مقالة منهجية

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

DOI:

10.3791/52392

⸱

ديسمبر 6, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, 2Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, 3Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, 4Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول التفكك السريع غير الأنزيمي لشظايا الأنسجة البشرية الطازجة للتقييم النوعي والكمي لخلايا CD45 + (الخلايا الليمفاوية / الكريات البيض) الموجودة في مختلف الأنسجة البشرية الطبيعية والخبيثة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن جمع المادة الطافية التي تم الحصول عليها من تجانس الأنسجة الأولية وتخزينها لمزيد من التحليل أو التجريب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم قبول قدرة الخلايا الخبيثة للتهرب من الجهاز المناعي، ويتميز ورم الهروب من كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، والآن باعتبارها السمة المميزة مهمة من السرطان. أبحاثنا حول سرطان الثدي يركز على الدور الفعال الذي تلعبه الورم تسلل الخلايا الليمفاوية في تطور الورم ونتائج المرضى. لتحقيق هذا الهدف، وضعنا منهجية لعزل السريع للخلايا اللمفاوية سليمة من الأنسجة العادية وغير العادية في محاولة لتقييمها الداني إلى حالتها الأصلية. الخليط أعدت باستخدام عرض dissociator الميكانيكية على حد سواء زيادة سلامة وخلية الانتعاش مع الحفاظ على مستقبلات سطح التعبير مقارنة الأنسجة هضمها انزيم ل. وعلاوة على ذلك، لم الهضم الأنزيمي من المواد غير القابلة للذوبان المتبقية لا يتعافى CD45 + خلايا إضافية تشير إلى أن القياسات الكمية والنوعية في جناسة الأساسي من المرجح أن تعكس بصدق تسلل مجموعات سكانية فرعية في fragm الأنسجةوالأنف والحنجرة. الخلايا اللمفاوية في هذه الخليط يمكن أن يكون بسهولة تتميز باستخدام المناعية (النمط الظاهري، والانتشار، وغيرها) أو الجزيئية (DNA، RNA و / أو البروتين) النهج. ويمكن أيضا خلايا CD45 + أن تستخدم لتنقية حيوانية، والتوسع في المختبر أو الحفظ بالتبريد. فائدة إضافية لهذا النهج هو أن طاف النسيج الأساسي من الخليط يمكن استخدامها لتوصيف ومقارنة السيتوكينات، كيموكينات، والمناعية المستضدات الموجودة في الأنسجة الطبيعية والخبيثة. وينبغي لهذه الوظائف البروتوكول بشكل جيد للغاية لأنسجة الثدي الإنسان وتكون قابلة للتطبيق لمجموعة واسعة من أنسجة طبيعية وغير طبيعية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون البيئة المكروية للورم من أنواع مختلفة من الخلايا مع العديد من الدراسات التي تظهر أن كل منها يلعب أدوارا مميزة ومهمة في تكوين الأورام1،2. وتشمل هذه ، على سبيل المثال لا الحصر ، تسلل الخلايا المناعية والخلايا اللحمية والخلايا البطانية والخلاياالسرطانية 3. دراسات خارج الجسم الحي للخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TIL; أصبحت خلايا CD45 + أو الكريات البيض ، والتي هي في الغالب خلايا ليمفاوية في أورام الثدي) من عينات الأنسجة البشرية الطازجة صعبة بسبب تواترها المنخفض ، وأحجام العينات الصغيرة المتاحة غالبا للبحث وإمكانية فقدان الجدوى أثناء الاستخراج. نظرا لأن الخلايا المناعية التي تتسلل إلى الأورام عادة ما تكون موجودة كركاب بدلا من المقيمين الدائمين بشكل عام ، فمن الأسهل إطلاقها من مصفوفة الأنسجة.

يعد فصل أنسجة الورم مع الحفاظ على سلامة الخلايا أمرا صعبا من الناحية الفنية وقد تم إجراؤه تقليديا باستخدام مجموعة من الخطوات الميكانيكية والأنزيمية لإعداد معلقات الخلية المفردة4-8. يتضمن هذا النهج فترات حضانة طويلة ويرتبط بانخفاض كبير في صلاحية الخلية بالإضافة إلى فقدان مستقبلات سطح الخلية عن طريق الانقسام الأنزيمي. يصعب تحقيق دراسات قياس التدفق الخلوي عالية الجودة التي تميز TIL في البيئة المكروية للورم بالإضافة إلى التنقية النظيفة للمجموعات السكانية الفرعية CD45 + عن طريق قياس التدفق الخلوي أو الخرز المطلي بالأجسام المضادة من أنسجة الورم المهضومة بالإنزيم. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المادة الطافية (SN) من تجانس الورم الناتج غير قابلة لمزيد من التحليل بما في ذلك القياس الكمي للبروتينات المفرزة (السيتوكينات أو الكيموكينات أو الغلوبولين المناعي أو مستضدات الورم) أو العلاج التجريبي للخلايا الطبيعية ، بسبب احتمالية تدهور البروتين في الهضم الأنزيمي.

في بحثنا عن طريقة لتحضير تجانس خلية واحدة من أنسجة الثدي [بما في ذلك أنسجة الثدي الورمية غير المجاورة (NANT) وأنسجة الثدي الطبيعية (من تصغير الثدي) بدون هضم إنزيمي ، اختبرنا مجموعة متنوعة من تقنيات التجانس الميكانيكي. زادت المتجانسات المحضرة باستخدام مفكك ميكانيكي من قابلية الخلية للحياة (2 ضعفا) والتعافي الكلي للخلية (2 ضعفا) مع الحفاظ على تعبير المستقبلات السطحية. لم يستعيد الهضم الأنزيمي للمادة المتبقية غير القابلة للذوبان خلايا CD45 + الإضافية مما يشير إلى أنها تم إطلاقها جميعا في التجانس الأولي. وبالتالي ، فإن هذا النهج السريع والبسيط يسمح بالتقييم النوعي والكمي للمجموعات السكانية الفرعية CD45 + الموجودة في مختلف الأنسجة البشرية الطبيعية والخبيثة. ميزة إضافية لهذا النهج هي أنه يمكن جمع SN من المتجانس الأولي (SN للأنسجة الأولية) وتخزينه لمزيد من التحليل أو التجريب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم الحصول على جميع العينات باستخدام بروتوكول افقت عليها لجنة الأخلاقيات الطبية من معهد جول بورديه مع الموافقة المسبقة الخطية التي تم الحصول عليها من كل مريض.

1. إعداد جناسة الأنسجة

  1. تشريح الأنسجة مقطوعة (الأنسجة الخبيثة وطبيعية مقطوعة من غرفة العمليات) هي في مختبر علم الأمراض من قبل موظفين مدربين لبيك اب فوري. الورم، NANT (تؤخذ هذه المسافة ابعد من الورم ممكن) وتتم معالجة شظايا الأنسجة الطبيعية بشكل روتيني ضمن 1 - 3 ساعة من الاستئصال الجراحي في مختبر BSL2 باستخدام إجراءات موحدة لالأنسجة البشرية السلامة الأحيائية. ويتضح مخطط تدفق بروتوكول في الشكل 1.
  2. تزن كل أجزاء الأنسجة (عادي، NANT وورم) وقياس الطول والعرض، والارتفاع (الطول × العرض × الارتفاع). هذا هو خطوة هامة لتطبيع احق من القطعان الخلية، والحمض النووي الريبي المستخرج، الخ
    NOTE: مجموعة من حجم العينة هو 100 إلى 10،000 مم 3 مع عدم وجود الدهون إذا أمكن ذلك.
  3. بصمة جزء الورم على شريحة زجاجية لH & E تلطيخ للتحقق من أن الأنسجة هي في الواقع جزء من الورم.
    1. القيام بذلك عن طريق الضغط على المجهر شريحة زجاجية على جزء الورم وتطبيق ضغط لطيف مع أصابعك لبضع ثوان.
    2. إصلاح الشريحة مع الأيزوبروبانول لمدة 2 دقيقة تليها خطوة الغسيل في الماء. مباين الأنسجة لمدة 30 ثانية مع الهيماتوكسيلين ماير.
    3. غسل الشريحة في ستة حمامات من الماء. وصمة عار في فلوكسين B 2٪ لمدة 15 ثانية.
    4. يغسل في حمام من الماء تليها أربع حمامات الأيزوبروبانول والنهاية مع حمام واحد من الماء.
    5. احتضان في الأيزوبروبانول لمدة 1 دقيقة، واستنزاف. واضح في اثنين من حمامات الزيلين.
    6. جبل مع الزيلين مقرها المتوسطة المتزايدة. دراسة لالخلوية الورم (الشكل 2).
      ملاحظة: في المقام الأول، وخلايا الورم العصا إلى الشريحة مطبوع - واللحمية، اللمفاوية أو إعلاننادرا ما تبقى ipose خلايا، وترك فراغات بين الخلايا السرطانية (الشكل 2).
  4. وضع جزء الأنسجة في طبق ثقافة صغير يحتوي على 1 مل من يعرف كيميائيا، وخالية من مصل المتوسطة خلية المكونة للدم (المشار إليها فيما يلي باسم المتوسطة) في درجة حرارة الغرفة والزهر ذلك الى قطع صغيرة (~ 1 - 2 مم 2) باستخدام العقيمة مشرط.
  5. نقل كل شيء (شظايا الأنسجة + متوسطة) إلى الميكانيكي أنبوب dissociator C.
  6. شطف طبق بيتري ومشرط مع 2 مل من المتوسط ​​باستخدام ماصة باستور وإضافة ذلك إلى C أنبوب (حجم متوسط ​​لتفارق = 3 مل).
  7. استخدام A.01 برنامج dissociator الميكانيكية للأنابيب C (البرنامج الأكثر لطيف) إلى التجانس شظايا الأنسجة في تعليق خلية واحدة. وضع أنبوب C في الجهاز وتشغيل البرنامج مرتين على التوالي (دورة واحدة = 25 ثانية).
    ملاحظة: تم إنشاء هذا الإجراء التجانس والتحقق من صحتها لنسيج الثدي الإنسان، توم أخرىأو الأنسجة أو أنواع قد تحتاج إلى استخدام برنامج مختلف، وينبغي أن يتم اختبارها أولا.
  8. إزالة أنبوب C من أجهزة وصب جناسة مباشرة الى مصفاة الخلية 40 ميكرومتر جالسا على أنبوب 50 مل. باستخدام نفس ماصة باستور كما في الخطوة 1.6، ونقل أي السائل المتبقي في الأنبوب C إلى مصفاة الخلية.
  9. نقل السائل المصفى في أنبوب 15 مل باستخدام 1 مل ممص مكروى طرف. مؤقتا حفاظ على مصفاة الخلية وأنبوب 50 مل به.
  10. شطف أنبوب C مع 3 مل إضافية متوسطة ونقل هذا، مرة أخرى باستخدام نفس ماصة باستور كما في الخطوة 1.6، إلى مصفاة الخلية لا يزال جالسا على أنبوب 50 مل. يسجل أكبر قدر ممكن من السائل المتبقي المحاصرين في الأنسجة unhomogenized في أنبوب 50 مل عن طريق تحريك برفق حول مصفاة مع ماصة باستور نظيفة أو 1 مل غيض أن يتم طرح بعد ذلك بعيدا لتجنب تلويث شطافة.
  11. وضع مصفاة الخلية رأسا على عقب على رانه أنبوب C الأصلي وشطف مع 3 مل من المتوسط ​​بحيث تنخفض الأنسجة unhomogenized مرة أخرى في أنبوب C.
  12. إعادة التجانس كما في الخطوة 1.7 لدورتين للبرنامج A.01.
  13. صب هذا جناسة الثاني من خلال مصفاة الخلية يجلس على أنبوب 50 مل، وشطف أنبوب C مرة أخرى مع 3 مل المتوسطة (كما في الخطوة 1.10) ونقل مع ماصة باستور لمصفاة الخلية يجلس على أنبوب 50 مل الضغط مرة أخرى كحد أقصى كمية السائل من النسيج الضام المتبقية المحاصرين في مصفاة الخلية.
  14. في هذه المرحلة، وبلغ حجم التداول ~ 2.5 مل في أنبوب 15 مل و~ 9 مل في أنبوب 50 مل.

2. فصل طاف الأنسجة والخلايا

  1. الطرد المركزي الخليط في 15 مل و 50 مل أنابيب لمدة 15 دقيقة في 600 XG في درجة حرارة الغرفة.
  2. صب SN من أنبوب 15 مل في أنبوب نظيفة وتخزين مؤقتا في 4 درجات مئوية. هذا طاف = الورم الرئيسي، NANT أو منظمة الشفافية الدولية العاديةوأوضح ssue SN (الحجم النهائي 2.5 مل) في وقت لاحق وaliquoted قبل التخزين في -80 درجة مئوية لمدة التحليلات المستقبلية (انظر أدناه).
  3. تجاهل طاف من أنبوب 50 مل.
  4. و resuspend بلطف كل من الكريات خلية في الحجم النهائي من 1 مل المتوسطة. لفترة وجيزة، أولا كسر بلطف بيليه الخلية في كل من أنابيب (من خلال الاستفادة من أنبوب على سطح صلب). resuspend الكرية خلية فضفاض في 50 مل مع 500 ميكرولتر من المتوسطة ونقل هذا التعليق الخلية في أنبوب 15 مل ل resuspend بيليه الثاني. كرر هذه الخطوة مرة واحدة مع الثانية 500 ميكرولتر من المتوسطة لاسترداد الحد الأقصى من الخلايا.
  5. نقل 10 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أنبوب صغير، مع مزيج 10 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان (التخفيف 1: 1) وحساب عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات.
    ملاحظة: عند هذه النقطة جزء من تعليق الخلية كما يمكن تحليلها من قبل التدفق الخلوي لتقييم حجم الخلية، تحبب وإذا رغبت في عدد محدود من علامات حيوانية لمزيد من PRECتقييم ايسي لتوزيع الخلية النسبي في جناسة قبل تحليل مستفيض أو التجريب. كل التحليلات التي التدفق الخلوي تتضمن وضع العلامات CD45 للتطبيع المجموعات السكانية الفرعية.
  6. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلايا من الورم، NANT، أو الأنسجة الطبيعية جاهزة الآن لمزيد من التنقية أو التحليل. هذه الخطوات الإضافية هي أفضل عندما تجرى على نفس يوم الجراحة.
    ملاحظة: للحصول على تحليل تدفق cytometric ولكن ليس الفرز الخلية خلايا الدم الحمراء المتبقية يجب هي lysed بعد وضع العلامات الأجسام المضادة عن طريق إضافة 0.4 مل من الدم الحمراء العازلة تحلل الخلية إلى خلية بيليه، vortexing لالفور ل1 ثانية واحتضان ما لا يقل عن 10 دقيقة في غرفة درجة الحرارة (محمية من الضوء) قبل التحليل.

3. توضيح طاف الأنسجة

  1. الطرد المركزي 1.5 مل أنابيب مع SN الأنسجة في 15،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  2. إزالة بعناية رانه طاف دون لمس أو إزعاج بيليه. نقل إلى أنبوب نظيفة (أو أنابيب) تبعا لعدد وحجم مأخوذة المطلوب.
  3. تخزين طاف في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

4. الدم المرضى

  1. جمع عينة الدم من كل مريض كعنصر تحكم من قبل بزل الوريد إلى أنابيب heparinized اليوم قبل الجراحة. أجهزة الطرد المركزي الدم في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في 20 درجة مئوية مع قبالة الفرامل للحصول على البلازما ومعطف الشهباء.
  2. إزالة البلازما وتوضيح ذلك بواسطة الطرد المركزي عند 10،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية. قسامة وتخزين البلازما في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. تمييع معطف الشهباء في المتوسط
  3. فصل الخلايا وحيدة النواة باستخدام معيار-ficoll hypaque التدرج الطرد المركزي قبل التحليل الفوري، حيوانية العزلة، DNA / RNA / استخراج البروتين أو الحفظ بالتبريد.

5. التدفق الخلوي

  1. خلايا التسمية وفقا لتصنيعتعليمات آر في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء. ليز خلايا الدم الحمراء في تعليق خلية من شظايا الأنسجة بعد وضع العلامات الأجسام المضادة عن طريق إضافة 0.4 مل من خلية تحلل العازلة لبيليه الخلية.
  2. دوامة فورا ل1 ثانية واحتضان ما لا يقل عن 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. تمرير الخلايا المسمى في تدفق عداد الكريات للحصول على البيانات دون غسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهضم الأنزيمي من شظايا الأنسجة مع أي من الحلول المتاحة تجاريا تفارق الأنسجة أو مخاليط مختبر مختلفة من كولاجيناز، الدناز و / أو مثبطات هيالورونيداز، يلتصق مجموعة واسعة من المستقبلات على سطح الخلايا. لدينا دراسات، ركزت في البداية على خلايا CD4 + T التسلل أورام الثدي، وعرضت بسرعة مع مشكلة فنية كبيرة بسبب انشقاق مستقبلات CD4 السطح باستخدام الأنزيمية القياسية البروتوكولات الهضم 4-8. نحن اختبار مجموعة متنوعة من الإنزيمات كولاجيناز مع أو بدون الدناز ومثبطات هيالورو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الدراسة طريقة الأمثل لإعداد السريع من الخليط أنسجة الثدي العادية والخبيثة دون الهضم الأنزيمي للفرز لاحق الخلية، والاستخراج، والحفظ بالتبريد و / أو تحليل المظهري من CD45 + القطعان. والهدف من هذا النهج التجريبي لإنتاج صور للسمسم التي تعكس بشكل وثيق دولتهم في الجسم الحي ومقارنتها مع الأنسجة الطبيعية مع التلاعب الحد الأدنى للأنسجة جديدة من غرفة العمليات. حتى الآن، وقد مختبرنا تستخدم هذا البروتوكول لتحليل> 250 قبل الميلاد الأنسجة الطازجة (الورم وNANT)،&g...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان مدعوما من المنح هذا العمل fromthe صندوق البلجيكي للبحوث العلمية (FNRS)، LES AMIS DE L'معهد بورديه، FNRS في العملية Télévie، سرطان خطة بلجيكا، فون مبو]-Marteaux، فون JC Heuson وفون برسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
GentleMacs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235BD Medimachine هو جهاز طرد مركزي مكافئ إلى حد ما
5810 REppendorfأو أجهزة طرد مركزي قياسية أخرى على سطح الطاولة
طرد مركزي 5417 REppendorfأو غيرها من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة
Esco Class II A2 BioSafety CabinetESCO العالميةأو غيرها من الشفاط
BSL2 القياسيمجهر مقلوبنيكون كسوف TS100أو مجهر آخر متوافق مع مقياس الدم
B & uuml; غرفة rkerMarienfield 640210أو مقياس الدم القياسي الآخر
Navios Flow CellularBeckman Coulterأو مقياس التدفق الخلوي الآخر (يوصى ب 8-10 ألوان)
GentleMacs C-TubeMiltenyi Biotec130-096-344BD Medimachine يستخدم Filcon
Cell Culture DishSarstedt72،710أو غيرها من الأواني البلاستيكية غير النارية
مشرط يمكن التخلص منهSwann-Morton0510أو مشرط معقم قياسي للاستخدام الفردي
BD Cell Strainer 40 & micro ؛ مBecton Dickinson734-0002أو غيرها من الأواني البلاستيكية غير النارية
BD Falcon Tube 50 ملBecton Dickinson352070أو غيرها من الأواني البلاستيكية غير النارية
BD Falcon Tube 15 ملBecton Dickinson352097أو غيرها من الأواني البلاستيكية غير النارية
BD FACS Tube 5 ملBecton Dickinson352008أو غيرها من الأواني البلاستيكية غير
Sterile Pasteur ماصة 5 ملVWR612-1685أو غيرها من الأواني البلاستيكية غير النارية
أنبوب الطرد الدقيق 1.5 ملEppendorf7805-00أو غيرها من الأواني البلاستيكية غير النارية
X-Vivo 20LonzaBE04-448Qوسيط خال من المصل موصى به
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتLonzaBE17-516Fقياسي فسيولوجي PBS
Trypan أزرقVWR17942Eأو وصمة عار حيوية أخرى
VersaLyseBeckman CoulterA09777لتجارب قياس التدفق
الخلوي قابلية للإصلاح Dye eFluor 780eBioscience65-0865-14لتجارب قياس التدفق الخلوي
anti-CD3 FITCBD Biosciences345763لتجارب قياس التدفق الخلوي
anti-CD3 Vio BlueMiltenyi Biotec130-094-363لتجارب
قياس التدفق الخلوي345769 مضاد ل CD4 PEBD Biosciencesلتجارب قياس التدفق الخلوي مضاد
ل CD4 APCMiltenyi Biotec130-091-232لتجارب قياس التدفق الخلوي مضاد
ل CD8 ECD737659 بيكمان كولترلتجارب قياس التدفق الخلوي
345774CD8 PerCPBD Biosciencesلتجارب قياس التدفق الخلوي
المضادة ل CD19 APC-Vio770Miltenyi Biotec130-096-643لتجارب قياس التدفق الخلوي
anti-CD45 VioGreenMiltenyi Biotec130-096-906لتجارب قياس التدفق الخلوي
جهاز النارية لتجارب قياس التدفق الخلوي مضادة ل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  4. Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
  5. Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
  6. McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
  7. Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
  8. Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
  9. Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  10. Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).
  11. Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18(2014).
  12. Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).
  13. Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
  14. Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229(2012).
  15. Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Tissue HomogenizationMechanical DissociationLymphocyte IsolationFlow CytometryCell ViabilityCD45 Positive CellsTissue SupernatantCytokine AnalysisBreast TissueCell Recovery

مقالات ذات صلة