Method Article

شعاعي التنقل والسامة للخلايا وظيفة من فيروسات الرجعية تكرار ناقل Transduced، غير ملتصقة Alloresponsive T اللمفاويات

DOI:

10.3791/52416

⸱

February 11th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, UCLA David Geffen School of Medicine, 2Department of Molecular and Medical Pharmacology, UCLA David Geffen School of Medicine, 3Department of Medicine, UCLA David Geffen School of Medicine, 4Brain Research Institute, UCLA David Geffen School of Medicine, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, UCLA David Geffen School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا لمراقبة الحركة الشعاعية للخلايا المناعية غير الملتصقة في المختبر باستخدام جهاز مشعب / شريحة ترسيب الخلية. يتم تتبع هجرة الخلايا على طبقات أحادية من الخلايا السرطانية أو على بروتينات المصفوفة خارج الخلية. يسمح الفحص عن طريق الفحص المجهري بالضوء والفلورة بمراقبة حركة الخلية والوظائف السامة للخلايا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن الإبلاغ عن التكيف رواية للمقايسة الهجرة خلية شعاعي أحادي الطبقة، لاول مرة لقياس الهجرة شعاعي من الخلايا السرطانية ملتصقة على البروتينات المصفوفة خارج الخلية، لقياس الحركة البشرية غير ملتصقة أو المستجيب الفئران خلايا fluorescently المسمى، المناعية. هذه التقنية تستخدم مشعب الفولاذ المقاوم للصدأ و10-جيدا الشريحة تفلون لإيداع الوزراء البريطانى خلايا T غير ملتصقة في آبار أعدت مع أي متموجة الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية أو البروتينات المصفوفة خارج الخلية. يستخدم الضوء و / أو متعدد القنوات المجهري مضان لتتبع حركة وسلوك الخلايا المستجيب على مر الزمن. الأصباغ الفلورية و / أو ناقلات فيروسية أن يتم استخدام رمز الجينات المحورة الفلورية لتسمية بشكل مختلف أنواع الخلايا للتصوير. هذا الأسلوب هو متميز من نوع مماثل في فحوصات المختبر التي تتبع أفقي أو عمودي الهجرة / الغزو استخدام غرف الشرائح، أجار أو transwell لوحات. مقايسة يسمح بيانات التصوير مفصلة لبالبريد جمعها مع أنواع مختلفة من الخلايا تتميز علامات الفلورسنت محددة؛ يمكن رصدها حتى القطعان معينة من الخلايا (أي transduced / nontransduced). يتم إنشاؤها سطح المؤامرات كثافة مضان باستخدام قنوات محددة مضان التي تتوافق مع نوع من الخلايا المهاجرة. وهذا يسمح لتصور أفضل للتنقل الخلايا المناعية غير ملتصقة في أوقات محددة. فمن الممكن لجمع أدلة عن وظائف الخلية المستجيب أخرى، مثل سمية الخلايا أو نقل ناقلات فيروسية من المستجيب لاستهداف الخلايا، كذلك. وهكذا، فإن الأسلوب يسمح للباحثين لتوثيق مجهريا خلية الى خلية تفاعلات المسمى تفاضلي، وعدم تمسكا مع الخلايا الملتصقة من مختلف الأنواع. قد تكون هذه المعلومات ذات أهمية خاصة في تقييم أنواع الخلايا المناعية بيولوجيا التلاعب بها أو تفعيلها، حيث هو المطلوب برهان البصرية من وظائف مع الخلايا المستهدفة الورم قبل استخدامها لعلاج السرطان.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير هذا الفحص الهجرة خلية شعاعي واحد رقائق أصلا لقياس خصائص الارتشاحي من الخلايا السرطانية ملتصقة 1-4 على الشرائح المغلفة مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات 5-7 أو مع مكونات ECM الفردية، مثل فبرونيكتين أو laminin 1،2. وشملت تقنية البذر تعليق خلية واحدة من الخلايا السرطانية في وسط الآبار باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ الترسيب خلية متعددة (CSM). بعد الترسيب، فإن الخلايا السرطانية الانضمام إلى قاع البئر والتغيير في قطر من السكان الخلية الأولي مع مرور الوقت كانت تستخدم لإقامة معدل الحركة الأفقية. قدم فحص شعاعي الهجرة الخلية أحادي الطبقة ميزة البصرية على الطرق الأخرى القائمة التي يعملون transwell لوحات لفحص القدرات في المختبر من خلايا المهاجرة. هذه المقايسات غير قابلة للتفضي إلى التصوير 8. كذلك، قدمت أيضا قدرا كبيرا من الحرية في اختيار timepointليالي عندما يتم تقييم الهجرة، مع عدم وجود حد لعدد من timepoints الباحث يمكن أن يختار الصورة بعد الترسيب.

لأن القدرة على الهجرة هي وظيفة هامة للخلايا غير ملتصقة، وخاصة في مجال العلاج المناعي أو حيث يمكن أن تستخدم وسائل إيصالها للناقلات فيروسية، ونحن تكييفها استخدام CSM لتقييم هجرة الخلايا غير ملتصقة أنواع على الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية، بالإضافة إلى البروتينات ECM. فائدة إضافية تتمثل في تصور مجهريا هجرة الخلايا غير ملتصقة على الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية قابلة للحياة، على ECM معقدة معزولة عن الورم، أو على مكونات ECM الفردية يجعل هذا الاختبار تنوعا. لا تعكس المقايسات التي تستخدم الآبار المغلفة مع البروتين خارج الخلية واحد بدقة الركيزة الأنسجة ECM أو ورم أن الخلايا تهاجر من خلال في الجسم الحي.

هنا، كنا alloreactive السامة للخلايا T الليمفاوية (alloCTL)، توعيتهم histocomp الرئيسيةمجمع atibility (MHC) البروتينات باستخدام تفاعلات في اتجاه واحد الخلايا السرطانية اللمفاوية مختلطة (MLTR) أو ردود الفعل اللمفاويات مختلطة (MLR) 9، كما لدينا التمثيلي غير ملتصقة نوع من الخلايا. نحن اختبار خلايا المنشأ البشري والفئران على حد سواء. عندما تم قياس الهجرة على الطبقات الوحيدة الورم، وكانت الخلايا السرطانية يعملون الأهداف ذات الصلة إما جزئيا، وعرض بعض من نفس البروتينات MHC وجدت على السكان الخلية المستخدمة لتوعية المستجيبات، أو الأهداف ذات الصلة بشكل كامل، مع مجموعة كاملة من جزيئات MHC أن تم توعية المستجيبات نحو. في بعض التجارب، وكنا CellTracker الفلورسنت الأحمر CMPTX أو تكاثر الخلايا صبغ eFluor 670 إلى التفريق بين الخلايا المستجيب والهدف. كنا أيضا التنبيغ مع ترميز ناقلات فيروسية لالبروتينات الفلورية وسيلة إضافية لتصور الخلايا. بالنسبة لبعض المقايسات، فإننا transduced في alloCTL مع ناقلات تتكاثر فيروسات (RRV) الترميز لالزمرد الأخضر (EMD) البروتين الفلوري 10،11. لأوراسكوم تليكوم القابضةالمتطلبات البيئية، تم transduced الخلايا السرطانية مع ناقلات lentiviral الترميز لmStrawberry.

تم المصنفة في alloCTL من خلال قناة من مشعب في مركز الورم إما الطبقات الوحيدة الخلية أو ECM تحصد من الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية. تم تصور ملتصقة وغير ملتصقة التفاعلات الخلية التي كتبها ضوء و / أو بواسطة المجهر مضان على مر الزمن. كانت اضطراب في أحادي الطبقة الخلية السرطانية في انخفاض القوة، أو ورم الخلايا مع نوى مجزأة في عالية الطاقة مؤشرات إصابة الخلية التي تحلل وموت الخلايا المبرمج، على التوالي. أنشأنا رقميا كثافة سطح خرائط الفلورسنت تبين هجرة الخلايا T الاستشعاع غير ملتصقة على الثقافات أحادي الطبقة. لاحظنا أيضا أفرز السمسة إلى ملتصقة أحادي الطبقة خلية الورم بعد تشكيل مجموعة من alloCTL غير ملتصقة مضافين. كذلك، لوحظ التنبيغ الأفقي للRRV-EMD من alloCTL إلى أحادي الطبقة بالورم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الشريحة التحضير

  1. إدراج الترسيب خلية الشرائح المنوع في الحقائب التعقيم وختم الشريط مع الأوتوكلاف. مواجهة الجانب تفلون المغلفة للانزلاق على جانب ورقة من الحقيبة لتجنب الودائع من البلاستيك على الآبار.
  2. الحقائب الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
  3. إزالة الشريحة من التعقيم الحقيبة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ومكان في العقيمة 150 × 15 مم طبق بتري معقمة. ما يصل إلى أربعة شرائح يمكن أن يصلح لكل طبق. وضع 35 × 10 مم طبق بتري بجانب الشرائح. إضافة 2-3 مل من H 2 O معقمة لتوفير الترطيب.
  4. الشرائح قبل معطف مع بولي-D-يسين بمعدل 100 ميكروغرام / مل باستخدام حجم ما يكفي لتغطية كامل أيضا. بعد ساعة واحدة على RT، نضح الحل وشطف سطح مرتين جيد من قبل pipetting برنامج تلفزيوني 1X على سطح الآبار.
  5. اختياريا، إضافة فبرونيكتين أو مكونات ECM أخرى لضمان أقوى الخلايا السرطانية الالتزام. إضافة فبرونيكتين في 5 ميكروغرام / مل في ما يكفي من حجم ثار الآبار سوف لا تجف في غضون فترة قصيرة من الزمن في RT.
    1. بعد 1 ساعة، نضح الحل بقايا ويغسل مرتين من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع برنامج تلفزيوني 1X.
  6. الحفاظ PBS على الآبار حتى الورم جاهز للطلاء. استخدام الشرائح في نفس اليوم.
  7. حصاد قارورة متكدسة من ملتصقة نوع من الخلايا السرطانية المطلوب. عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق صبغ استبعاد بواسطة المجهر الضوئي و resuspend في 5 × 10 6 خلية / مل في مخزنة على نحو كاف للنمو سبيل المثال المتوسطة ل، Dulbecco والحد الأدنى من المتوسط ​​ضروري (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، L- الجلوتامين والبيروفات الصوديوم.
  8. إذا كان المطلوب تصوير الفلورسنت من السكان خلية ملتصقة، تسمية السكان الخلية ملتصقة مع صبغة الفلورسنت حيويا أو صبغة تكاثر الخلايا عن طريق اتباع بروتوكولات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
  9. ماصة بسلاسة 10 ميكرولتر من المتوسطة الكامل في كل بئر من الرعاية الشريحة باتخاذها لتجنب خلق فقاعات في أهلا وسهلاليرة سورية، وهذه يمكن منع موحد الالتزام الخلايا السرطانية.
  10. إضافة 2،5-5،0 × 10 4 خلايا (5-10 ميكرولتر من تعليق خلية) إلى متوسطة في كل بئر (الشكل 1A). ضبط العدد الأمثل اعتمادا على نوع من الخلايا السرطانية وعدد الأيام من النمو المنشود. الخلايا السرطانية أكبر أو الخلايا السريعة النمو قد تتطلب خلايا أقل في البداية. جلب حجم جيدا ما يصل إلى 40 ميكرولتر بإضافة المتوسطة وماصة صعودا وهبوطا لضمان حتى التوزيع من الخلايا.
  11. بعد كل الآبار هي المصنفة، تسمح للخلايا السرطانية أن تلتزم في RT، ثم وضع غطاء على طبق بتري 150 × 15 ملم وبعناية يتحرك الطبق إلى حاضنة مرطب 37 ° C / 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة على الأقل.
  12. تغيير ثقافة المتوسط ​​يوميا. ماصة بعناية جزء من المتوسط ​​أمضى من أحادي الطبقة المتوسطة واستبدالها مع كامل الطازجة.
    ملاحظة: بسبب التبخر، وسوف تحتاج أكثر من وحدة التخزين التي يمكن ان تضاف مما كان يؤخذ بها. سوف آبار تكون جاهزة للفحص عند حتى، conflطبقة uent الخلايا موجودة. هذا هو عادة بعد 1-3 أيام بذر الأولي.
  13. يغسل مرة واحدة أحادي الطبقة بلطف مع PBS كما هو موضح في الخطوة 1.4 و إما انتقل إلى الخطوة 2 إذا رغبت الطبقات الوحيدة، أو إلى الخطوة 1.13 أدناه لاستخراج البروتينات ECM من أحادي الطبقة.
  14. جعل 0.5٪ تريتون-X (ت / ت) حل في المتوسط ​​كاملة وإضافة 30 ميكرولتر إلى كل بئر. السماح أحادي الطبقة هضم في غطاء محرك السيارة لمدة 2 دقيقة، ثم يغسل مرتين مع المتوسطة كاملة من قبل pipetting كما هو موضح أعلاه.
    ملاحظة: قد تكون طبقة ECM مرئية بواسطة المجهر الضوئي (الشكل 2). استخدام الشرائح على الفور، أو الاحتفاظ بها في المتوسط ​​كاملة في ترطيب CO 2 الحاضنة لمدة 1-2 أيام. لا تسمح الآبار لتجف.

2. الترسيب للخلايا T غير ملتصقة على الشريحة

  1. إذا كان المطلوب تصوير الفلورسنت من السكان الخلايا غير ملتصقة، تسمية السكان الخلية غير ملتصقة مع صبغة الفلورسنت الحيوية، مثل CFSE، خلية المقتفي الأحمر CMPTX، أو eFluor670 باتباع بروتوكولات المقدمة من قبل الشركة المصنعة لا يقل عن 1 ساعة قبل الفحص. بدلا من ذلك، والتلاعب خلايا للتعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة بواسطة ناقلات فيروسية.
  2. الأوتوكلاف مشعب الترسيب خلية في الحقيبة الأوتوكلاف كما هو موضح في 1.2 أعلاه.
  3. إزالة غرفة ترطيب تحتوي على الشرائح تفلون المغلفة من الحاضنة ومكان في خزانة السلامة البيولوجية.
  4. غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني 1X قبل pipetting صعودا وهبوطا، ثم إضافة 45 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة تحتوي على 10٪ على الأقل المصل.
  5. إزالة متعددة من المغلف التعقيم والشريحة بعناية في أكثر من الآبار حتى "هوك" في نهاية مشعب تلامس أسفل الشريحة (الشكل 1B).
  6. تأكد من أن مستنبت مرئيا في كل من القنوات. إذا رأيت أحدا، خلع متعددة وإضافة المزيد من متوسطة إلى المقابلة جيدا، ثم استبدال والتحقق مرة أخرى.
  7. كرر الخطوة 2.5 لكل تشاننيل من مشعب، أو العديد من الآبار كما تريد.
  8. عدد الخلايا غير ملتصقة و resuspend في ما لا يقل عن 1.0-2.0 × 10 5 / ميكرولتر. وضع 1 ميكرولتر من الخلايا وببطء ماصة لهم في قناة (الشكل 1C). هل كل هذا لالمرجوة بشكل جيد.
  9. ترك الخلية بأكملها جهاز تحميل، أي جوانب متعددة والشرائح، داخل غطاء محرك السيارة الحيوي لمدة 20-30 دقيقة للسماح للخلايا في القناة ليستقر.
  10. إزالة متعددة عن طريق لمس طرفي ورفعه على التوالي من الشريحة حتى لا تعكر صفو خلايا المصنف الوزراء البريطانى في وسط الآبار (الشكل 1D) بلطف.
  11. تفقد كل بئر لضمان أن الخلايا غير ملتصقة تم المصنف بنجاح في مركز البقاء البئر داخل محيط القناة المتعددة. فإن الخلايا غير ملتصقة بشكل مثالي تلتزم قليلا إلى أحادي الطبقة أو ECM ومع بعضها البعض، وبالتالي تتحرك بلطف الشريحة في جميع أنحاء لن يتسبب في بيلي خليةر لتفريق. لا تصدم الشريحة.

3. المجهر مضان

  1. مع المعدات التجريبية المناسبة، نفذ التصوير بعد تأكيد الترسيب. ومن الناحية المثالية، واستخدام المجهر التي هي مجهزة تجهيزا مع غرفة CO 2 والرطوبة. صورة في الطاقة المنخفضة، أي 4X أو 10X، للسماح للصور متعددة الواجب اتخاذها من مساحة أكبر بحيث يمكن أن ينظر إلى مجمل البئر.
  2. الحصول على صور رقمية باستخدام التقاط الصور البرمجيات. أداء brightfield و / أو متعدد القنوات التصوير مضان.
  3. إذا رغبت في ذلك، وإنشاء الفاصل الوقت لتسجيل الصور في قنوات مختلفة على منطقة معينة، أو الاحتفاظ الشريحة ترطيب وفي / 5٪ CO 2 حاضنة 37 درجة مئوية ويدويا إخراج لصورة عند نقاط الوقت المطلوب (الشكل 1E & F، وأوصت لنقطة زمنية أطول).

4. التحليل والعرض

  1. باستخدام برامج تحرير الصور، دمج الضوء وفلوريداويمكن رؤية الصور uorescent إلى أنواع الخلايا طبقة واحدة متعددة بحيث وعلامات في نفس الصورة. سحب وإسقاط الملفات على الصورة لعرض كل لون على حدة في البرنامج، وعند المطالبة، حدد الخيار "إضافة طبقة" لإنشاء ملف صورة مع طبقات متعددة.
    1. في أعلى التكبير، واتخاذ، محاذاة، وغرزة معا الصور عبر البئر رقميا. محاذاة الملفات من خلال النظر في المناطق الحفظ بين اثنين من الصور وتتراكب صورة واحدة على رأس الآخر حتى يتم إنشاء صورة كاملة.
  2. إضافة أشرطة ميكرون إلى صور خلال الاستحواذ باستخدام برنامج التقاط لتحديد المسافة هاجروا الخلايا الفردية.
  3. لتحديد الهجرة الخلية في أوقات مختلفة، وجعل خرائط كثافة سطح مضان مع برنامج صورة، أي يماغيج، لقياس الفلورسنت تجميع الخلايا T أو نشر على مر الزمن.
    1. لتوليد المؤامرات السطح، وتأخذ صورة الطبقات إنشاؤها في الخطوة 4.1 وتحت نافذة الطبقات،إلغاء جميع الطبقات ما عدا تلك المقابلة إلى القناة المطلوبة. على سبيل المثال، إذا كان المطلوب مؤامرة سطح لتصور EMD التعبير، يجب فقط الطبقات الخضراء المقابلة لتصفية المستخدمة لهذه العلامة تكون مرئية.
    2. تتسطح الصورة وحفظه في تنسيق ملف معترف بها (على سبيل المثال، بابوا نيو غينيا) وتحميل الصور إلى البرنامج. لتوليد مؤامرة السطح، تغيير نوع الصورة ل8 بت، تغيير السطوع / التباين حسب الحاجة للحد من الخلفية، وحدد الخيار "تحليل قطعة أرض / سطح". وقد تم توليد الصور في الشكل 5 عن طريق التحقق من "الظل '،' رسم المحور '،' المضلع واحدة لكل خط، وخانات" السلس ".
    3. بدلا من ذلك، أخذ قياسات باستخدام نصف قطر أو القطر من إيداع خلية التنسيق في وقت الصفر وقارن بين الخلايا في أبعد نقطة في أوقات مختلفة. قطر تفلون الآبار هو 6.0 ملم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النواقل الفيروسية ترميز لالبروتينات الفلورية يمكن استخدامها بالإضافة إلى، أو بدلا من صبغة الفلورسنت. يجب أن يتم تنفيذ تنبيغ الفيروسية في وقت سابق للفحص الحركة. كل من أنواع الخلايا الملتصقة وغير ملتصقة يمكن أن توصف بشكل مختلف. سوف بروتوكول لالتنبيغ تعتمد على نوع من ناقلات المستخدمة. هنا، فإننا transduced في alloCTL في أرقام 3 و 5 و 6 مع RRV-EMD يومين على الأقل قبل الفحص باستخدام بروتوكول صفها 12. كنا أيضا ناقلات lentivir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم pipetted الخلايا السرطانية في تعليق خلية واحدة في الآبار من الشريحة ملثمين تفلون. سمح للخلايا التمسك ومن ثم تشكيل الطبقات الوحيدة في ترطيب 5٪ CO 2، 37 ° C الحاضنة (الشكل 1A). الطبقات الوحيدة التي أنشئت أو البروتينات ECM المستمدة من أحادي الطبقة يمكن أن تحصد لهذه المقايسات (الشكل 1B). وكانت المصنفة الخلايا الليمفاوية التائية المستجيب المسمى مع الأصباغ الفلورية الحيوية أو transduced مع ناقلات ترميز لEMD في وسط البئر باستخدام CSM. قدرة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بدعم جزئي من المعاهد الوطنية للصحة R01 CA121258، R01 CA125244، R01 CA154256، NIH / NCATS UCLA CTSI غرانت عدد UL1TR000124، USAMRMC W81XWH-08-1-0734، وصندوق جوان S. هولمز التذكاري للبحوث. MJH وبطاقات المعايدة الواردة معتمد من زمالة ما بعد الدكتوراه التذكارية جوان S. هولمز في جامعة كاليفورنيا. تم الحصول على الجهاز CSM من الأساليب العلمية الإبداعية: www.creative-sci.com. وكان في استقبال ناقلات lentiviral من جامعة كاليفورنيا المتجهات الأساسية، الذي تدعمه CURE / P30 DK041301.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
شرائح المجهر المقنع من التفلونطرق علمية إبداعيةCSM002
مشعب ترسيب الخلاياطرق علمية إبداعيةCSM001
طبق بتري ، طبق بتري 430597
150 مم ،430588
(PBS) Mediatech21-040
20 & مو ل PipetmanGilsonF123600
200 & mu ؛ ل PipetmanGilsonF123601
200 & mu ؛ ل أطراف الماصةVWR89003-060
ماء مقطر منزوع الأيونات (معقم)Mediatech25-055
TrypsinMediatech25-054-CL
Celltracker أحمر CMPTXInvitrogenC34552
TrypLE Express (اختياري)Gibco12604
وسائط زراعة الخلايا السرطانية (على سبيل المثال < / em> DMEM)Mediatech10-013
AIM-V وسائط خالية من المصلInvitrogen12055-083
مصل الأبقار الجنينيأوميغا ScientificFB-02
مجهر
التشخيصالمتقدمة
Poly-D-LysineMilliporeA-003-E
Fibronectinديناربحريني 354008
31/2 < / sup>x 51/4 < / sup> أكياس الأوتوكلافCrosstexSCXS2
Trypan BlueMediatech25-900-CI
تكاثر الخلايا eFluor 670eBioscience65-0840-85
ImageJNIH
كورنينج ملح فوسفات 35 مممقلوبSPOT أدوات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
  2. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  3. Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
  4. Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
  5. Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
  6. Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
  7. Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
  8. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  9. Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
  10. Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
  11. Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
  12. Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
  13. Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
  14. Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
  15. Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
  16. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  17. Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
  18. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  19. Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21(2005).
  20. Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
  21. Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Radial Migration AssayNon adherent T CellsTumor Cell MonolayerCell Sedimentation ManifoldFluorescence MicroscopyRetroviral Vector TransductionCytotoxic T LymphocytesAllogeneic Effector CellsSurface Intensity MappingCo culture Migration

Related Articles