يتم تقديم بروتوكول لربط مجموعة كبيرة ومتنوعة من الجزيئات المفردة تساهميا على طرف AFM. يتم توفير إجراءات وأمثلة لتحديد قوة الالتصاق والطاقة الحرة لهذه الجزيئات على الدعامات الصلبة والواجهات الحيوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحقيق احدة جزيء التصاق بواسطة القوة الذرية الطيفي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التحليل الطيفي القوة الذرية هو أداة مثالية لدراسة الجزيئات في الأسطح والواجهات. ويرد بروتوكول تجريبي لزوجين مجموعة كبيرة ومتنوعة من الجزيئات واحدة تساهميا على تلميح AFM. في نفس الوقت وتخمل طرف AFM لمنع التفاعلات غير محددة بين طرف والركيزة، الذي هو شرط أساسي لدراسة الجزيئات واحدة تعلق على طرف AFM. تحليلات لتحديد قوة التصاق، وطول التصاق، والطاقة الحرة من هذه الجزيئات على الأسطح الصلبة والحيوية واجهات يتم عرض قريبا ويتم توفير المراجع الخارجية لمزيد من القراءة. جزيئات سبيل المثال هي بولي (حمض أميني) polytyrosine، والكسب غير المشروع البوليمر PI- ز -PS والبابا فوسفورية (1-بالميتويل-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine). والمستوعبة هذه الجزيئات من الأسطح المختلفة مثل CH 3 -SAMs والهيدروجين إنهاء الماس وبدعم طبقات ثنائية الدهون في ظل ظروف المذيبات المختلفة. وأخيرا، فإنوتناقش مزايا القوة الطيفية التجارب جزيء واحد بما في ذلك وسيلة لتقرر ما إذا كان قد تم دراستها حقا جزيء واحد في التجربة.
المقدمة
على مدى السنوات ال 30 الماضية، تحولت القوة الذرية المجهر (AFM) إلى أن تكون تقنية التصوير قيمة لدراسة البيولوجية 1،2 و 3 الاصطناعية المواد والأسطح لأنه يوفر القرار المكانية الجزيئي في جميع الأبعاد الثلاثة ويمكن تشغيلها في مختلف المذيبات البيئات. وبالإضافة إلى ذلك،-AFM واحد قوة جزيء الطيفي (SMFS) يتيح لقياس القوى بدءا من السندات الإذنية إلى μN النظام وأعطت نظرة غير مسبوقة على سبيل المثال إلى البروتين للطي 4،5، الفيزياء البوليمر 6-8، واحد التفاعل جزيء سطح 9 - 12. والأساس المنطقي وراء دراسة الجزيئات واحدة بدلا من الفرقة من الجزيئات هو تجنب آثار المتوسط والتي غالبا ما تحجب الأ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: انظر الشكل 2 لمحة عامة عن عملية تدفق تضم إعداد، والحصول على البيانات وتحليل البيانات الخطوات.
1. إعداد الكاشف
ملاحظة: يجب أن يتم التعامل مع جميع المواد الكيميائية مع الرعاية، وبالتالي معطف المختبر، والقفازات وحماية العين يجب استخدامها. يجب إجراء جميع العمليات في غطاء المختبر. على وجه الخصوص، وينبغي ارتداء قفازات خاصة في حالة استخدام الكلوروفورم.
- استخدام المواد الكيميائية مع نسبة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في ما يلي، نتائج ما سبق ووصفت جزيئات سبيل المثال، وهي بوليمرات بولي (حمض أميني) polytyrosine، والكسب غير المشروع البوليمر PI- ز -PS والبابا فوسفورية، وتعرض. أولا لكل سبيل المثال، تجربة تفاصيل محددة للحصول على البيانات وإعداد البيانات يتم توفيرها. ثم، يتم عرض نتائج نموذجية للتجارب حيث تم المستوعبة هذه الجزيئات من السطوح المختلفة (CH 3 -SAMs والهيدروجين إنهاء الماس والدهون طبقات ثنائية). يتم تقديم تقرير من قوة التصاق، وطول التصاق والطاقة الحرة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خلال العقود الماضية، قدمت التجارب جزيء واحد رؤى غير مسبوقة في الآليات الجزيئية وتبين أن هذا النهج لا تقدر بثمن في علوم الحياة وخارجها. لتحقيق إحصاءات جيدة وذات مغزى من التجارب SMFS، من الناحية المثالية واحد ويتم استخدام نفس الجزيء على مدى كاملة من التجربة. وعلى النقيض من التجارب مع مجموعات من الجزيئات، والتجارب SMFS قادرة على كشف الأحداث النادرة والدول الجزيئية الخفية. ميزة أخرى من التجارب جزيء واحد هو أنها يمكن أن تكون على غرار عن طريق ديناميات المحاكاة الجزيئية 24،25........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون DFG (Hu 997 / 2-2) على الدعم المالي. تعترف FS بمؤسسة هانس زايدل (HSS). تم دعم SKr من قبل Elitenetzwerk Bayern في إطار برنامج الدكتوراه علم المواد للواجهات المعقدة. تشكر SKi SFB 863 على الدعم المالي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم
الشركة
رقم فهرسي
التعليقات
< td colspan = "4" >< قوي > المعدات < / قوي> ماصات
| <قوي>المواد< / قوي > | |||
|---|---|---|---|
| Hellmanex III سائل قلوي مركز (محلول منظف) | Hellma | ||
| RCA (ماء عالي النقاء ، بيروكسيد الهيدروجين (35٪) ، الأمونيا (32٪) ؛ 5: 1: 1 (v / v / v)) كاشف | Sigma | ||
| Vectabond / APTES (3-Aminopropyl) triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| الأسيتون الجاف (< 50 جزء في المليون H< sub>2< / sub>O) | سيجما | ||
| الكلوروفورم الجاف (> 99.9٪) | سيجما | ||
| ثلاثي إيثيل أمين | سيجما | ||
| ماء عالي النقاء | بيوكروم ، ألمانيا | ||
| رباعي الصوديوم ثنائي الصوديوم (> 99.5٪) | Biochrom ، ألمانيا | ||
| حمض البوريك | Biochrom ، ألمانيا | ||
| أحادية الوظيفة &alpha ؛ -methoxy - & omega ؛ -NHS PEG ، 5 كيلو دالتون ، " ميثيل PEG NHS " | راب ، ألمانيا | ||
| غير متجانسة وظيفية &alpha ؛ & omega ؛ -bis-NHS PEG ، 6 ؛ كيلو دال، " NHS-PEG-NHS " | راب ، ألمانيا | ||
| غير متجانسة وظيفية &alpha ؛ -maleimidohexanoic- & أوميغا ؛ - NHS PEG ، 5 كيلو دالتون ، " مال-بيج-NHS" | راب ، جزيء المسبار الألماني | ||
| (البوليمر ، الدهون ، <م > وما إلى ذلك < / م >) | |||
| كمية كافية من الأطباق المتبلورة الزجاجية مع صنبور (10 & nbsp ؛ مل) ، أطباق بتري زجاجية (500 وميكرو ؛ ل) والأغطية الزجاجية | VWR International GmbH ، ألمانيا | ؛ | |
| [header] | |||
| نموذج فرن المختبر UF30 | Memmert ، ألمانيا | ||
| سونيكاتير التحكم في درجة الحرارة | VWR International GmbH ، نظام البلازما الألماني | ||
| "Femto" ، 100 W | Diener ، ألمانيا | ||
| حقنة زجاجية منفصلة لكل مذيب عضوي | VWR International GmbH ، ألمانيا | ||
| Vortex خلاط | VWR International GmbH ، ألمانيا | ||
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (0.5 مل أو 1.5 مل) | Eppendorf | ||
| : 10-100 & micro ؛ ل, 50-200 & ل و 100-1,000 ؛ ومايكرو. ل | Eppendorf | ||
| AFM مع خلية سائل يتم التحكم في درجة حرارتها ( على سبيل المثال < / em> MFP-3D مع BioHeater) | Asylulm Research ، ناتئ سانتا باربرا | ||
| ناتئ SiN الناتئ ، مصنوع عادة من نيتريد السيليكون (SiN) (ثابت زنبركي أقل من 100 pN / نانومتر ، <م > على سبيل المثال < / م > MLCT) بروكر | AXS ، سانتا باربرا |
المراجع
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
