يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة

7.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52460

⸱

فبراير 17, 2015

 , 
1Cardiovascular Research Institute, University of California

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة طريقة لإحداث إصابة ميكانيكية في الأجنة في أسماك الزرد. يوفر نموذج الإصابة هذا منصة لدراسة الإرقاء والالتهابات المرتبطة بالإصابة والتئام الجروح في كائن حي مناسب بشكل مثالي للفحص المجهري في الوقت الفعلي.

الملخص

أثبتت أجنة

Zebrafish (Danio rerio) أنها نموذج قوي لدراسة مجموعة متنوعة من عمليات النمو والمرض. يجعل التطور الخارجي والشفافية البصرية هذه الأجنة قابلة بشكل خاص للفحص المجهري ، وتتوفر العديد من الخطوط المعدلة وراثيا التي تصنف أنواعا معينة من الخلايا ببروتينات الفلورسنت ، مما يجعل جنين الزرد نظاما مثاليا لتصور تفاعل الأوعية الدموية ومكونات الدم وأنواع الخلايا الأخرى أثناء الإصابة والإصلاح في الجسم الحي. تم تطوير علم الوراثة الأمامي والعكسي في أسماك الزرد بشكل جيد ، ويمكن التلاعب الدوائي بذلك. نصف نموذج إصابات الأوعية الدموية الميكانيكية باستخدام تقنيات المعالجة الدقيقة التي تستغل العديد من هذه الميزات لدراسة الاستجابات لإصابة الأوعية الدموية بما في ذلك الإرقاء وإصلاح الأوعية الدموية. باستخدام مزيج من الفحص المجهري بالفيديو والفواصل الزمني ، نوضح أن هذه الطريقة لإصابة الأوعية الدموية تؤدي إلى استجابات قابلة للقياس وقابلة للتكرار أثناء الإرقاء وإصلاح الجروح. توفر هذه الطريقة نظاما لدراسة إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها بالتفصيل في نموذج حيواني كامل.

المقدمة

تم استخدام أسماك الزرد على نطاق واسع لدراسة مجموعة متنوعة من الموضوعات في بيولوجيا الأوعية الدموية ، بما في ذلك تطور الأوعية الدموية ، وتكوين الأوعية الدموية ، وتطور المكونة للدم وعلم الأمراض1-3. تطور الأجنة دورة وظيفية بالإضافة إلى الكريات البيض والمكونات الأخرى للجهاز المناعي الفطري بيوم واحد بعد الإخصاب (dpf) 1،4،5. إن الحفاظ على الاستجابة الالتهابية والكريات البيض للإصابة جعل جنين الزرد نموذجا إعلاميا لعمليات التهابية متنوعة مثل عدوى السل والتهاب الأمعاء والقولون وتجديد الأنسجة6-9. تم استخدام أجنة أسماك الزرد لدراسة الالتهاب المرتبط بالإصابة خاصة في سياق الجرح الظهاري واستجابة العدلات10،11. تؤدي إصابة الجنين إلى استجابة خلوية محفوظة للغاية من الخلايا الموجودة في موقع الإصابة والخلايا المناعية الفطرية المجندة للاستجابة للإصابة وتنظيم قرارها11،12. استخدمت نماذج الإصابات الأخرى نبضات الليزر المركزة لتحديد موقع الإصابة مكانيا لأنواع معينة من الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية وخلايا العضلات وخلايا عضلة القلب13-15.

تم استخدام أجنة أسماك الزرد كنموذج لدراسة الإرقاء والتخثر في ظروف التلاعب الدوائي والجيني ، باستخدام كل من تكوين الجلطة الميكانيكية والليزر16-19. يبدو أن مكونات سلسلة التخثر محفوظة جيدا وقد سمحت الجينات المعدلة وراثيا بإجراء دراسات مفصلة لترسب الصفيحات والفيبرين في موقع التخثر17،20،21. يكمل الإجراء المقدم في هذه الورقة هذه الأساليب من خلال توفير نظام لدراسة إصابة الأوعية الميكانيكية التي تؤدي إلى اختراق السفينة وتشكيل الجلطة وحلها وإصلاح السفينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وتمت الموافقة على إجراءات باستخدام الزرد التي كتبها المؤسسي رعاية الحيوان UCSF واللجنة الاستخدام: ملاحظة.

1. إعداد أدوات

  1. إدراج التفاصيل التافهة دبوس إلى حامل دبوس المشبك ودبوس.
  2. باستخدام ملقط غيض غرامة، وثني بعناية غيض من دبوس لخلق هوك طفيف.
  3. للتلاعب واستقرار الجنين أثناء الإصابة، ثني نهاية 28 GUAGE ½ بوصة إبرة شنت على حقنة الأنسولين باستخدام كماشة الإبر الأنف.

2. إعداد الزرد الأجنة للإصابة

  1. إعداد أزواج تربية الزرد وجمع البيض في الماء البيض (60ug / مل الأملاح الحوض) كما هو موضح سابقا (22).
  2. إضافة 0.003٪ N-الفنيل (PTU) إلى الماء البيض عندما الأجنة ما يقرب من 8 ساعات ما بعد الإخصاب (HPF) لمنع التصبغ.
  3. Dechorionate اثنين الإخصاب آخر يوم (إدارة الشرطة الاتحادية) الأجنة قبل التجربة باستخدام ملقط غيض غرامة.
    ملاحظة: الأجنة يمكن إصابة أي وقت بعد بدء التداول. البيانات المعروضة هنا هي لمدة 2 DPF الأجنة، ولكن تم تطبيق هذه التقنية بنجاح في الأجنة تصل إلى 5 DPF.
  4. تخدير الأجنة مع 0.02٪ مخزنة حامض 3-أمينوبنزويك (تريكين) حوالي 10 دقيقة قبل التلاعب.

3. السفينة الميكانيكية إصابة الأجنة

  1. نقل الأجنة تخدير إلى شريحة الاكتئاب على stereomicroscope تشريح باستخدام الماصة نقل.
  2. استخدام الجانب المسطح قصيرة من إبرة حقنة لمعالجة الجنين مع اليد المهيمنة، ضع الجنين على جانبها مع السطح البطني تواجه بعيدا عن إبرة.
  3. وضع دبوس التفاصيل التافهة مع طرف وأشار مباشرة ضد السطح البطني للالخلفي الأسماك لافتتاح البولي التناسلي. وضع دبوس التفاصيل التافهة في زاوية طفيف بحيث غيض المنحني قادر على يخترق من خلال محيط بالأدمة مباشرة في الوريد الذيلية (الشكل 1 </ قوي>).
  4. باستخدام إبرة حقنة لمعالجة الجنين، يخترق الوريد الذيلية مع دبوس التفاصيل التافهة من خلال الاستفادة من الجنين إلى دبوس لربط قليلا من دبوس في الوريد.
  5. باستخدام إبرة حقنة، وسحب الجنين بعيدا عن دبوس التفاصيل التافهة لخلق تمزق صغير في السفينة.
    ملاحظة: سوف اصابة ناجحة تؤدي إلى نزيف فوري من الوريد.

4. تحليل الإرقاء

  1. اختيار الأجنة الوحيدة مع تعميم واضح خلايا الدم لهذا الإجراء.
  2. الاستعداد لبدء الموقت في أقرب وقت يتم سحبها دبوس التفاصيل التافهة من السفينة.
  3. بدء موقت في أقرب وقت فقدان الدم يمكن تصور من الجرح. عندما فقدان الدم من الجرح تتوقف، إيقاف الموقت وتسجيل الوقت الإجمالي كما نزيف الوقت. إذا تخثر هو تحول دون، تسجل الوقت إلى حين لم يعد هناك بشكل واضح خلايا الدم.

5. تحليل التئام الجروح

  1. نقل نقاط البيعالحيوانات تي إصابة على أطباق التصوير الزجاج السفلي للفحص المجهري.
  2. إزالة الغالبية العظمى من المياه البيض.
  3. تغطية الأجنة في 0،3-1،2٪ انصهار منخفضة المنحل الاغاروز في الماء البيض، ساخنة إلى ما بين 42 و 45 درجة مئوية وتستكمل مع 0.02٪ تريكين.
  4. الأجنة الموقف على الجانبين باستخدام ملقط.
  5. بعد يبرد الاغاروز، وملء الطبق مع 0.02٪ تريكين في الماء البيض.
  6. الحصول على صور باستخدام brightfield، epifluorescence، أو المجهري متحد البؤر.
  7. إزالة الجنين من الاغاروز باستخدام ملقط ونقل مرة أخرى إلى المياه البيض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تنفيذ إصابة سفينة الميكانيكية في 2 DPF الأجنة (الشكل 2A - C). النتائج إصابة في استجابة سريعة وموثوق بها تخثر مقاسا الوقت لوقف النزيف (الشكل 2D). لتحديد ما إذا كان الاختلاف في الاستجابة التخثر يمكن قياسها، كانت تدار من هيرودين تخثر إلى الأجنة عن طريق الحقن في القناة كوفييه على الفور قبل اصابة (5-10 NL من 1 وحدة لكل ميكرولتر هيرودين المذاب في الماء) (لل مظاهرة من الحقن في القناة كوفييه، انظر المادة السابقة إن الرب 23) 24.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد استخدمت بنجاح الزرد كنموذج لأنواع مختلفة من الجروح بما في ذلك الضرر الليزر 13-15، التي يسببها الليزر تخثر 16، والظهارية اصابة 10. نحن التقرير وسيلة لإصابة الميكانيكية التي هي بسيطة لتنفيذ وتنتج الإصابة التي تسيطر عليها في نموذج في الجسم الحي التي هي قابلة للغاية لفي الوقت الحقيقي المجهري. النتائج إصابة في رد مرقئ سريعة وقابلة للقياس وبرنامج إصلاح الجرح استنساخه التي يمكن رصدها باستخدام الفيديو وtimelapse المجهري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورين ستيفن ويلسون وليزا ويلسباخر على المناقشات المفيدة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل HL054737 المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دبابيس دقيقةأدوات العلوم الدقيقة26002-10قطر الطرف 0.0125 مم ، قطر القضيب 0.1 مم
حامل الدبوسأدوات العلوم الدقيقة26016-12
Dumont # 5 ملقط طرف ناعمأدوات العلومالدقيقة 11254-20
شريحة الاكتئاب الزجاجيالبيئية المائيةM30
ذوبان منخفض AgaroseLonza   ؛50081مسخن مسبقا إلى 42 & ordm; C
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma AldrichP7629
3-aminobenzoic acid (Tricaine)Sigma AldrichE10521
HirudinSigma AldrichH7016
أطباق التصوير ذات القاع الزجاجيMattekP35G-1.5-14-C
المجهرأوليمبوسSZH10
المجهر الفلوريZeissAxio Observer
أملاح حوض السمكحقنة الأنسولين المحيطية
الفورية مع إبرة 28.5 جرامBecton Dickinson 329461
الأنظمة تشريح

المراجع

  1. Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684(2012).
  2. Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
  3. Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
  4. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
  5. Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
  6. Lieschke, G. J., Trede, N. S. Fish immunology. Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).
  7. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
  8. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
  9. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  10. LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Inflammation and wound repair. Semin Immunol. , (2014).
  11. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  12. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  13. Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
  14. Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351(2013).
  15. Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
  16. Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. Laser-induced thrombosis in zebrafish. Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).
  17. Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682(2013).
  18. Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
  19. Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
  20. Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
  21. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  23. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
  24. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).
  25. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
  26. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  27. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  28. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  29. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48(2007).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
  32. Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
  33. Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.