يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير

11K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52431

⸱

فبراير 5, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

في هذه المقالة

ملخص

يعد التعبير المشترك للبروتين < p class = 'jove_content'> بديلا قويا لإعادة تكوين مجمعات البروتين في المختبر ، وهو يساعد في إجراء الاختبارات البيوكيميائية والجينية في الجسم الحي. نبلغ هنا عن استخدام التعبير المشترك للبروتين في الإشريكية القولونية للحصول على مجمعات البروتين ، وضبط تواتر الطفرات في الخلايا.

الملخص

نبلغ هنا أن التعبير عن مجمعات البروتين في الجسم الحي في الإشريكية القولونية يمكن أن يكون أكثر ملاءمة من تجارب إعادة التكوين التقليدية في المختبر. على وجه الخصوص ، نظهر أن الذوبان الضعيف للإشريكية القولونية DNA polymerase III ε الوحدة الفرعية (التي تتميز بنشاط نوكلياز خارجي 3'-5') يتحسن بشكل كبير عندما يتم التعبير عن نفس البروتين مع الوحدتين الفرعيتين α و θ (التي تتميز بنشاط بوليميراز الحمض النووي واستقرار ε ، على التوالي). نظهر أيضا أن التعبير المشترك للبروتين في بكتريا قولونية يمكن استخدامه لاختبار كفاءة كفاءة الوحدات الفرعية من الأنواع البكتيرية المختلفة للارتباط بمركب بروتين وظيفي. لقد أظهرنا بالفعل أن الوحدة الفرعية α من Deinococcus radiodurans DNA polymerase III يمكن التعبير عنها بشكل مشترك في الجسم الحي مع الوحدة الفرعية ε من بكتريا قولونية. بالإضافة إلى ذلك ، نبلغ عن استخدام التعبير المشترك للبروتين لتعديل تكرار الطفرات في الإشريكية القولونية. من خلال التعبير عن الوحدة الفرعية ε من النوع البري تحت سيطرة محفز araBAD (محفز أرابينوز) ، والتعبير المشترك عن متغير D12A المطفرة لنفس البروتين ، تحت سيطرة محفز lac (المحفز بواسطة الأيزوبروبيل-ثيو-β-D-galactopyranoside ، IPTG) ، تمكنا من تغيير بكتريا قولونية تردد طفرة باستخدام تركيزات مناسبة من المحفزات أرابينوز و IPTG. أخيرا ، نناقش التطورات الحديثة والتحديات المستقبلية للتعبير المشترك عن البروتين في الإشريكية القولونية.

المقدمة

إدخال تكنولوجيات overexpression عزز إما الدراسات البيوكيميائية لل-نسخة منخفضة الانزيمات عدد والإنتاج الصناعي من البروتينات الصيدلانية الفعالة (مثل الأنسولين). منذ ظهور هذه التقنيات، وقد تم تحقيق تقدم كبير لزيادة الغلة ونوعية البروتينات المؤتلف. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير بدائية النواة 1،2 و حقيقية النواة 3 أنظمة overexpression على مر السنين، وتقديم بدائل مفيدة ل"حصان العمل" للتكنولوجيا الحيوية من البروتين، أي كولاي. على وجه الخصوص، وتوافر منصات بديلة لE. أدى القولونية إلى إنتاج الببتيدات المؤتلف أو البروتينات التي تحمل التعديلات بعد متعدية. ومع ذلك، فإنه يجب ذكره أن E. القولونية لا يزال يمثل كائن الاختيار لإنتاج البروتين المؤتلف. ويرجع ذلك إلى عدة عوامل، من بينها الأكثر صلة يمكن أن تكونتعتبر: أ) توافر عدد كبير من أنظمة overexpression (ناقلات التعبير وسلالات) لE. القولونية 1،2. ب) مرات الجيل القصير، وغلة الكتلة الحيوية العالية، من E. القولونية في مجموعة متنوعة من الوسائط الغنية والاصطناعية. ج) للتلاعب سطحي إما في الكيمياء الحيوية وعلى المستوى الجيني لهذه الكائنات الحية الدقيقة. د) عزل سلالات قادرة على إنتاج البروتينات السامة 4؛ ت) بناء سلالات تتميز تحريض متجانسة على مستوى السكان 5،6. وبالإضافة إلى ذلك، تبين في الآونة الأخيرة أن الأنظمة التعبير مناسبة للإنتاج في E. القولونية من البروتينات بعد translationally تعديل يمكن وضعها والتي شيدت 2.

في الوقت الحاضر، ويستخدم البروتين overexpression أساسا للحصول على البروتينات أحادى أو وطي بلازميدة قليلة القسيمات، الذي لا يمكن أن يؤديها مع جين واحد مستنسخ إلى البلازميد المناسب hypersynthesis. ومع ذلك، كان الاهتمام في الآونة الأخيرةالمدفوعة لبناء E. أنظمة البروتين شاركت في التعبير القولونية، مما يشكل تحديا للإنتاج، في الجسم الحي، من مجمعات للمغاير بلازميدة قليلة القسيمات 2. ومن المثير للاهتمام، والتجارب في وقت مبكر من البروتين شاركت في التعبير كلمة أمام الجمعية بين الأنواع من مفارز كبيرة وصغيرة من كربوكسيلاز السيانوبكتيريا ريبولوز-1،5-bisphosphate / أوكسيجيناز 7،8، ورابطة أشكال اقتطاع وطول كامل من HIV-1 الناسخ 9 عكس. وأظهرت هذه الدراسات الرائدة التي البروتين شاركت في التعبير يمثل بديلا قويا لالتقليدية في إعادة المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، والبروتين شارك في التعبير في E. وقد استخدم القولونية لإنتاج البروتينات المختلفة التي تحمل التعديلات بعد متعدية 2، للحصول على البروتينات التي تحتوي على الأحماض الأمينية غير طبيعية 2، وزيادة العائد من بروتينات الغشاء overexpressed 2. وعلاوة على ذلك، فإن احتمال من البروتين شاركت في التعبير كأداة لتمنح لE. القولونية المنافسةالامتحانات التنافسية الوطنية في إفراز البروتين هو قيد التحقيق النشط 2.

اثنين من الاستراتيجيات الرئيسية للبروتين شارك في التعبير في E. القولونية يمكن اتباعها: ط) استخدام البلازميد واحد لاستضافة جينات مختلفة إلى أن overexpressed. ب) استخدام البلازميدات متعددة في الخلايا واحد للمشاركة في التعبير عن البروتينات المستهدفة. في الحالة الأولى، ومعايير لاختيار البلازميد لا تختلف عن تلك التي واحدة من التجارب البروتين overexpression التقليدية، على الرغم من البلازميدات معينة تحتوي على العناصر جنبا إلى جنب المروج / المشغل شيدت للمشاركة في التعبير 10. ولذا فإن هذا النهج الأول هو بسيط جدا. ومع ذلك، فإنه تجدر الإشارة إلى أن استخدام البلازميد واحد للمشاركة في التعبير عن مختلف البروتينات يواجه صعوبات كبيرة اثنين: أ) الكتلة الجزيئية للزيادات ناقلات مع عدد من الجينات استضافت، مما يحد من عدد من البروتينات وأعرب المشترك؛ ب) عندما يتم استنساخ جينات متعددة تحت سيطرة أحد المروجين واحد، يمكن قطبية decreasالبريد التعبير عن الجينات البعيدة من المروج. استخدام البلازميدات مزدوجة أو متعددة في واحد E. خلايا القولونية ديها لتحقيق التوافق بين ناقلات الاختيار، وبالتالي فرض القيود على تركيبات المؤهلة من البلازميدات. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية شاركت في التعبير الثانية يتميز بميزة التي تحتوي على الكتلة الجزيئية للناقلات، ويحد قطبية. نحن شيدت مؤخرا نظام المشاركة في التعبير البروتين مصممة لتسهيل مكوكية من الجينات بين البلازميدات شاركت في التعبير 11. على وجه الخصوص، ونحن شيدت سلسلة نواقل pGOOD، الميزات ذات الصلة والتي هي: أ) أصل p15A النسخ المتماثل، لتوفير التوافق من البلازميدات pGOOD مع ناقلات التجارية التي تحتوي على أصل ColE1 (على سبيل المثال، سلسلة pBAD 12)؛ ب) الكاسيت التتراسيكلين المقاومة. ج) وجود لاك -derived العناصر التنظيمية، أي المروج-المشغل (O 1) الزوجين واسي س الجين. باستخدام زوجين pBAD-pGOOD المناسب، كنا قادرين على بإفراط عن جوهر الحفاز E. القولونية DNA بوليميريز الثالث، تتكون من ثلاثة مفارز مختلفة، أي α (في 'البلمرة، ε (و3'-5 5'-3) "نوكلياز خارجية) وθ (استقرار ε) 13. على وجه الخصوص، أثبتنا أن شارك في التعبير عن مجمع αεθ كان يعتمد بشكل صارم على بالإضافة إلى E. القولونية مستنبت كل من IPTG وأرابينوز، مما اثار overexpression من pGOOD وpBAD، على التوالي (الشكل 1A).

في هذا التقرير، فإننا توضيح كيفية البروتين شاركت في التعبير يمكن أن تحل بكفاءة صعوبات مرتبطة الذوبان الفقراء من حدة فرعية البروتين المعقدة. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيف في بروتين الجسم الحي الاختبارات تكامل لا يمكن أن يؤديها، ونحن تقريرا أخيرا على استخدام البروتين شاركت في التعبير للتردد طفرة في تناغم E. مضيق بين قمتينأنا. لتحقيق هذا الهدف، وكنا الأزواج pGOOD-pBAD مناسبة لتوضيح الأمثلة ذات الصلة في كل دراسة حالة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. عزل E. القولونية المشارك transformants

  1. إعداد الخلايا الكهربائية المختصة في E. المناسب سلالة القولونية إلى أن تتحول. نقل إلى 1 مل من LB المتوسطة (تريبتون، مستخلصات الخميرة، كلوريد الصوديوم بنسبة 10، 5، و 10 غرام / لتر على التوالي) مستعمرة واحدة من سلالة من الاختيار، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف تهتز من 180 دورة في الدقيقة. تمييع ما قبل الثقافة 1: 500 في 25 مل من الطازجة المتوسطة LB واحتضان الثقافة في 37 ° C.
  2. في المرحلة السجل (0.6 OD) أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلايا في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة)، و resuspend بيليه في 10٪، والخامس / الخامس للمياه معقمة الجلسرين الجليد الباردة في نصف حجم ثقافة الأصلي. كرر هذه الخطوة 4 مرات، في كل مرة خفض حجم إعادة تعليق. وأخيرا، resuspend الكرية في الجلسرين / المياه وتقسيم تعليق الخلايا في 50 مكل. تخزين aliquots في -80 ° C تصل إلى 6 أشهر.
  3. حل البلازميد المطلوب في الماء المعقم تستكمل مع 0.5 ملي EDTA. ذوبان الجليد على جيمالبريد قسامة من الخلايا الكهربائية المختصة وتخلط مع كمية مناسبة (2.5-5 نانوغرام) من النواقل. الاستغناء الخليط في 0.1 سم كفيت مناسبة ل electroporation، وتطبيق 1.8 كيلو فولت.
  4. على الفور نقل الخلايا electroporated في 1 مل من SOC المتوسطة (LB المتوسطة تستكمل مع 0.2٪ ث / ت الجلوكوز، 10 ملي MgCl 2، 2.5 ملي بوكل)، واحتضان لمدة 1 ساعة تحت الهز، وأخيرا نقل 100 مكل إلى أطباق بتري تحتوي على LB أجار مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  5. تنقية transformants بواسطة تسليط الضوء على المستعمرات واحد على أطباق بتري.
  6. إعداد الخلايا الكهربائية المختصة في transformants الابتدائية وكرر الخطوات من 1،1-1،5 لتحويل مع مزيد من البلازميدات.
  7. إعداد مخزون الجلسرين من شارك في transformants. نقل مستعمرة واحدة في LB تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت الهز، والمعرضة للمرحلة السجل (0.6 OD) أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلايا في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة. Resuspend بيليه في LB-المضادات الحيوية التي تحتوي على المتوسطة 15٪ ت / ت الجلسرين. الاستغناء في مأخوذة وتخزينها في - 80 ° C.

2. المشارك التعبير عن α ε والوحدات الصغرى من E. القولونية البلمرة DNA III

  1. نقل مع حلقة عقيمة كمية صغيرة من الأسهم الجلسرين سلالة المناسب (على سبيل المثال، TOP10 / pGOOD-ε243 وTOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160، انظر الشكل 1) في طبق بتري تحتوي على LB المتوسطة والمضادات الحيوية. السماح للخلايا جافة تعليق على طبق بيتري، ومسحة الخلايا الحبرية. احتضان عند 37 درجة CO / N.
  2. نقل، وذلك باستخدام مسواك العقيمة، مستعمرة واحدة في 1 مل من LB-المضادات الحيوية المتوسطة. احتضان 8 ساعة عند 37 ° C. تمييع ما قبل الثقافة 1: 500 في متوسطة جديدة واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 15 ساعة.
  3. إضافة IPTG، أرابينوز، أو أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. جمع الخلايا، وتخزين الكريات في -20 ° C.
  4. الكريات ذوبان الجليد على الجليد و resuspend في تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 2.5 ملي dithiothreitol، 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF)، ودرجة الحموضة 8). التجانس بلطف تعليق الخلايا مع بوتر الزجاج البارد.
  5. يصوتن في 15 W لمدة 15 ثانية، تليها 15 ثانية فاصل التبريد (4 دورات).
  6. أجهزة الطرد المركزي إجمالي مقتطفات البروتين في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة، في 4 درجات مئوية لاسترداد جزء القابلة للذوبان.
  7. تحليل بواسطة SDS-PAGE (12.5٪ الأكريلاميد) aliquots من كل استخراج البروتين القابلة للذوبان. لتحقيق هذا الهدف، ونقل 20 ميكرولتر من كل مستخلص بروتين قابل للذوبان لأنابيب إيبندورف تحتوي على 60 ميكرولتر من H 2 O و 20 ميكرولتر من العازلة تحميل (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10 ملي β المركابتويثانول، و 10٪ (ث / ت) SDS، 50٪ (ت / ت) الجلسرين، 0.25٪ (ث / ت) الأزرق برموفينول) ويغلي لمدة 5 دقائق. تحميل 18 ميكرولتر من كل عينة وتنفيذ أعمال الكهربائي في 140 V لحوالي 1.5 ساعة.

3. المشارك التعبير عن α الوحدة الفرعية من Deinococradiodurans سلطات الجمارك البلمرة DNA الثالث وε الوحدة الفرعية من E. القولونية البلمرة DNA III

  1. إعداد ما قبل ثقافة E. القولونية سلالة TOP10 / pBAD-α الدكتور / pGOOD-ε243 في 1 مل من المتوسط ​​LB-الأمبيسلين-التتراسيكلين واحتضان 8 ساعة عند 37 درجة مئوية. تمييع 1: 1،000 في متوسطة جديدة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  2. تمييع 1: 100 إلى 200 مل من المتوسط ​​الطازجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، ثم حمل لمدة 3 ساعة مع أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما. حصاد الخلايا، وتخزين بيليه في -20 ° C.
  3. Resuspend وبيليه في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1 ملم PMSF. التجانس وتعطيل الخلايا كما هو موضح في 2.4 و 2.5.
  4. أجهزة الطرد المركزي فورا الخلايا المحللة في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة. تجاهل بيليه. تصفية طاف مع قمع بوشنر مجهزة 3 طبقات من ورق الترشيح. تطبيق فراغ لطيف. لتجنب رغوة المفرطة، والحفاظ على فراغ قارورة مخروطي على الجليد أثناء الترشيح.
  5. تحديد تركيز البروتين وفقا لبرادفورد 14.

4. جل الترشيح اللوني

  1. تتوازن ل16x70-تغلف المياه (200) عمود الترشيح هلام مع 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8. تحميل على العمود استخراج البروتين القابلة للذوبان. لحل الأمثل، واستخدام 1 مل عينة حلقة. أداء اللوني عند 0.6 مل / دقيقة. الحفاظ على درجة الحرارة عمود في 4 درجات مئوية طوال الوقت.
  2. جمع 0.9 مل الكسور وتحليلها بواسطة SDS-PAGE. نقل 20 ميكرولتر من كل جزء صلة أنابيب إيبندورف تحتوي على 60 ميكرولتر من H 2 O و 20 ميكرولتر من العازلة تحميل (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10 ملي β المركابتويثانول، و 10٪ (ث / ت) SDS، 50٪ ( ت / ت) الجلسرين، 0.25٪ (ث / ت) الأزرق برموفينول) ويغلي لمدة 5 دقائق. تحميل 18 ميكرولتر من كل عينة وتنفيذ أعمال الكهربائي في 140 V لحوالي 1.5 ساعة.
  3. تحديد "نوكلياز خارجية 3'-5 والنشاط البلمرة DNA من كل جزء في 96-نحنليرة لبنانية microplates. فحص النشاط نوكلياز خارجية باستخدام ثيميدين 5'-أحادي البارانتروفنيل استر (ص NP-TMP) كما الركيزة 15. تقدير النشاط البلمرة DNA باستخدام PPX (بيروفسفاتاز، البيورين فوسفوريلاز، الزنثين أوكسيديز)، إلى جانب انزيم فحص 16 و 2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) كلوريد -5-فينيل-2H-نتروبلو (INT) كما متقبل الإلكترون 16.

5. تحليل الطفرة من السكان المشارك معربا عن البرية من نوع ε الوحدة الفرعية من E. القولونية البلمرة DNA الثالث والطفري εD12A البديل

  1. نقل مستعمرة واحدة من E. القولونية TOP10 تحتوي على pBAD-ε وpGOOD1-εD12A 11 ناقلات إلى 1 مل من LB-المضادات الحيوية المتوسطة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  2. تمييع ما قبل الثقافة 1: 250 في 3 قوارير تحتوي على المتوسط ​​الطازجة (10 مل)، إضافة محرضات مناسبة (أرابينوز، IPTG، أو أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما) واحتضان عند 37 ° Cلمدة 8 ساعة. إعداد موازية في الثقافات غير المتعمد.
  3. جمع aliquots من 1 مل، ثم تمييع 1: 500 في قوارير جديدة تحتوي متوسطة جديدة (10 مل) تستكمل أم لا مع محرضات مناسبة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  4. كرر الخطوات من 5.2 و 5.3 وجمع aliquots من 1 مل.
  5. تحديد وقوع عدد من الأجيال في كل ثقافة. نقل على لوحات LB، 100 ميكرولتر من التخفيفات المسلسل المناسبة من اللقاح والثقافة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية. عد المستعمرات على لوحات LB، وحساب سجل من عدد الخلايا الموجودة في اللقاح (سجل I) وفي الثقافة في نهاية النمو (تسجيل C). لتحديد عدد من الأجيال، استخدم الصيغة: (تسجيل C - تسجيل I) /0.301.
  6. الطرد المركزي في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend الخلايا في 1 مل من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 50 مم كلوريد الصوديوم. لpermeabilize الخلايا، إضافة 2-3 قطرات من الكلوروفورم ودوامة لمدة 20 ثانية.
  7. تحديد β-النشاط جلوكوزيد كل قسامة في صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا، وذلك باستخدام ص -nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc)، والركيزة. إضافة إلى كل بئر 100 ميكرولتر من الخلايا permeabilized و 100 ميكرولتر من الركيزة (16 ملغ / مل حل الأوراق المالية في H 2 O). الحرص على تجنب فقاعات الهواء في الآبار. قراءة الامتصاصية في 420 نانومتر، وذلك باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية والمرشح المناسب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الوحيدات ε من E. يتكون القولونية DNA بوليميريز الثالث من 243 الأحماض الأمينية ويحتوي الفقراء الذوبان 17،18، ما لم يتم حذف مخلفات 187-243 17. ومع ذلك، لقد أظهرنا سابقا 11 أن شارك في التعبير عن α كامل طول، ε، ومفارز θ غلة البلمرة DNA للذوبان III الأساسية الحفاز (الشكل 1). على وجه الخصوص، وذلك باستخدام نظام pBAD-pGOOD شاركت في التعبير، أثبتنا أن: ط) على overexpression من α ومفارز ε يمكن التحكم بشكل مستقل من قبل أرابي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن أن تكون البروتينات المختلين جوهريا، ويضم المناطق التي لا تقتصر على عدد محدود من التشكل 25 الهيكل العالي. هذه البروتينات المختلين وعادة ما تكون عرضة لتجميع 25، وعزلتهم وتوصيف قد تمثل مهمة صعبة. الوحيدات ε من E. القولونية DNA بوليميريز III ملامح اثنين من المجالات المتميزة 26،27، وهما: أ) المجال N-ثالثا، تحمل "النشاط نوكلياز خارجية 3'-5، والمختصة في ملزمة الوحيدات θ. ب) المجال C-ثالثا، المسؤولة عن الربط إلى α (البلمرة) فرعية. وم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

واعترف بشكل كبير على إذن من الوثاب وإلسفير في إعادة طبع الأرقام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجارسيجما ألدريتشA1296
أمبيسلينسيجما ألدريتشA9518
كلوروفورمسيجما ألدريتش288306
EDTAسيجما ألدريتشEDS
جلسرينسيجما ألدريتشG5516
INTسيجما ألدريتشI8377
IPTGسيجما ألدريتشI5502
KClسيجما ألدريتشP9541
L-أرابينوزسيجما ألدريتشA3256
MgCl2< / sub>سيجما ألدريتشM2670
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش31434
PMSFسيجما ألدريتشP7626
PNP-glucسيجما ألدريتشN7006
pNP-TMPسيجما ألدريتشT0251
تتراسيكلينسيجما ألدريتش87128
قاعدة تريزما   ؛Sigma-AldrichT1503
TryptoneSigma-Aldrich95039
مستخلص الخميرةFluka70161
محلول أكريلاميد 30٪BioRad161-0158للهلام الكهربائي
الأمونيوم بيرسولفاتBioRad161-0700للرحلان الكهربائي
للهلام جلايسينBioRad161-0718للهلام الرحلان الكهربائي
SDSBioRad161-0302للرحلان الكهربائي للهلام
TEMEDBioRad161-0800للرحلان الكهربائي للهلام
تريسBioRad161-0719للهلام الكهربائي
Cuvettes 0.1 سمBioRad1652089لجهاز الطرد المركزي للتثقيب الكهربائي
5415REppendorf
جهاز الطرد المركزي Allegra 21RBeckman
جهاز الكروماتوغرافيا GradiFracPharmacia Biotech
Gene Pulser II التثقيب الكهربائيBioRad
Microplate Reader 550Biorad
MiniProtean 3 خلاياBioRad
مزود الطاقةBioRad BioRad
سونيكاتور 3000ميسونيكس

المراجع

  1. Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
  2. Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
  3. Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
  4. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  5. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
  6. Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
  7. Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
  8. Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
  9. Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
  10. Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43(2007).
  11. Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
  12. Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  13. McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
  16. Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
  17. DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
  18. Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
  19. Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
  20. Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
  21. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  22. Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
  23. Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
  24. Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
  25. Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
  26. Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
  27. Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
  28. Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
  29. Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
  30. Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
  31. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  32. Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تجميع المعقد البروتينيترشيح الهلامالرحلان الكهربائي للهلام بوجود كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE)مقاييس الإنزيماتتحويل البلازميدتركيز المادة المحفزةتحليل تكرار الطفراتاختبار توافق الوحدات الفرعية
فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.