مكان في محلول مشبع من FeCl 3 (أو التبييض) حتى الأسلاك مع معطف الظلام موحد للأجكل.

5. إعداد Unilamellar الحويصلات

  1. في الليلة التي سبقت التجارب، تنتفخ 1 غرام من باستخدام Sephadex-50 حبات في 15 مل من العازلة الخارجي (1 ملم بوكل، 150 ملي K 2 SO 4، 25 ملم حمض الستريك، ودرجة الحموضة 4.5) مع طيف والهز (لا يحرك) ل على الأقل 3 ساعة على RT قبل الاستخدام. كل تجربة تتطلب ~ 3 مل من الخرز منتفخة. الحفاظ على حبات منتفخة عند 4 درجة مئوية لمدة بضعة أيام على الأكثر.
  2. في حين أن الجسيمات الشحمية والذوبان في RT، صب في كل عمود ~ 3 ملتر من تورم G-50 الخرز. السماح لهم الجافة قبل تدفق الجاذبية في RT. هذا عادة ما يستغرق 1-2 دقيقة.
  3. إعداد الحويصلات unilamellar بواسطة البثق في proteoliposomes 11 مرة من خلال ميني الطارد باستخدام قطع 0.4 م تفلون.
  4. وضع عمود في أنبوب الجولة القاع من البلاستيك. تدور الأعمدة لإزالة حل الزائد. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20-30 ثانية في 1،400 x ج في جهاز للطرد المركزي السريري.
  5. تجاهل التدفق من خلال عمود مكان في 13 × 100 مم أنبوب زجاجي وإضافة 100 ميكرولتر من الحويصلات مقذوف إلى العمود. تدور العمود لمدة 1 دقيقة في 500 x ج في جهاز للطرد المركزي السريري.
  6. جمع ~ 200 ميكرولتر من التدفق من خلال التي ستضاف إلى غرفة تسجيل في الخطوة 6.5.

6. الدفق القياس

  1. ضع 2 مل من 100 ملي بوكل في إشارة الغرفة (الأرض) و 1.8 مل من المخزن المؤقت الخارجي (1 ملم بوكل، 150 ملي K 2 SO 4، 25 ملم حمض الستريك، ودرجة الحموضة 4.5) إلى غرفة تسجيل. عدم التوازن الاسموزي طفيف بين الداخليةوالحلول الخارجية لا يؤثر
  2. بدء تشغيل البرنامج الاستحواذ. السماح للخط الأساس تتوازن، وهذا قد يستغرق بضع دقائق.
  3. وبمجرد وصول إشارة خط الأساس مستقرة (والجسيمات الشحمية جاهزة والأعمدة الجافة)، بدء التسجيل (الشكل 3A).
  4. إضافة 15 ميكرولتر من 10 ملي بوكل حل لمعايرة نظام (الشكل 2A).
  5. إضافة الجسيمات الشحمية. قفزة صغيرة قد تكون واضحة بسبب إزالة كاملة من الكلور خارجي - من proteoliposomes (الشكل 3A). الانتظار حتى تستقر خط الأساس.
  6. إضافة Valinomycin (1 ميكرولتر من 1 ملغ / مل في ETOH) لبدء هروب رأس المال (الشكل 3A).
  7. السماح للهروب رأس المال مجراها وقته حتى أنه الهضاب (الشكل 3A).
  8. إضافة 40 ميكرولتر من 1.5 M β-octylglucoside (β-OG) التي أعدت في المخزن المؤقت الخارجي على حل جميع الجسيمات الشحمية (الشكل 3A). إنهاء التسجيل.

7. البيانات Analysis

  1. تصدير ملف التتبع من في شكل ASCII أو النص واستيراده إلى برنامج تحليل الاختيار.
  2. قياس الجهد في النقاط التالية (الشكل 3A):
    في بداية التسجيل (V 0)؛
    بعد إضافة نبض معايرة (V كال)؛
    بعد إضافة الجسيمات الشحمية (V يبو)؛
    في نهاية هروب رأس المال (V زعنفة)؛
    بعد إضافة المنظفات (V TOT)؛
    خط الأساس الفولتية بحيث V 0 = 0.
  3. استخدام معادلة نرنست-بلانك لتحديد القيمة التجريبية ل figure-protocol-2 عن طريق قياس
    figure-protocol-3
    حيث المجلد كال هو حجم نبض المعايرة في ميكرولتر، 1،800 وحجم الغرفة في بداية أعربت التجربة في1؛ ل، [الكلور] كال / في هم الكلور - تركيزات نبض المعايرة والمخزن المؤقت الخارجي في ملي وΔV كال هو قفزة في بالسيارات قياسها بعد نبض المعايرة.
    ملاحظة: هذا التحديد التجريبي للα يخدم ثلاثة أغراض: أنه يضمن أن النظام يستجيب بشكل صحيح، ويقدم مقياسا لاتساق استجابة الصك بين التجارب وكذلك للتأكد من أن تم إجراء أية أخطاء في صنع الحل.
  4. حساب تركيزات الكلور بعد كل خطوة على النحو التالي:
    figure-protocol-4
    figure-protocol-5
    figure-protocol-6
    عامل 3/400 يأتي من التخفيف من 15 ميكرولتر معايرة النبض في الحجم النهائي 2،000 ميكرولتر.
  5. CALCULيأكل من التغيرات في [الكلور] في كل خطوة، ΔCl يبو / الزعانف / طفل.
  6. تحويل V (ر) في الكلورين (ر) مع
    figure-protocol-7
    تحديد مباشرة [الكلور] القيم في النقاط الحرجة ومقارنتها مع القيم المحسوبة باعتبارها الرقابة الداخلية.
  7. تطبيع التتبع بحيث يبو الكلور يختلط = 0 و الكلور يختلط TOT = 1
    figure-protocol-8
  8. تناسب دوام هروب رأس المال إلى المعادلة التالية:
    figure-protocol-9
    حيث L هو معدل الكلور - تسرب أن يتم تحديد تجريبيا من خلال قياس الكلور - هروب رأس المال من الجسيمات الشحمية خالية من البروتين أعدت في نفس الظروف وτ هو ثابت وقت العملية.
  9. حساب الخامس، سرعة الأولية:
    حيث يتم التعبير عن ΔCl زعنفة في millimolar وV هو حجم الغرفة في ميكرولتر.
  10. حساب معدل النقل / تصرف
    figure-protocol-10
    حيث p هو P / L، MW هو الوزن الجزيئي للمجمع نشط أعرب في كيلو دالتون

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفنا بروتوكول مفصلة وقوية لقياس الكلور - النقل بوساطة النقى CLC-EC1، وبدائيات النواة من نوع CLC H + / CL - مبادل، تشكيلها في الجسيمات الشحمية. ويرد التمثيل التخطيطي للتجربة في الشكل 3 Proteoliposomes تشكيلها مع النقى CLC-EC1 والتي تحتوي على الكلور عالية الداخلي - مغمورة في محلول يحتوي على حمام منخفض الكلور -. في ظل هذه الظروف صافي الكلور - يتم منع هروب رأس المال من تراكم الشحنة الموجبة في الحويصلية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفناها بروتوكول مفصلة لقياس الكلور - النقل بوساطة قنوات أنيون انتقائية المنقى أو النقل تشكيلها في الجسيمات الشحمية. كان المثال المستخدم في بدائيات النواة H + / CL - مبادل CLC-EC1. ومع ذلك، فإن منهجية يمكن تكييفه بسهولة لدراسة قنوات بوابات بواسطة بروابط 12،13،15، 11،12 الجهد، أو الرياضية المختلفة الانتقائية أنيوني 15،16 بالاستعاضة عن حج: القطب أجكل مع واحد مناسب للأيون قيد النظر. أقطاب انتقائية لأيونات أخرى من الكلورين -<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل GM085232 منحة المعاهد الوطنية للصحة وجائزة Irma T. Hirschl / Monique Weill-Caulier Scholar (إلى AA.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Liposomicator ، Avanti Polar Lipids Inc.  شركة أفانتي بولر ليبيدز610200
IEC Centra CL2 BenchtopThermo Scientific
Orion Research Model 701A مقياسيمكن العثور عليها على موقع ئي باي.
الأس الهيدروجيني غير الوظيفيسيعمل أي مسبار لمقياس الأس الهيدروجيني بأسلاك فضية. يجب إزالة الطلاء الزجاجي / البلاستيكي وتنظيف الأسلاك.
DI-710 Data LoggerDATAQ أدوات
WinDAQ برامج الاستحواذDATAQ أدوات
ثقب أعمدة بلاستيكية يمكن التخلص منها ، تدفق الجاذبية ، 2 ملبيرس (علمي حراري)29922
أنابيب ثقافة KIMAX ، يمكن التخلص منها ، زجاج البورسليكاتKimble Chase73500-13100
مجموعة الطارد مع حامل / كتلةتسخينشركة أفانتي بولر ليبيدز610000
كمبيوتر
pH-mV الرقمي مسبار

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
  2. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
  3. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  4. Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
  5. Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
  6. Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
  7. Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
  8. Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
  9. Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
  10. Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
  11. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
  12. Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
  13. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367(2013).
  14. Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
  15. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
  16. Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
  17. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
  18. Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
  19. Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
  20. Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
  21. Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
  22. Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
  23. Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
  24. Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084(2013).
  25. Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7(2004).
  26. Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
  27. Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CLC ec1

مقالات ذات صلة