يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تخليق الإندوكسيل جليكوسيدات للكشف عن أنشطة الجليكوسيداز

6.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52442

⸱

مايو 27, 2015

 , 
1Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Hamburg

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content" > إندوكسيل جليكوسيدات هي أدوات راسخة ومستخدمة على نطاق واسع لفحص الإنزيم ومراقبة نشاط الإنزيم. خاصة بالنسبة لهياكل نوع الجلوكوز ، أثبتت التوليفات السابقة أنها صعبة ومنخفضة الغلة. يستخدم نهجنا الجديد استرات حمض الإندوكسيل كمواد وسيطة ثمينة لإنتاج عدد كبير من جليكوسيدات الإندوكسيل ذات الغلة الجيدة.

الملخص

أثبتت جليكوسيدات الإندوكسيل أنها أدوات قيمة ومتعددة الاستخدامات لمراقبة أنشطة الجليكوسيداز. يتم إطلاق الإندوكسيل عن طريق التحلل المائي الأنزيمي وتتأكسد بسرعة ، على سبيل المثال عن طريق الأكسجين الجوي ، إلى أصباغ من النوع النيلي. يتيح هذا التفاعل فحصا سريعا وسهلا في الجسم الحي دون عزل أو تنقية الإنزيمات ، بالإضافة إلى الاختبارات السريعة على ألواح الأجار أو في المحلول (على سبيل المثال ، الغربلة باللون الأزرق والأبيض ، والآبار الدقيقة) ويستخدم في الكيمياء الحيوية والكيمياء النسيجية وعلم الجراثيم والبيولوجيا الجزيئية. لسوء الحظ ، ثبت أن تخليق هذه الركائز صعب ، بسبب التفاعلات الجانبية المختلفة والتفاعل المنخفض لوظيفة هيدروكسيل الإندوكسيل. خاصة بالنسبة لهياكل نوع الجلوكوز ، لوحظت غلة منخفضة. يستخدم نهجنا الجديد إستر حمض الإندوكسيليك كوسيط رئيسي. تم تحضير استرات حمض الإندوكسيل ذات أنماط الاستبدال المتنوعة على مسارات قابلة للتطوير. يمكن إجراء عمليات نقل الجليكوزيل الطورية مع تلك المستقبلات وهاليدات الجليكوسيل البيرسيتيلية في ظل ظروف شائعة في عوائد عالية. ينتج عن انقسام الإستر والجليكوزيل الخفيف اللاحق بوساطة الفضة جليكوسيدات الإندوكسيل البيرسيتيلات في عوائد عالية. أخيرا يتم تنفيذ إزالة الحماية وفقا ل Zemplén.

المقدمة

لفترة طويلة، كانت عملية إنتاج النيلة عملية ذات أهمية اقتصادية بالغة. وقبل أن تتيح عمليات التخليق الكيميائي واسعة النطاق الوصول الرخيص إلى النيلة، كانت السلائف تُستخلص من مصادر طبيعية منذ العصور ما قبل المسيحية. وأصبحت زراعة النباتات الموفرة للنيلة (النيلة الطبيعية) في أوروبا غير مربحة في القرن 17th، حيث أن كمية سلائف النيلة في نبات النيلة الهندي (0.2-0.8 %) أعلى بنحو 30 مرة. وفي نهاية القرن التاسع عشر، أدى التخليق الكيميائي للنيلة إلى تراجع الزراعة التقليدية1,2.

تشمل سلائف النيلة التي توجد بشكل طبيعي في النباتات كل من الإنديكان (1)، والإنستاتان أ (2)، والإيساتان ب (3) (الشكل 1). وتتكون جميعها من وحدة إندوكزيل مرتبطة ببقايا غليكوزيل. ويؤدي كسر الرابطة الغليكوزيدية، عن طريق التحلل الإنزيمي على سبيل المثال، إلى تحرر الإندوكزيل (4). ويكون الإندوكزيل نفسه عديم اللون تقريبًا، ولكن يمكن أكسدته بسرعة لتكوين صبغة النيلة (5). وقد تم تطويع هذا التفاعل الحساس في الكيمياء الحيوية، والكيمياء النسيجية، وعلم البكتيريا، وعلم الأحياء الجزيئي لمراقبة الأنشطة الإنزيمية. ومن الممكن إجراء فحص النشاط in vivo دون الحاجة إلى عزل الإنزيمات أو تنقيتها، بالإضافة إلى إجراء اختبارات سريعة على أطباق الآجار أو في المحاليل (e.g., الفرز الأزرق-الأبيض، والآبار الدقيقة). وبناءً على البقايا المرتبطة بجزء الإندوكزيل (e.g., الإسترات، والغليكوزيدات، والكبريتات)، تم تطوير ركائز مناسبة لفئات مختلفة من الإنزيمات (e.g., الإستريز، والغليكوزيداز، والسلفاتاز)3. وفيما يلي، سيكون التركيز على تكوين وتطبيقات غليكوزيدات الإندوكزيل.

مخطط لعملية تحلل الإنديكان مائياً يوضح مشتقات الإندول وتكون صبغة النيلة.
الشكل 1: سلائف النيلة الطبيعية وتكون صبغة النيلة عن طريق التحلل المائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يحدد نمط الاستبدال في شق الإندوكسيل اللون والخصائص الفيزيائية لصبغة الإنديغو الناتجة. وتعد أنماط الاستبدال الأكثر شيوعاً هي 5-bromo-4-chloro (يُرمز لها بـ X؛ اللون الأزرق المخضر)، و5-bromo (الأزرق)، و5-bromo-6-chloro (الأرجواني)، وذلك لأنها تشكل أصغر جزيئات الصبغة، ولا تكوّن حبيبات، وتتمتع بأقل قدر من الانتشار من مواقع التحلل المائي. وتكتسب هذه الخاصية الأخيرة أهمية خاصة في التجارب التي تُجرى in vivo3.

نُشر أول تقرير عن طريقة توليد الإنديغو (indigogenic method) للكشف عن نشاط الإستريز في عام 1951 بواسطة Barrnett و Seligman، اللذين استخدما أسيتات وبوتيرات الإندوكซيل4. وبعد نحو عقد من الزمن، تم تطويع مبدأ توليد الإنديغو لتحديد موقع الغلوكوزيداز في الثدييات5. وحتى الآن، تم تطوير العديد من غليكوزيدات الإندوكซيل رغم أن تخليقها ثبت صعوبته. وتعتمد معظم عمليات التخليق على استخدام إندوكซيل مُن-أسيتيلي (N-acetylated indoxyl) كمستقبل، وهاليد الغليكوزيل المقابل كمانح6-14. وتتم عملية الغلكزة (Glycosylation) في الأسيتون مع هيدروكسيد الصوديوم. وفي ظل هذه الظروف، تحدث مجموعة من التفاعلات الجانبية، مما يقلل الإنتاجية بشكل كبير. وقد تم الإبلاغ عن إنتاجيات غلكزة منخفضة للغاية خاصة للهياكل من نوع الغلوكوز (على سبيل المثال، 15% لـ (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranoside6 و 26% لـ (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetyl-β-ᴅ-xylobioside14 في مثال أحدث). ومن خلال نهج مبتكر يستخدم إسترات حمض الإندوكซيليك، تم تحضير عدد كبير من غليكوزيدات الإندوكซيل بإنتاجيات جيدة (على سبيل المثال، إنتاجية 57% لـ (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranoside).

يصف البروتوكول التالي التخليق المباشر لإستر أليل حمض الإندوكسيليك (5-bromo-4-chloro)، وبناءً عليه تخليق جليكوزيد إندوكسيل (X-Gal). وتوضح تجربة نموذجية بسيطة التفاعلية الإنزيمية لـ β-galactosidase باستخدام X-Gal.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظات عامة:

تم تنفيذ جميع ردود الفعل باستخدام غطاء الدخان ومعدات الحماية الشخصية المناسبة. جميع الكواشف والمذيبات (سنويا ؛ محتوى الماء للمذيبات الجافة: MeCN <50 جزء في المليون ؛ Et2O <0.01٪; CH2Cl2 <0.003٪; تم شراء THF <0.005٪) من مصادر تجارية واستخدامها كما وردت. تم إجراء TLC على ألواح هلام السيليكا Merck 60 F254. تم الكشف عن المركبات بواسطة الأشعة فوق البنفسجية و / أو عن طريق المعالجة باستخدام EtOH / H2SO4 (9: 1) والتسخين اللاحق. تم إجراء كروماتوغرافيا العمود باستخدام هلام السيليكا Merck / Fluka 60 (230-400 شبكة). تم إجراء الترشيحات باستخدام قمع Büchner ومضخة الشفاطة. تمت إزالة المذيبات باستخدام مبخر دوار (40 درجة مئوية ، ~ 200 دورة في الدقيقة). تم تجفيف المنتجات في فراغ عالي (مضخة ريشة دوارة). تم إجراء التفاعلات التي تتطلب مذيبات جافة تحت جو الأرجون.

< p class = "jove_content"> في ما يلي ، تم وصف تخليق X-Gal (16) باستخدام 5-bromo-4-chloro-indoxylic acid allyl ester (12). لمزيد من المركبات ذات أنماط الاستبدال المتنوعة وكذلك استرات الميثيل المحضرة وفقا لهذا التسلسل الاصطناعي ، انظر المرجع 17-19.

< p class = "jove_title" >1. المتقبل: تخليق 5-برومو-4-كلورو-إندوكسيليك حمض أليل إستر18 (12)

  1. N-Acetylation: تخليق N- (4-bromo-3-chloro-2-methylphenyl)-acetamide (6)
    1. قم بإذابة 10.0 جم (45.7 ملليمول) من 4-برومو-3-كلورو-2-ميثيل أنيلين في 30 مل ثنائي كلورو ميثان.
      أنذر! ثنائي كلورو الميثان ضار ويبرد المحلول في حمام جليدي.
    2. أضف 6.50 مل (68.7 ملليمول) من أنهيدريد الخليك بالتنقيط واترك الخليط يسخن إلى درجة حرارة الغرفة. يمكن تقليب الخليط لمدة 8 ساعات أو طوال الليل. أنذر! أنهيدريد الخليك مادة قابلة للتآكل وقابلة للاشتعال.
    3. قم بإزالة المذيب وإعادة التبلور من أسيتات الإيثيل / الميثانول 9: 1 (المحصول: 97٪ (11.6 جم ، 44.2 ملليمول) ، صلب عديم اللون).
      أنذر! أسيتات الإيثيل مهيجة وقابلة للاشتعال. أنذر! الميثانول سام وقابل للاشتعال.
  2. الأكسدة: تخليق حمض N-acetyl-5-bromo-6-chloro-anthranilic (7)
    1. ارتداد خليط من 2.30 جم (8.76 ملليمول) من 6 (المنتج الذي تم الحصول عليه من الخطوة 1.1) و 2.10 جم (8.52 ملليمول) MgSO4 • 7H2O في 40 مل من الماء في قارورة قاع مستديرة ذات 3 رقبة مجهزة بقمع مبرد وإسقاط.
    2. أضف محلول KMnO4 المشبع بمقدار 50 مل في الماء إلى خليط التفاعل على مدى 3 ساعات. ثم سخنيها لمدة ساعتين إضافيتين تحت الارتجاع ، حوالي 135 درجة مئوية حمام زيت. أنذر! برمنجنات البوتاسيوم ضار ومؤكسد.
    3. تبرد إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتصفية البيرولوسيت (MnO2) ، الذي يتكون أثناء التفاعل.
      أنذر! البيرولوسيت ضار.
    4. أضف حمض الهيدروكلوريك (37٪) إلى المرشح حتى درجة الحموضة 1 ، ثم قم بتصفية المنتج وجففه في فراغ ، (المحصول: 70٪ (1.80 جم ، 6.15 ملليمول) ، صلب عديم اللون).
      أنذر! حمض الهيدروكلوريك مادة أكالة.
  3. نزع الأسيتيل: تخليق حمض 5-برومو-6-كلورو-أنثرانيليك (8)
    1. قم بإذابة 3.90 جم (13.3 ملليمول) من 7 (المنتج الذي تم الحصول عليه من الخطوة 1.2) في 70 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم المائي 1 نيوتن وسخنه عند حوالي 100 درجة مئوية (حمام الزيت) لمدة 5 ساعات < br / > أنذر! هيدروكسيد الصوديوم مادة أكالة.
    2. تبرد إلى درجة حرارة الغرفة وتضاف حمض الهيدروكلوريك (37٪) حتى درجة الحموضة 1 ، ثم قم بتصفية المنتج بقمع Büchner وجففها في فراغ ، (المحصول: 88٪ (2.93 جم ، 11.7 ملليمول) ، صلب عديم اللون).
  4. تكوين أنهيدريد: تخليق أنهيدريد 5-برومو-6-كلورو-إيزاتويك (9)
    1. 8.17 جم (32.6 ملليمول) من 8 (المنتج الذي تم الحصول عليه من الخطوة 1.3) في 33 مل من الأسيتونيتريل الجاف.
      أنذر! الأسيتونيتريل ضار وقابل للاشتعال.
    2. يقلب في درجة حرارة الغرفة ويضاف 5.3 مل ومحلول 3.22 جم (10.8 ملليمول) ثلاثي الفوسجين في 18.5 مل من ثنائي كلورو الميثان الجاف بالتنقيط في وقت واحد على مدى 30 دقيقة. ثم يسخن لمدة 3 ساعات عند 50 درجة مئوية (حمام زيت). أنذر! البيريدين ضار وقابل للاشتعال.
      أنذر! ثلاثي الفوسجين سام ويمكن أن يطلق الفوسجين.
    3. قم بإزالة حوالي 75٪ من المذيب وإخماد التفاعل بإضافة 100 مل من الماء المقطر وتصفية منتجك. يغسل بكمية صغيرة من ثنائي كلورو الميثان البارد.
    4. جفف المنتج في فراغ (المحصول: 88٪ (7.53 جم ، 27.2 ملليمول) ، صلب عديم اللون).
  5. N-الألكلة: تخليق 5-برومو-6-كلورو-ن-[(ميثوكسي كربونيل)أليل]-أنهيدريد إيزاتويك (10)
    1. قم بإذابة 25 جم (90 ملليمول) من 9 (المنتج الذي تم الحصول عليه من الخطوة 1.4) في 250 مل ثنائي ميثيل فورماميد اللامائي ويبرد بحمام جليدي.
      أنذر! ثنائي ميثيل فورماميد ضار وقابل للاشتعال
    2. أضف 1.15 ما يعادل هيدريد الصوديوم (60٪ في البارافين) من حيث الجزء.
      أنذر! هيدريد الصوديوم مادة أكالة وقابلة للاشتعال. رد فعل شديد مع الماء / الجليد.
    3. بعد 30 دقيقة من التقليب عند 0 درجة مئوية ، اترك التسخين إلى درجة حرارة الغرفة وأضف 1.2 ما يعادل أليل بروموأسيتات بالتنقيط.
    4. بعد التقليب لمدة 5 ساعات ، قم بإخماد التفاعل بإضافة 500 مل من الماء المقطر وتصفية منتجك.
    5. يغسل بالماء (3 مرات ، 100 مل) ويجفف المنتج في فراغ ، (المحصول: 93٪ (31.5 جم ، 84.1 ملليمول) ، صلب عديم اللون).
  6. فتح أنهيدريد: تخليق 5-برومو-6-كلورو-ن-(ميثوكسي كربونيل للإيل) -حمض أنثرانيليك أليل إستر (11)
    1. قم بإذابة 10 جم (27 ملليمول) من 10 (المنتج الذي تم الحصول عليه من الخطوة 1.5) في 100 مل من كحول الأليل.
      أنذر! كحول أليل ضار وخطير على البيئة.
    2. أضف 350 مجم (8.70 ملليمول) من هيدريد الصوديوم (60٪ في البارافين) من حيث الجزء.
    3. بعد التقليب لمدة 6.5 ساعة أو طوال الليل ، قم بإزالة المذيب.
    4. إخضاع المنتج الخام لكروماتوغرافيا العمود (العمود 30 × 6 سم ؛ 240 جم سيليكا) الأثير البترولي / أسيتات الإيثيل 2: 1 ؛ RF = 0.66) ، (المحصول: 80٪ (8.30 جم ، 21.3 ملليمول) ، زيت أصفر).
      أنذر! الأثير البترولي قابل للاشتعال ومهيج وخطير على البيئة.
  7. تكثيف ديكمان: تخليق 5-برومو-4-كلورو-إندوكسيليك حمض أليل إستر (12)
    1. امزج 3.0 جم (7.7 ملليمول) من 11 (المنتج الذي تم الحصول عليه من الخطوة 1.6) و 1.75 جم (15.6 ملليمول) من ثلاثي بوتوكسيد البوتاسيوم في 100 مل من ثنائي إيثيل الأثير الجاف.
      أنذر! ثلاثي بوتوكسيد البوتاسيوم مادة للتآكل وقابلة للاشتعال.
      أنذر! ثنائي إيثيل الأثير ضار وقابل للاشتعال للغاية.
    2. سخني الخليط تحت الارتجاع (أكثر برودة) لمدة ساعتين عند 40-45 درجة مئوية.
    3. قم بإزالة حوالي 75٪ من المذيب ، وأضف حمض الهيدروكلوريك المخفف (100 مل ، 1 م).
      أنذر! لا تجف تماما ، يمكن أن يحدث التحلل.
    4. قم بتصفية المنتج وجففه في الفراغ ، (المحصول: 84٪ (5.14 جم ، 15.5 ملليمول) ، عديم اللون إلى صلب أخضر قليلا).
فئة

2. إندوكسيل جليكوزيد: تخليق X-Gal17

    نقل
  1. الطور بالجليكوزيل: تخليق (5-برومو-4-كلورو-إندوكس-3-إيليك حمض أليل إستر) 2،3،4،6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-galactopyranoside (14)
    1. امزج 400 مجم (1.21 ملليمول) من أليستر حمض الإندوكسيليك 12 (المنتج الذي تم الحصول عليه من الخطوة 1.7) و 410 مجم (1.21 ملليمول) من رباعي بوتيل لامونيوم هيدروجين سلفات و 500 مجم (1.21 ملليمول) من المتبرع 2،3،4،6-رباعي-O-أسيتيل-α-ᴅ-جالاكتوبيرانوزيل بروميد (α-أسيتوبروموغالاكتوز) في 10 مل ثنائي كلورو ميثان. أنذر! كبريتات هيدروجين رباعي بوتيل لامونيوم ضارة.
    2. أضف 10 مل من محلول مائي من كربونات البوتاسيوم (1 م).
      أنذر! كربونات البوتاسيوم قابلة للتآكل.
    3. يقلب في درجة حرارة الغرفة حتى الاستهلاك الكامل للمتبرع (TLC: الأثير البترولي / أسيتات الإيثيل).
    4. افصل المرحلة العضوية (القمع الفاصل) ، وجفف فوق Na2SO4 وقم بإزالة المذيب.
    5. إخضاع المنتج الخام لكروماتوغرافيا العمود (الأثير البترولي / أسيتات الإيثيل 1: 1 ؛ RF = 0.33). (المحصول: 86٪ (690 مجم ، 1.04 ملليمول) ، صلب عديم اللون).
  2. انقسام إستر ونزع الكربوكسيل: تخليق (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl) 2،3،4،6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-galactopyranoside (15)
    1. قم بإذابة 600 مجم (0.908 ملليمول) من 14 (المنتج الذي تم الحصول عليه من الخطوة 2.1) في 15 مل رباعي هيدروفوران جاف.
      أنذر! رباعي هيدروفوران ضار وقابل للاشتعال.
    2. أضف 800 ميكرولتر من المورفولين و 105 مجم (9.09 ميكرومول) رباعي الأصوات (ثلاثي الفوسفين) البلاديوم (0) ويقلب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
      الحذر! المورفولين قابل للاشتعال والتآكل.
    3. قم بإزالة المذيب.
    4. أضف 400 مجم (2.40 ملليمول) أسيتات الفضة و 800 مجم (5.79 ملليمول) كربونات البوتاسيوم و 10 مل أنهيدريد الخليك.
      أنذر! أسيتات الفضة مهيجة وخطيرة على البيئة.
    5. يسخن على حرارة 90-100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    6. بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخفيفه بثنائي كلورو ميثان.
    7. اغسل الخليط مرتين بالماء ومرة واحدة بمحلول NaHCO3 المخفف (10٪).
      أنذر! بيكربونات الصوديوم أكالة.
    8. جفف المرحلة العضوية فوق Na2SO4 (مرشح) وقم بإزالة المذيب.
    9. إخضاع المنتج الخام لكروماتوغرافيا العمود (PE / EA 1: 1 ؛ RF = 0.24) ، (المحصول: 88٪ (495 مجم ، 8.00 ملليمول) ، صلب عديم اللون).
  3. زيمبلين Deacetylation: تخليق (5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-β-ᴅ-galactopyranoside (16)
    1. قم بإذابة 396 مجم (0.436 ملليمول) 15 (المنتج الذي تم الحصول عليه من الخطوة 2.2) في 10 مل من الميثانول.
    2. أضف كمية حفازة من ميثانولات الصوديوم وحركه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
      أنذر! ميثانولات الصوديوم قابل للاشتعال والتآكل.
    3. قم بتحييد باستخدام Amberlite IR-120 H + (فلتر) وتركيز.
      أنذر! Amberlite IR-120 H + مهيج.
    4. جفف المنتج في فراغ (المحصول: 87٪ (170 مجم ، 0.416 ملليمول) ، صلب عديم اللون).

3. توضيح تجربة النموذج: إثبات نشاط β-galactosidase باستخدام X-Gal

  1. قم بإعداد محلول 0.5 ملي مولار من X-Gal في محلول 500 ميكرولتر (Tris-HCl 20 ملي مولار ؛ درجة الحموضة 7.4 ؛ 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ؛ أو أي مخزن مؤقت آخر مناسب للإنزيم الخاص بك) في أنبوب طرد مركزي دقيق (يمكن إذابة X-Gal في بضعة ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد).
  2. أضف 1 ميكرولتر β،1-3-جالاكتوزيداز (EC 3.2.1.23 10،000 وحدة / مل ؛ أو أي β-galactosidase آخر مناسب) ورجه (600 دورة في الثانية) عند 37 درجة مئوية.
  3. اتبع رد الفعل. تتشكل صبغة نوع النيلي بعد فترة قصيرة من الزمن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نُشرت أولى عمليات تخليق الإنديكان (indicane) و5-برومو-إنديكان (5-bromo-indicane) بواسطة روبرتسون في عامي 1927 و192915,16. ومن خلال استخدام ميثيل إستر حمض الإندوكسيليك كمستقبل، تم سد الموضع 2 التفاعلي، وبالتالي تم كبح التفاعلات الجانبية جزئياً. أدت عملية الجليكوزيلة في الأسيتون/هيدروكسيد الصوديوم، بعد إزالة حماية المجموعة الواقية وإزالة الكربوكسيل (160 °C، أنهيدريد الأسيتيك، 1 hr)، وأخيراً إزالة الأسيتيل، إلى إنتاج الإنديكان و5-برومو-إنديكان. وبناءً على هذا المفهوم، طورنا طريقة تخليق محسنة لجليكوزيدات الإندوكسي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نظرا لضعف الغلة والقيود ، خاصة بالنسبة لهياكل نوع الجلوكوز والسكريات الأكثر تعقيدا ، تم تطوير نهج اصطناعي جديد تجاه جليكوسيدات الإندوكسيل. أثبتت استرات حمض الإندوكسيليك أنها مواد وسيطة رئيسية ثمينة وتم الحصول عليها في مسار معياري وقابل للتطوير. جميع الخطوات عالية الغلة وبسبب مواد البداية الرخيصة وسهولة العمل ، يمكن إجراء عمليات توليفات متعددة الجرام. ميزة نهج إستر أليل هي حجب الموضع 2 التفاعلي. وبالتالي يتم قمع التفاعلات الجانبية المتناقصة للإنتاجية. يسمح استخدام استرات الأليل بالانقسام الانتقائي ، وهو أمر مهم بشكل خاص ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

دعم هذا العمل من قبل Glycom A / S ، كوبنهاغن ، الدنمارك ، له امتنان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنهيدريد الخليكGrü ssing10298أكالة وقابلة للاشتعال
أسيتونيتريلسيجما ألدريتش608-001-00-3ضارة وقابلة للاشتعال
كحولأليل ألدريتش453021ضارة وخطيرة على البيئة
Amberlite IR-120 H+< / sup>Fluka06428مهيج
حمض البروموأسيتيكMerck802260تآكل ، سام ، خطير للبيئة
4-Bromo-3-chloro-2-methylanilineABCRAB 171687مهيج
ثنائي كلورو الميثانACROS326850010ثنائي
إيثيل الأثيرضار Grü ssing10274وقابل للاشتعال
للغاية ثنائي ميثيل فورماميدACROS348430010ضار وقابل للاشتعال
سيجما ألدريتش41648
أسيتات الإيثيلسيجما ألدريتش607-022-00-5مهيج وقابل للاشتعال
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكAppliChemA1103.0500مهيج
وبيتا. 1،3-Galactosidase ، مؤتلف ، E. قولونية < / em>Calbiochem345795
حمض الهيدروكلوريكVWR20252.290
هيدرات كبريتات المغنيسيومMerck105885
الميثانولACROS326950010مورفولين سام وقابل للاشتعال
Janssen Chimica15.868.57تآكل ، قابل للاشتعال
بيروليوم الأثيرAzelis111053قابل للاشتعال ومهيج وخطير على البيئة
كربونات البوتاسيومGrü ssing12005
برمنجنات البوتاسيومGr & uuml; ssing12056ضار ، مؤكسد
البوتاسيوم ثلاثي بوتوكسيدميرك804918، قابل للاشتعال
بيريدينسيجما-ألدريتش613-002-00-7ضار ، قابل للاشتعال
أسيتات الفضةفلوكا85140مهيج ، خطير على البيئة
بيكربونات الصوديومGr ü. ssing12144
هيدريد الصوديومMerck814552القابل للتآكل والقابل للاشتعال
Riedel-de H & auml ؛ enS181200المسببة للتآكل
ميرك806538المسببة للتآكل والقابلة للاشتعال
Gr ü ssing12175
Tetrabutylammonium هيدروجين كبريتاتلانكستر5438ضارة
رباعي هيدروفورانسيجما ألدريتش87371وقابل للاشتعال
Tetrakis (ثلاثي فينيل فوسفين) البلاديوم (0)سيجما ألدريتش216666
TriphosgeneFluka15217
تريس سام (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريدسيجماT-3253مهيج
ضارا ثنائي ميثيل سلفوكسيد المسببة للتآكل المسببة للتآكل تآكل المسببة للتآكل هيدروكسيد الصوديوم ميثانولات الصوديوم كبريتات الصوديوم ضار

المراجع

  1. Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present. Endeavour. 17, 191-199 (1993).
  2. Hunger, K. Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications. , 1st, Weinheim. Wiley-VHC. (2003).
  3. Kiernan, J. A. Indigogenic Substrates for Detection and Localization of Enzymes. Biotechn. Histochem. 82, 73-103 (2007).
  4. Barnett, R. J., Seligman, A. M. Histochemical Demonstration of Esterases by Production of Indigo. Science. 114, 579-582 (1951).
  5. Pearson, B., Andrews, M., Grose, F. Histochemical Demonstration of Mammalian Glucosidase by Means of 3-(5-Bromoindolyl)-β-ᴅ-glucopyranoside. Exp. Biol. Med. 108, 619-623 (1961).
  6. Anderson, F. B., Leaback, D. H. Substrates for the Histochemical Localization of some Glycosidases. Tetrahedron. 12, 236-239 (1961).
  7. Van Dort, M. E., Lee, K. C., Hamilton, C. A., Rehemtulla, A., Ross, B. R. Radiosynthesis and Evaluation of 5-[125I]Iodoindolyl-3-yl-β-ᴅ-galactopyranoside ([125I]IBDG) as a β-Galactosidase Imaging Radioligand. Mol. Imaging. 7, 187-197 (2008).
  8. Yoshida, K., Iino, N., Koga, I. Syntheses of Halogen Substituted β-ᴅ-Glucuronides and Their Hydrolysis by Rabbit Liver β-Glucoronidase. Chem. Pharm. Bull. 32, 1759-1769 (1975).
  9. Horwitz, J. P., et al. Substrates for Cytochemical Demonstartion of Enzyme Activity I. Some Substituted 3-Indolyl-β-ᴅ-glycopyranosides. J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).
  10. Eschenfelder, V., Brossmer, R. 5-Bromo-indol-3-yl 5-Acetamido-3,5-dideoxy-α-ᴅ-glycero-ᴅ-galactononulopyranosidic Acid, a Novel Chromogenic Substrate for the Staining of Sialidase Activity. Glycoconjugate J. 4, 171-178 (1987).
  11. Fujii, I., Iwabuchi, Y., Teshima, T., Shiba, T., Kikuchi, M. X-Neu5Ac: A Novel Substrate for Chromogenic Assay of Neuraminidase Activity in Bacterial Expression Systems. Bioorg. Med. Chem. 1, 147-149 (1993).
  12. Berlin, W., Sauer, B. In situ Color Detection of α-ʟ-Arabinofuranisodase, a "No-Background" Reporter Gene, with 5-Bromo-3-indolyl-α-ʟ-arabinofuranoside. Anal. Biochem. 243, 171-175 (1996).
  13. Marmuse, L., et al. New Chromogenic Substrates for Feruloyl Esterases. Org. Biomol. Chem. 6, 1208-1214 (2008).
  14. Kaneko, S., Kiaoka, M., Kuno, A., Hayashi, K. Syntheses of 4-Methylumbelliferyl-β-ᴅ-Xylobioside and 5-Bromo-3-Indolyl-β-ᴅ-Xylobioside for Sensitive Detection of Xylanase Activity on Agar Plates. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 741-745 (2000).
  15. Robertson, A. J. Syntheses of Glucosides. Part I. The Synthesis of Indican. Chem. Soc. , 1937-1943 (1927).
  16. Robertson, A., Waters, R. B. J. Synthese of Glucosides. Part VII. The Synthesis of 6-Bromoindican. Chem. Soc. , 2239-2243 (1929).
  17. Böttcher, S., Thiem, J. Indoxylic Acid Esters as Convenient Intermediates Towards Indoxyl Glycosides. Eur. J. Org. Chem. , 564-574 (2014).
  18. Böttcher, S., Hederos, M., Champion, E., Dékány, G., Thiem, J. Novel Efficient Routes to Indoxyl Glycosides for Monitoring Glycosidase Activities. Org. Lett. 15, 3766-3769 (2013).
  19. Böttcher, S., Thiem, J. Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine. RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الكشف عن الغليكوسيدازالغليكوزيلة بنقل الطورالغليكوزيلة بوساطة الفضةنزع الأسيتيل بطريقة زيمبليناختبار النشاط الإنزيميالركيزة الملونةتكوين صبغة النيلةتخليق الكربوهيدراتالغليكوزيدات متعددة الأسيتيل
تخليق الإندوكسيل جليكوسيدات للكشف عن أنشطة الجليكوسيداز
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.