يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس منحنى الضغط الحجم في الرئتين ماوس

18.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52376

⸱

يناير 27, 2015

 ,  ,  , 
1Environmental Health Sciences, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا لقياس منحنى حجم ضغط الرئة في الفئران ببساطة وموثوقية ، مما يدل على أنه حساس بما فيه الكفاية للكشف عن التغيرات المتني المظهري في اثنين من أمراض الرئة الشائعة ، التليف الرئوي وانتفاخ الرئة. يوفر هذا المقياس وسيلة لتحديد التغيرات الهيكلية للرئة من خلال تطوير علم الأمراض.

الملخص

في العقود الأخيرة أصبح الماوس على نموذج حيواني الرئيسي لمجموعة متنوعة من أمراض الرئة. في نماذج من انتفاخ الرئة أو تليف، وأفضل طريقة لتقييم التغيرات المظهرية الأساسية من خلال قياس التغيرات في مرونة الرئة. لفهم أفضل آليات محددة الكامنة وراء مثل هذه الأمراض في الفئران، فمن الضروري إجراء قياسات الوظيفية التي يمكن أن تعكس علم الأمراض النامية. على الرغم من أن هناك العديد من الطرق لقياس مرونة، وطريقة الكلاسيكي هو أن من مجموع الرئة الضغط حجم (PV) منحنى القيام به خلال مجموعة كاملة من وحدات التخزين الرئة. أحرز هذا القياس على الرئتين الكبار من كل ما يقرب من أنواع الثدييات التي يعود تاريخها ما يقرب من 100 سنة، ولعب مثل هذه المنحنيات PV أيضا دورا كبيرا في اكتشاف وفهم وظيفة الفاعل بالسطح الرئوي في تطوير رئة الجنين. للأسف، لم يتم الإبلاغ عن مثل هذه الكلية منحنيات PV على نطاق واسع في الماوس، على الرغم من حقيقة أنها يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن macroscآثار OPIC من التغييرات الهيكلية في الرئة. وعلى الرغم من منحنيات PV جزئية فقط قياس التغيرات في حجم الرئة وذكرت أحيانا، من دون مقياس الحجم المطلق، وطبيعة غير الخطية من منحنى PV الكلي يجعل هذه منها جزئية من الصعب جدا تفسير. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة موحدة لقياس منحنى PV الكلي. لقد ثم اختبار قدرة هذه المنحنيات للكشف عن تغيرات في بنية الرئة الماوس في اثنين من أمراض الرئة شيوعا وانتفاخ الرئة والتليف. وأظهرت النتائج تغيرات كبيرة في العديد من المتغيرات بما يتفق مع التغييرات الهيكلية المتوقع مع هذه الأمراض. هذا قياس منحنى PV الرئة في الفئران مما يوفر وسيلة واضحة لمراقبة تطور التغيرات الفسيولوجية المرضية مع مرور الوقت والتأثير المحتمل للإجراءات العلاجية.

المقدمة

الماوس هو الآن نموذج حيواني الرئيسي لمجموعة متنوعة من أمراض الرئة. في نماذج من انتفاخ الرئة أو تليف، وأفضل طريقة لتقييم التغيرات المظهرية الأساسية عن طريق قياس التغيرات في مرونة الرئة. على الرغم من أن هناك العديد من الطرق لقياس مرونة، وطريقة الكلاسيكي هو أن من إجمالي حجم الضغط (PV) منحنى يقاس من حجم المتبقية (RV) لقدرة الرئة الكلية (TLC). أحرز هذا القياس على الرئتين الكبار من كل ما يقرب من أنواع الثدييات التي يعود تاريخها تقريبا 100 سنة 1-3. لعبت هذه المنحنيات PV أيضا دورا كبيرا في اكتشاف وفهم وظيفة الفاعل بالسطح الرئوي في تطوير رئة الجنين 4-7. وعلى الرغم من أهمية منحنى PV باعتبارها قياس النمط الظاهري الرئة، ولم يكن هناك طريقة موحدة لتنفيذ هذا القياس. وقد فعلت ذلك ببساطة عن طريق تضخيم ونزع فتيل الرئة مع خطوات منفصلة (تنتظر وقتا المتغير للموازنة بعد كل) أو مع المضخات التييمكن تضخيم مستمر وفرغ الرئة. ويتم ذلك غالبا منحنى PV على نطاق وحجم بين صفر وبعض قدرة الرئة تعريف المستخدم، ولكن كانت المدة الزمنية لكل حلقة حجم الضغوط التي أبلغ عنها مختبرات مختلفة متغير للغاية، تتراوح بين بضعة ثانية 8 إلى 2 ساعة. بعض المحققين تشير إلى هذا المنحنى إجمالي PV الرئة وثابت أو quasistatic، ولكن هذه هي الناحية النوعية التي تقدم نظرة قليلا، وأنها لا تستخدم هنا. وبالإضافة إلى ذلك، لم يتم الإبلاغ عن منحنى PV على نطاق واسع في الماوس، على الرغم من أنه يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن الآثار العيانية للتغيرات الهيكلية في الرئة.

وقد أدت العديد من القضايا في تقلب في PV اكتساب منحنى بما في ذلك: 1) معدل التضخم والانكماش. 2) الرحلات ضغط التضخم والانكماش. و3) الوسائل لتحديد وقياس حجم الرئة المطلق. في طريقة الحاضر هنا، بمعدل 3 مل / دقيقة تم اختياره باعتباره ترضويه، ويجري ليس قصيرة جدا لتعكس مرونة الديناميكية المرتبطة تهوية طبيعية وليس بطيئا جدا لجعل قياس غير عملي، خاصة عند دراسة الأفواج الكبيرة. منذ القدرة الإجمالية للرئة الاسمية في C57BL / 6 الماوس صحي هي بناء على أمر من 1.2 مل 9، هذا المعدل عادة سمحت لاثنين من كامل مغلقة PV حلقات ينبغي القيام به في حوالي 1.5 دقيقة.

في الأدب موسعة حيث تم الإبلاغ عن منحنيات PV، وضغط التضخم ذروة استخدامها كان المتغير للغاية، تتراوح بين ما يصل الى 20 لأكثر من 40 سم H 2 O. جزء من هذا التباين قد تكون ذات صلة إلى الأنواع، ولكن الهدف الأساسي من وضع حد الضغط العلوي لمنحنيات PV هو لتضخيم الرئة إلى سعتها الإجمالية الرئة (TLC)، أو حجم الرئة القصوى. يتم تعريف TLC في البشر من جهد طوعي القصوى يمكن للفرد جعل، ولكن للأسف هذا لا يمكن أبدا أن تتكرر في أي نموذج حيواني. وهكذا، فإن حجم القصوى في منحنيات PV التجريبية هو ردعالملغومة قبل الضغط القصوى ضبط تعسفي من قبل المحقق. والهدف هو وضع ضغوط حيث منحنى PV مسطح، ولكن للأسف الطرف التضخم منحنى PV الرئة الثدييات أبدا مسطح. لذلك وضعت معظم المحققين الضغط حيث يبدأ منحنى التضخم لشد بشكل كبير، وعادة 30 سم H 2 O. في الماوس، ومع ذلك، فإن منحنى PV هو أكثر تعقيدا مع سنام مرتين على أطرافهم التضخم، وأين هذا الطرف التضخم وغالبا ما زالت ترتفع بشكل حاد في 30 سم H 2 O 10، حتى 30 ليست نقطة نهاية جيدة لل منحنى PV. لهذا السبب، ونحن نستخدم 35 سم H 2 O كحد الضغط لمنحنى الماوس PV، وهو الضغط الذي أطرافه التضخم من جميع سلالات قمنا بفحص تبدأ لشد.

منذ منحنى PV نفسه هو غير الخطية للغاية، وظهور حلقة PV تعتمد على حجم من حيث يبدأ منحنى. بعض مراوح التجارية تسمح للمستخدمين القيام حلقات PV كبيرة، بدءا من FRC، ولكن إذا كان حجم FRC غير معروف ثم فإنه من المستحيل تفسير التغييرات في منحنى PV هذا مع أي علم الأمراض، حيث أن هذه التغييرات قد تؤدي ببساطة عن التغير في حجم ابتداء، وليس التعديلات الهيكلية في الرئة. هكذا دون قياس الحجم المطلق، والمنحنيات PV تكاد تكون مستحيلة لتفسير وبالتالي يكون فائدة تذكر. وعلى الرغم من ذلك، هناك العديد من الطرق لقياس حجم الرئة، وهذه غالبا ما تكون مرهقة وتتطلب معدات خاصة. في مقاربة بسيطة وصفها هنا، يبدأ منحنى PV في حجم الصفر بعد في الجسم الحي الإجراء التفريغ.

وباختصار، توضح هذه الورقة طريقة مباشرة لتوحيد PV الرئة قياس منحنى في الرئة الماوس، وتعرف عدة المقاييس التي يمكن أن تحسب من هذا المنحنى التي ترتبط بنية الرئة. وبالتالي يوفر منحنى PV اختبار وظيفة الرئة لديه التطبيق المباشر في القدرة على اكتشاف التغيرات الهيكلية المظهرية في الفئران مع بالاتصالاتعلى أمراض الرئة مثل انتفاخ الرئة وتليف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وافقت اللجنة رعاية واستخدام الحيوان جامعة جونز هوبكنز جميع البروتوكولات الحيوان.

1. معدات

يتم عرض نظام مركب اقامة، وعلى استعداد لقياس منحنى PV في الشكل 1.

  1. قياس حجم:
    1. توليد معدل ثابت من التضخم والانكماش باستخدام ضخ حقنة مع التحول التي تسمح للمستخدم لعكس بسرعة المضخة بعد وصوله الى حدود الضغط. لمنحنيات الماوس PV، استخدم جدا مدهون خفيفا 5 مل حقنة زجاجية مع حجم الأولي (قبل التضخم) وضعت في 3 مل من الهواء. 3 مل هي كبيرة بما فيه الكفاية لقياس حجم في منحنيات الماوس PV تقريبا.
    2. قياس حجم ألقاها المضخة عن طريق ربط محول التفاضلية الخطية إلى السكن مضخة، مع قضيب صغير استشعار متصلة تتحرك حقنة الغطاس.
      ملاحظة: وهناك وسيلة تجريبية لتصحيح ضغط الغاز في نظام يوصف تحت مكعب PVRVE تسجيل القسم.
  2. قياس الضغط:
    1. استخدام معيار قياس الضغط غير مكلفة مع مجموعة من 0-60 سم H 2 O (0-1 PSI).
  3. تسجيل القياس:
    1. لتسجيل منحنى PV استخدام أي مسجل رقمي مع قدرات XY (على سبيل المثال، PowerLab). تعيين قناة واحدة لتسجيل إشارة حجم تصحيح وقناة أخرى لتسجيل الضغط transpulmonary (PTP)، من أجل رسم بياني لمنحنى PV. استخدام المضخم الجسر الذي يربط إلى Powerlab الرئيسي لقياس الضغط. معايرة قناة ضغط 0-40 سم H 2 O، ومعايرة قناة حجم 0-3 مل.

2. تصحيح لضغط الغاز

ملاحظة: هذا هو الخطوة الأولى الحاسمة في إعداد، منذ كلما زاد الضغط، وانخفاض حجم الغاز، وبالتالي فإن حجم الهواء تسليمها إلى الماوس سيكون أقل على نحو متزايد من تهجير SYRإنجي برميل.

  1. إغلاق محبس الذي سيربط النظام PV إلى الرئتين، لذلك لا غاز يمكن ترك النظام. بدء ضخ ومراقبة إذا كانت قناة حجم تصحيح على مسجل معارض أية تغييرات يمكن قياسها كما يزيد الضغط إلى حوالي 40 سم H 2 O. إذا كان الأمر كذلك، ثم صحيحة كما في الخطوات التالية.
    1. الصحيح لضغط الغاز تجريبيا من خلال طرح من قياس المكبس التشريد (أي حجم دون تصحيح) مصطلح يتناسب مع ضغط التضخم. القيام بذلك على قناة Powerlab (وتسمى اتفاقية فيينا) لإظهار إشارة حجم ناقص مرات معامل الضغط.
    2. تحديد معامل في المعادلة. أولا، وجعل تخمين الأولي، وتحويل الرسم البياني على تسجيل، والبدء في المضخة. منذ وختم الأنبوب التضخم، وضبط مضاعف معامل الضغط لجعل القناة الرأسمالي قراءة الصفر مع ارتفاع ضغط 0-40 سم H 2 O. إذا كان يذهب صعودا أو هبوطا، ببساطة ضبط عامل التصحيح حتىيبقى شقة على هذا النطاق الضغط. وهذا عامل التصحيح يكون دائما هو نفسه، وإذا كان نفس 3 مل بدءا حجم في المحقنة لا يتم تغيير.

3. الاختبارات التجريبية في الفئران

  1. إجراءات لقياس منحنى PV في الفئران. وتمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان جامعة جونز هوبكنز.
    1. تخدير الفئران (C57BL / 6 الفئران في 6-12 أسابيع من العمر) مع الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (15 ملغ / كلغ)، وتأكيد التخدير بسبب عدم وجود حركة لا ارادي.
      ملاحظة: منحنى PV يمكن أن تكتمل في الفئران تخدير في أقل من 10 دقيقة و هو إجراء نهائي.
    2. يفغر الرغامى الفئران مع 18 G كعب إبرة قنية. القيام بذلك عن طريق شق صغير في الجلد المغطي القصبة الهوائية، وتحديد مكان القصبة الهوائية، ثم جعل شق صغير في القصبة الهوائية، حيث يمكن إدخال إبرة كعب. تأمين قنية من خلال ربط مع الموضوع.
    3. السماح للفئران على التنفس 100٪ أكسجين لمدة 4 دقائق على الأقل. هذا يمكن أن يكون عن طريق التنفس من تلقاء أنفسهم من كيس أو مع جهاز التنفس الصناعي تحديد أبعاده مع حجم المد والجزر من 0.2 مل في 150 الأنفاس / دقيقة.
    4. إغلاق قنية القصبة الهوائية والسماح 3-4 دقيقة للماوس على استيعاب جميع الأكسجين. أسفر هذا الإجراء امتصاص الأكسجين وفاة الحيوانات وفي التفريغ الكامل تقريبا في الرئة 11. تأكيد وفاة الماوس عن طريق قياس وقف ضربات القلب مع أقطاب ECG أو الملاحظة المباشرة.
    5. وبمجرد أن التفريغ في الرئة كاملة وحجم الرئة هي صفر، والبدء تضخيم الرئة مع هواء الغرفة في ضخ حقنة بمعدل 3 مل / دقيقة. مراقبة أثر الضغط على مسجل رقمي، وعندما يصل إلى 35 سم H 2 O، عكس المضخة.
    6. اتبع منحنى الانكماش حتى يصل الضغط السلبي 10 سم H 2 O، وهو الوقت الذي انهارت الشعب الهوائية، محاصرة الهواء في الحويصلات الهوائية منع المزيد من الحد من حجم. عكس فورا رانه ضخ مرة أخرى، والسماح للرئة لreinflate كما فتح الشعب الهوائية انهارت. هذا الانفتاح غير متجانسة واضح عادة صاخبة تبحث الطرف التضخم في الجزء الأول من هذا التضخم 2.
    7. عندما تصل الضغط مرة أخرى 35 سم H 2 O، عكس اتجاه المضخة، والاستمرار في انكماش الرئة حتى يصل هذا الطرف الانكماش 2 0 سم H 2 O. ثم توقف المضخة.
    8. عرض السجل PowerLab الرسم البياني من الضغط والتدفق ومنحنى PV. ثم تحليل منحنى PV للكشف عن التغيرات المظهرية في حمة الرئة التي تحدث مع أمراض الرئة المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

على الرغم من أن الإجراء لمنحنيات PV هو موضح في الفيديو فقط للسيطرة على الفئران صحية، درسنا قدرة منحنى PV للكشف عن تغيرات وظيفية ومرضية في الفئران مع اثنين من الأمراض المشتركة مختلفة، وانتفاخ الرئة وتليف. تفاصيل هذه النماذج التقليدية وصفت في أماكن أخرى 12،13. باختصار شديد، بعد التخدير مع 3٪ الأيزوفلورين ان سبب انتفاخ الرئة بنسبة 3 أو 6 U إيلاستاز البنكرياس الخنازير تغرس في القصبة الهوائية ودرس في وقت لاحق 3 أسابيع، وكان سبب التليف بنسبة 0.05 U بليوميسين تغرس في القصبة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الورقة وقد وصفت طريقة استنساخه واضحة لقياس في الفئران طريقة الكلاسيكي للمرونة phenotyping الرئة، منحنى إجمالي PV الرئة. وكانت مثل هذه المنحنيات دور فعال في اكتشاف الفاعل بالسطح الرئوي وأهميته في توفير الاستقرار الرئة. ومن هنا يظهر كيف أن منحنى PV مفيد أيضا في توفير وسيلة لقياس العديد من المتغيرات المتعلقة مرونة الرئة في الرئتين الماوس الكبار. كانت هناك تغييرات كبيرة جدا في جميع المتغيرات في نموذجين الماوس تستخدم عادة لتوليد تغيرات مرضية في الماوس الرئتين. القسم التالي يناقش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أي من المؤلفين أي مصالح مالية من شأنها أن تتعارض مع المواد المعروضة في هذه الورقة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بواسطة NIH HL-1034.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مضخة حقنةهارفارد جهاز55-2226حقنة بحقن / سحب
مضخة 22 مفتاح عكسيهارفارد552217متضمن مع مضخة
محول الإزاحة الخطيةTrans-Tek، Inc.0244-0000
5 مل حقنة زجاجيةبيكتون ديكنسونالعديد من البائعين المحتملين الآخرين
مسجل رقميADInstrumentsPL3504العديد من البائعين المحتملين الآخرين
مكيف إشارة أمبير الجسرADInstrumentsخزان الغاز FE221
، 100٪ أكسجينAirgas، Incسيعمل
أي مورد أو مصدر مستشفىمحول الضغط: 0-1 رطل لكل بوصة مربعة & nbsp ؛ خرج مللي فولتأوميغا الهندسيةPX-137النطاق &asymp ؛ 0 - 60 سم H2< / sub>O
مضخة جهاز

المراجع

  1. Neergaard, K. v Neue Auffasungen über einn Grundbergriff der Atemtechnik. Die Retraktionskraft der unge, abhangig von den Oberflachenspannung in den Alveolen. (New interpretations of basic concepts of respiratory mechanics. Correlation of pulmonary recoil force with surface tension in the alveoli.). Zeitschrift Fur Gesamte Experi Medizin. 66, 373-394 (1929).
  2. Hildebrandt, J. Pressure-volume data of cat lung interpreted by a plastoelastic, linear viscoelastic model. J. Appl. Physiol. 28, 365-372 (1970).
  3. West, J. B. Bioengineering Aspects of the Lung. , Marcel Dekker. New York, NY. 83-162 (1977).
  4. Avery, M. E., Mead, J. Surface properties in relation to atelectasis and hyaline membrane disease). AMA. J. Dis. Child. 97, 517-523 (1959).
  5. Clements, J. A., Hustead, R. F., Johnson, R. P., Gribetz, I. Pulmonary surface tension and alveolar stability. Tech Rep CRDLR US Army Chem. Res. Dev. Lab. 3052, 1-24 (1961).
  6. Radford, E. P. Tissue Elasticity. Remington, J. W. , American Physiological Society. Bethesda, MD. 177-190 (1957).
  7. Mitzner, W., Johnson, J. W. C., Scott, R., London, W. T., Palmer, A. E. Effect of betamethasone on the pressure-volume relationship of fetal rhesus monkey lung. Journal of Applied Physiology. 47, 377-382 (1979).
  8. Smaldone, G. C., Mitzner, W., Itoh, H. The role of alveolar recruitment in lung inflation: Influence on pressure-volume hysteresis. Journal of Applied Physiology. 55, 1321-1332 (1983).
  9. Tankersley, C. G., Rabold, R., Mitzner, W. Differential lung mechanics are genetically determined in inbred murine strains. Journal of Applied Physiology. 86, 1764-1769 (1999).
  10. Soutiere, S. E., Mitzner, W. On defining total lung capacity in the mouse. J. Appl. Physiol. 96, 1658-1664 (2004).
  11. Stengel, P. W., Frazer, D. G., Weber, K. C. Lung degassing: an evaluation of two methods. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48, 370-375 (1980).
  12. Limjunyawong, N., Mitzner, W., Horton, M. A mouse model of chronic idiopathic pulmonary fibrosis. Physiol Rep. 2, e00249(2014).
  13. Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J. Appl. Physiol. 110, 1455-1459 (2011).
  14. Brown, R. H., et al. The structural basis of airways hyperresponsiveness in asthma. J. Appl. Physiol. 101 (1), 30-39 (2006).
  15. Smargiassi, A., et al. Ultrasonographic Assessment of the Diaphragm in Chronic Obstructive Pulmonary Disease Patients: Relationships with Pulmonary Function and the Influence of Body Composition - A Pilot Study. Respiration: International Review of Thoracic Diseases. 87 (5), 364-371 (2014).
  16. Mitzner, W. Airway-parenchymal interdependence. Comprehensive Physiol. 2, 1921-1935 (2012).
  17. Johnson, J. W., Permutt, S., Sipple, J. H., Salem, E. S. Effect of Intra-Alveolar Fluid on Pulmonary Surface Tension Properties. J. Appl. Physiol. 19, 769-777 (1964).
  18. Palmer, S., Morgan, T. E., Prueitt, J. L., Murphy, J. H., Hodson, W. A. Lung development in the fetal primate, Macaca nemestrina. II. Pressure-volume and phospholipid changes. Pediatr. Res. 11, 1057-1063 (1977).
  19. Lum, H., Mitzner, W. A species comparisonof alveolar size and surface forces. Journal of Applied Physiology. 62, 1865-1871 (1987).
  20. Faridy, E. E. Effect of distension on release of surfactant in excised dogs' lungs. Respir. Physiol. 27, 99-114 (1976).
  21. Faridy, E. E., Permutt, S., Riley, R. L. Effect of ventilation on surface forces in excised dogs' lungs. J. Appl. Physiol. 21, 1453-1462 (1966).
  22. Comroe, J. H., Forster, R. E., Dubois, A. B., Briscoe, W. A., Carlsen, E. The Lung: Clinical Physiology and Pulmonary Function Tests. , Year Book Medical Publishers, Inc. New York, NY. (1962).
  23. Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann. Intern. Med. 142, 963-967 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

رئة الفأرمرونة الرئةمضخة حقنةضغط الغازضغط الممرات الهوائيةمطاوعة الرئةنموذج انتفاخ الرئةنموذج التليفنفخ الرئة
قياس منحنى الضغط الحجم في الرئتين ماوس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.