مقالة منهجية

تتبع الماوس نخاع العظم وحيدات في فيفو

DOI:

10.3791/52476

⸱

فبراير 27, 2015

 ,  ,  , 
1Centre d'Immunologie et des Maladies Infectieuses (CIMI), INSERM, U1135, CNRS, ERL 8255, Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CR7

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الوحيدة هي المنظمين الرئيسيين للمناعة الفطرية وتلعب دورا مهما في تجديد نظام البلعمة أحادي النواة المحيطي وفي حالة الالتهاب. تصف هذه المخطوطة إجراء التصوير في الوقت الفعلي لنخاع عظم كالفاريا للفأر لدراسة آلية تعبئة الخلايا الوحيدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يوفر التصوير متعدد الفوتون في الوقت الفعلي

فرصة رائعة لدراسة تهريب الخلايا والتفاعلات من خلية إلى خلية في بيئتها الفسيولوجية ثلاثية الأبعاد. تعتمد الأنشطة البيولوجية للخلايا المناعية بشكل أساسي على قدراتها الحركية. الخلايا الوحيدة في الدم لها نصف عمر قصير في مجرى الدم; تنشأ في نخاع العظام ويتم إطلاقها منه. في الحالة الالتهابية ، يتم تعزيز هذه العملية ، مما يؤدي إلى كثرة الدم والتسلل اللاحق للأنسجة الالتهابية المحيطية. يعد تحديد الأحداث الميكانيكية الحيوية التي تتحكم في تهريب الخلايا الوحيدة من نخاع العظام باتجاه شبكة الأوعية الدموية خطوة مهمة لفهم الأهمية الفيزيائية المرضية للخلايا الوحيدة. أجرينا تصويرا بفاصل زمني في الجسم الحي عن طريق الفحص المجهري ثنائي الفوتون لنخاع عظم الجمجمة للفأر Csf1r-Gal4VP16 / UAS-ECFP (MacBlue). يعبر ماوس MacBlue عن بروتين الفلورسنت السماوي المعزز (ECFP) تحت سيطرة محفز خاص بالنخاع 1 ، بالاشتراك مع وضع العلامات على شبكة الأوعية الدموية. نصف كيف يمكن هذا النهج من تتبع الخلايا الوحيدة النخاعية الفردية في الوقت الفعلي لتحديد سلوك الهجرة داخل حمة نخاع العظم والأوعية الدموية ، بالإضافة إلى التفاعلات من خلية إلى خلية. يوفر هذا النهج رؤى جديدة حول بيولوجيا المجموعات الفرعية أحادية نخاع العظام ويسمح بمعالجة كيفية تأثر هذه الخلايا في حالات مرضية محددة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب نخاع العظم دورا مركزيا في تكون الدم ويمثل الخزان الرئيسي للخلايا الوحيدة التي تعيد تدويرها بشكل أساسي بين الدم والحمة النخاعية ، وتجدد مجموعة الخلايا الوحيدة المنتشرة ذات العمر القصير 2,3 وتشارك في إعادة تكوين أنسجة الحالة المستقرة - البلاعم والخلايا المتغصنة 4. أثناء الالتهاب أو بعد التنسج العابر ، يتم تعبئة الخلايا الوحيدة بنشاط إما من نخاع العظم أو الطحال 5 و 6 و 7 واستعمار الأعضاء الملتهبة. تم إشراك العديد من محاور الجاذب الكيميائي في عملية تعبئة الخلايا النخاعية من نخاع العظم 8 ، 5 ، 6،9. خارج الحيز النخاعي ، يعد نخاع العظم أيضا موقعا مهما لتحضير الخلايا الليمفاوية التائية 10 ومكانا للذاكرة المناعية 11،12. وبالتالي ، فإن هذا النسيج أساسي للعديد من التحقيقات في مجال أمراض الدم والمناعة. تنشأ معرفتنا بالتنظيم الهيكلي للخلايا النخاعية النخاعية بشكل أساسي من تحليل القسم النسيجي للأنسجة الثابتة 13. لا تسمح هذه النظرة الثابتة بدراسة ديناميكية التبادل الخلوي بين الأجزاء المختلفة لنخاع العظام ، والتي هي أساس نشاطها الوظيفي.

يشكل التصوير داخل الحيوية < p class = 'jove_content'> مدخلات بيولوجية مهمة في دراسة حركة الخلية ، والالتزام بالخلايا والتفاعلات من خلية إلى أخرى ، والتي تم وصفها سابقا فقط من الأنظمة المختبرية. تشمل التحديات التقنية للتصوير السليم داخل الحيوية القدرة على الوصول إلى الأنسجة ذات الأهمية من وجهة نظر بصرية ، وتعظيم عزلتها عن الانقباضات الفسيولوجية (التنفس أو العضلات أو الانقباضات التمعجية) أو الانجرافات الميكانيكية (اضطراب الأنسجة وتمددها بعد الجراحة ، والتعرض لأهداف المجهر بالإضافة إلى اضطرابات درجة الحرارة والأوعية الدموية / الأكسجين). قد تحد الانجرافات المجهرية من القدرة على الحفاظ على التركيز لفترة طويلة ويمكن أن تقدم القطع الأثرية في القياس الكمي لحركة الخلية. أحد البدائل ، التي تم التحقق من صحتها للعديد من الأنسجة لتقليل هذه الصعوبات التقنية ، هو العمل على الأنسجة المزروعة المحتضنة في وسط بالحرارة والأكسجين. ومع ذلك ، قد يكون الاضطراب الكامل للدورة اللمفاوية والأوعية الدموية مشكلة. التصوير داخل الحياة لنخاع عظم الجمجمة له العديد من المزايا المتعلقة بهذه القضايا. أولا ، يتطلب الحد الأدنى من الإجراءات الجراحية. ثانيا ، يسمح سمك العظم في هذه المنطقة بالتصور المباشر لمنافذ نخاع العظام دون تآكل ، وبالتالي تقليل الاضطرابات الفسيولوجية. يمكن تصوير الشبكة النخاعية في المنطقة الطفيلية للعظم. ومع ذلك ، تكون الجيوب الأنفية أكثر وضوحا في المنطقة الجبهية الجدارية حيث تكون مصفوفة العظام أرق12،14.

يعتمد التصوير داخل الحيوية على توافر أدق مراسل فلورسنت يضع علامات على السكان المعنيين. أدى وضع العلامات في المختبر على مجموعة الخلايا المنقاة قبل النقل بالتبني إلى توصيف مهم لمنافذ الخلايا الجذعية المكونة للدم 15 أو المجالات الدقيقة البطانية لنخاع العظم لصالح نقش الورم 16 ، وقدم العديد من المدخلات الأساسية حول المفاهيم الأساسية في علم المناعة 17. ومع ذلك ، يتطلب هذا النهج عادة مئات الآلاف من الخلايا للحصول على فرصة لاكتشافها بعد ذلك في الجسم الحي. يمكن تفسير ذلك من خلال ارتفاع معدل الوفيات بعد التلوين ، والتخفيف في الجسم كله والتغيير في حالة التنشيط ، مما قد يؤدي إلى توجيه متحيز. يتغلب وضع العلامات الذاتية من نظام الفأر المعدل وراثيا على هذه القيود بشكل كبير وسمح بتصوير سلوك بانيات العظم الداخلية 8 أو الخلايا الضخمة 18 أو المجموعات الفرعية النخاعية 6. ومع ذلك ، يجب على المرء توخي الحذر عند النظر في خصوصية مراسل الفلورسنت بين المجموعة الفرعية المدروسة.

Csf1r-Gal4VP16 / UAS-ECFP ، المسمى MacBlue mouse 1 ، هو نظام معدل وراثيا قيم لدراسة الخلايا الوحيدة النخاعية مع التصوير في الوقت الفعلي 6. الحقن الوريدي للرودامين ديكستران عالي الوزن الجزيئي يميز الحمة النخاعية عن الشبكة الجيبية الوعائية لنخاع العظام. باستخدام هذا النهج ، من الممكن تتبع سلوك الخلايا الوحيدة في مقصورات النخاع المختلفة في سياق فيزيولوجي مرضي محدد ذي أهمية. علاوة على ذلك ، نقترح استراتيجية إضافية لمقارنة ديناميكيات الخلايا الوحيدة مع ديناميكيات العدلات من خلال وضع العلامات في الجسم الحي باستخدام جسم مضاد معين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجربة من قبل اللجنة تجارب على الحيوانات والأخلاق الفرنسية والتحقق من صحتها من قبل "حماية خدمة آخرون سانتيه Animales، للبيئة" مع عدد A-75-2065. ويتم اختيار عينة الأحجام لضمان استنساخ التجارب، وفقا ل3R التنظيم أخلاقيات الحيوان.

1. إعداد الماوس

  1. التخدير
    1. لفترة قصيرة من التصوير (أقل من 1 ساعة)، تخدير الماوس مع حقنة داخل الصفاق من 200 ميكرولتر من محلول ملحي يحتوي على الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ).
    2. بدلا من ذلك، لفترة أطول من التصوير (تصل إلى 4 ساعات)، تخدير الماوس مع استنشاق الأيزوفلورين 2.5٪ المتبخرة في 70/30 خليط من O 2 / N 2 O، من خلال قناع تكييفها.
    3. ملاحظة: توفر هذه الطريق لفقدان الوعي أكثر استقرارا ويتجنب التسلسلي حقن داخل الصفاق من المخدرات.
    4. مرة واحدة يتم تخدير الماوس، تحقق من فقدان الوعي من خلال تحفيز لوحة القدم مع كماشة.
  2. تلطيخ الأوعية الدموية / تلطيخ إضافية
    1. لتلطيخ الأوعية الدموية: حقن عن طريق الوريد في الوريد الذيل، 200 ميكرولتر من Rhodamin-ديكستران (2 نجمة داود الحمراء، و 10 ملغ / مل في المخزن المالحة).
    2. لالعدلات تلطيخ: حقن 2 ميكروغرام من Ly6G-PE (استنساخ 1A8) في 100 ميكرولتر من محلول ملحي في الوريد في الوريد الذيل.
  3. تجميد
    1. لتجميد، واستخدام حامل المجسم العرف تتكيف مع المجهر وإلى نشوق الغاز مخدر.
      ملاحظة: حامل sterotactic هو دعم المعدن مع اثنين من الأقواس لوحة معدنية، واحد يجري الثابتة والأخرى القابلة للنقل وقابلة للتكيف، لتشديد رأس الحيوان.
    2. تثبيت رأس الفأر بين لوحات الاحتفاظ لضمان بمعزل عن الحركات التنفس. تشديد آذان بين الإبقاء على لوحات ورئيس لتمتد كورونافي تحقق الاستقرار والرفاه في التنفس من الحيوان.
  4. إزالة فروة الرأس
    1. استخدام بعناية الايثانول 70٪ لترطيب الشعر من فروة الرأس مع قضيب المعقم، وتجنب ملامسة العينين.
    2. قطع الجلد مع مقص العقيمة وكماشة لإزالة بشكل كامل فروة الرأس من الخلف من العظم الجداري حتى العظم الجبهي. الابتعاد تصل إلى 3 ملم من عيون وآذان لمنع النزيف واسعة النطاق. إزالة النسيج الضام فضفاضة تغطي الجمجمة (السمحاق). تغسل الشعر المتبقية مع دافئة منشفة ورقية PBS غارقة.
  5. تعيين نظام الغمر يصل
    1. لصق حلقة مطاطية من 18MM قطر مع الغراء الجراحية مباشرة على الجمجمة باستخدام إبرة قياس صغيرة للتحكم في التوزيع. الغراء محيط كامل من الحلبة المطاطية لمنع تسرب (يجب أن يكون 30 ميكرولتر كافية).
    2. تنظيف الجمجمة تحت الحلبة للمرة الأخيرة مع منشفة ورقية PBS غارقة ثم قم بإضافة 37 درجة مئوية برنامج تلفزيوني لمدة الغمر الكامل للالجمجمة. إضافة قطرة من كلوريد الصوديوم حل 0.9٪ أو مرهم للعين بشكل خاص على كل عين من الفأرة لتجنب جفاف العين. اسحب حامل المجسم في إطار الهدف.
    3. وضع حوالي مجال استخدام بصري المجهر من خلال نقل مباشر.

2. ثنائي الفوتون اقتناء التصوير

  1. استخدام المجهر multiphoton إلى جانب وجود تي: ليزر الياقوت الكريستال، والتي توفر 140fs نبضات من ضوء الجرد الوطني، الانضباطي بشكل انتقائي من 680 إلى 1،080 نانومتر، والمغير صوتية البصرية للسيطرة على قوة الليزر. استخدام تكوين بينهم 3 كاشفات الخارجية غير descanned (NDD) (أن تمكن من تسجيل وقت واحد من 3 قنوات الفلورسنت) مع مزيج من 2 المرايا مزدوج اللون (565 نانومتر و 690 نانومتر)، 565/610 500/550 ومرشحات ممر الموجة، و 485 قصيرة تمرير مرشح، مع امزيغ خطة × 20 (NA = 1) الهدف الغمر بالماء.
  2. تعيين غرفة التدفئة للسماح ثبات الحرارة الجيد للanaesالماوس thetized.،
    يمكن ضبط درجة الحرارة 1 ساعة قبل جلسة التصوير للاستقرار أفضل: ملاحظة. في حالتنا، تم اختيار 32 ° C للحصول على درجة حرارة الجسم المثلى من الفأرة مخدرة (36-37 ° C) ويتم الحفاظ تصل إلى 4 ساعة. هذه الحرارة يمكن أن تتكيف مع النظام المستخدم (التحقيق الرقمي يمكن استخدامها للتحقق من هذه النقطة). وبالإضافة إلى ذلك، وغرفة التدفئة المستخدمة مظلمة / أسود، ويغطي جزء من نظام (الأهداف والآلية لوحة) لتجنب تلوث الضوء الخارجي.
  3. تشغيل النظام
    1. بدوره على تي: ليزر الياقوت، ثم نظام المجهر كله. إطلاق برنامج الاستحواذ. تعيين نطاق الطول الموجي الليزر إلى 870 نانومتر. حدد NDD المناسب للتسجيل.
      ملاحظة: في حالتنا، تم الكشف عن الجيل الثاني التوافقي (SHG) 19 و السماوي البروتين الفلوري (ECFP) من قبل NDD بعد 485 قصيرة تمرير مرشح. تم الكشف عن ECFP أيضا NDD بعد الكشف عن مرشح 500/550 ممر الموجة وrhodamin-ديكستران التي كتبها tانه NDD بعد تصفية 565/610 ممر الموجة.
  4. ضبط إعدادات اكتساب
    1. استخدام "اكتساب العيش" قيادة التصوير من البرنامج وباستخدام جهاز التحكم اتجاهي المجهر، وضبط التركيز على المنطقة مع ECFP ورودامين الإشارة. تعيين قوة الليزر إلى الحد الأدنى للحصول على نسبة أفضل إشارة إلى الضوضاء مع الحد الأدنى من الصور الضرر.
      ملاحظة: الإعداد الطاقة المستخدمة تختلف وفقا لعمق المنطقة من الفائدة. وعادة ما يتم تعيين إعدادات AOM حوالي 20٪، وهو ما يمثل قوة الليزر وراء هدف حوالي 15 ميغاواط. فمن الأفضل لزيادة الطاقة مكاسب على هذه الفرق لكل NDD للحد من الصورة تبيض والصور والضرر. ضبط اكتساب النموذجية هي المسح واحد مع الوقت بكسل يسكن 1.58 ميكروثانية، وقرار من 512 × 512 بكسل مع التكبير 1.5.
  5. حدد المناطق ذات الاهتمام
    1. مرة واحدة يتم تعيين المعلمات التسجيل، استخدام مرة أخرى "العيش" القيادة الاستحواذ،ومسح الأنسجة لاختيار المطلوب (س، ص، ض) ميدانية لرصد في الوقت الحقيقي.
      ملاحظة: عادة، اخترنا حقل بما في ذلك الأوعية الدموية والمناطق متني.
    2. تسجيل الميدان مع "الموقف" القيادة البرمجيات.
      ملاحظة: هذا الأمر يستظهر X، Y، Z من الإحداثيات حقول بعيدة مختلفة.
    3. اختيار وتسجيل حقول إضافية من الفائدة (إلى 3) باستخدام نفس الإجراء.
    4. تعيين 3D ض المكدس مع "ض المكدس" القيادة البرنامج على المركز الأول يحفظون وفقا لحجم المطلوبة مع التكبير الذي تم اختياره. حفظ الموقف أعمق أولا، ثم أعلى منصب. تطبيع قوة الليزر مع العمق.
      ملاحظة: للحصول على عدة التصوير الحقل يصاحب ذلك، ونحن الحصول 5 شرائح مفصولة 3 ميكرون ض الخطوات لكل حقل للحصول على حجم 12 ميكرون سمك. يمكن تكييف هذه الإعدادات إلى نوع من الخلايا التي تمت دراستها.
  6. اكتساب إطلاق
    1. حدد220؛ وقت سلسلة "القيادة البرمجيات واختيار مدة الفاصل الزمني وعدد من الدورات. تبدأ الوقت الفاصل بين التصوير وفقا لمرور الوقت والمدة المطلوبة عن طريق اختيار "تبدأ تجربة" القيادة البرمجيات.
      ملاحظة: في حالتنا، ونحن الحصول مجلد واحد كل 30 ثانية خلال 60 دورة يمثلون 30 دقيقة في الوقت الحقيقي. أصغر الفاصل الزمني لا يمكن أن يؤديها على المسار السريع المتداول خلية في الأوعية الدموية. في هذه الحالة أرق ض المكدس وليس أكثر من 2 مجالات مختلفة يمكن تسجيلها في نفس الوقت.
    2. الرصد المنتظم لمجموعة لأعلى.
      1. دائما رصد الحيوانات للتأكد من أنه فاقد الوعي.
        ملاحظة: المصافحة من شعيرات أو أرجل الحيوان هي مؤشرات انتعاش. في حالة التنفس الحيوان هو متشنج، وكمية من الأيزوفلورين يمكن تخفيض قليلا. الانجراف الأنسجة قويا خلال الاستحواذ هو مؤشر الماوس إحياء.
      2. ضمان الهدف هو مغمورة بشكل صحيح. تجديد 37 ° C PBS بين:ن عمليتي استحواذ (30 دقيقة).
        ملاحظة: اختفاء التدريجي للإشارة خلال الاستحواذ هي مؤشر على تسرب PBS.
  7. نهاية الداخلي
    1. مرة واحدة يتم تسجيل الفيديو المطلوبة، الموت ببطء الحيوانية خلع عنق الرحم بسرعة قبل الانعاش.
      ملاحظة: التئام الجروح يؤدي إلى تشكيل جرب في 24 إلى 48 ساعة مما يحد من إمكانية لإجراء التصوير الطولي.

تحليل 3. البيانات

  1. تصحيح الانحراف
    1. استخدام Imaris Bitplane البرمجيات ل3D التتبع التلقائي.
    2. فتح تسلسل الصور 3D على Imaris. حدد "بقعة" الأوامر، وتوليد تتبع اليدوي (زر الماوس + التحول) لجميع نقاط زمنية مدة لا تقل عن 4 نقاط الربط المختلفة، إن أمكن توزيع متجانس في هذا المجال.
    3. تطبيق تصحيح الانحراف باستخدام قيادة "الانجراف الصحيح" في "تحرير المسار" علامة التبويب.
    4. التحقق من وجود ركان جودة التصحيح في X، Y وخاصة في ض لتجنب يرتعش مصطنع.
      ملاحظة: إذا كان التصحيح ليست مرضية، حاول نقاط الربط الأخرى أو استبعاد الفيديو من التحليل.
  2. تتبع الخلية
    1. استخدام "إضافة البقع الجديدة" القيادة وتحديد "النقاط المسار مع مرور الوقت" وضع خوارزمية. انتقل إلى الخطوة التالية.
    2. تطبيق الإجراء التلقائي تتبع الخلية إما على قناة كاملة من الاهتمام باستخدام "قناة المصدر" القيادة. مجموعة الكائنات (أي الخلايا) قطرها إلى 10 ميكرون. انتقل إلى الخطوة التالية.
      ملاحظة: سوف يتوقف الاختيار على التمييز بين الأشياء وخصوصية إشارة قياسها. وباختصار، التتبع التلقائي على قناة كاملة غير ممكن إلا إذا الكشف عن إشارة محددة إلى كائن من الفائدة. لأن الكشف عن كل من SHG وECFP من قبل NDD بعد تصفية 485 تمريرة قصيرة، سوف تتبع تكون أكثر تحديدا وكفاءة استخدام إشارة ECFP التي سجلتها NDD بعد 500/550 ممر الموجة المرشحات. متفاوت المسافات أو سوف الأجسام معبأة كثيفة تتطلب اليدوية مختارة من كائنات فردية مماثلة إلى الخطوة 3.1.2.
    3. حدد "جودة" نوع التصفية، تعيين عتبة لاستبعاد تتبع الأجسام غير محددة. انتقل إلى الخطوة التالية.
    4. اختيار "البراونية خوارزمية الحركة" مع المعلمات دقيقة من "ماكس المسافة" و "حجم الفجوة" بين اثنين من البقع. التحقق من صحة الجيل المسار الصحيح.
    5. مرة واحدة ويتم حساب المسارات تلقائيا، حدد "مدة المسار" نوع التصفية، تعيين عتبة للقضاء على مسارات أقصر من 120 ثانية (تمثل 4 نقاط الوقت).
    6. إلزامية: بعد التتبع التلقائي، والتحقق من جودة المسارات.
      1. انبسط شريط الوقت للتأكد من أن الكائنات تتبع مسارات المسار الصحيح. إذا لم يكن كذلك، استخدام خيارات التصحيح نقطة المسار المتوفرة في "تحرير" علامة التبويب: حذف مسارات خاطئة أو غير لائقة مع "حذف" الأمر (حذف أي مسار صoint بشكل فردي باستخدام قيادة "قطع"). إذا المسار المسار هو متقطع، إضافة نقاط الوقت المفقودة (زر الماوس + التحول)، وحدد كل نقاط على مسار معين، واستخدام "اتصال" القيادة في "تحرير المسار" علامة التبويب.
  3. المعلمات الكمي
    1. حدد "الاحصاء" علامة التبويب في "تفضيلات" القيادة، واختيار معلمات الحيوية التي تهم في القائمة. حدد "تصدير جميع الإحصاءات إلى ملف" القيادة وحفظ ملف اكسل ولدت.
      ويتم الحصول على العديد من معلمات الحيوية مباشرة من البرنامج مثل أطوال المسار، السرعة اللحظية، متوسط ​​السرعة، وتتبع استقامة: ملاحظة. الحركة معامل 6، 20 يمكن تحديد ولكن لم يتم توفير مباشرة من البرنامج.
    2. لكل خلية، وحساب متوسط ​​للنزوح عن كل فترة من الزمن (δt) (لمدة 30 ثانية الفاصل الزمني الفيلم، δt ستكون 30، 60، 90 ثانية، الخ).رسم متوسط ​​تشريد مربع بوصفها وظيفة من الفاصل الزمني. الحصول على معامل الحركة عن طريق حساب المنحدر من الخطية جزء من المنحنى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر الماوس هيكل الجمجمة فرصة جيدة لدراسة علم وظائف الأعضاء نخاع العظام بواسطة التصوير حيوي داخلي. العظام كونها رقيقة في جميع أنحاء المنطقة الأمامية الجدارية، فمن الممكن للوصول إلى منافذ medullar دون تآكل العظام. الشكل 1 يمثل حقل 2D واسعة من الجمجمة من الماوس المعدلة وراثيا MacBlue. وتتكون المصفوفة العظام أساسا من الكولاجين I بسهولة كشفها بواسطة SHG 19. حقن rhodamin-ديكستران بقع شبكة الأوعية الدموية من نخاع العظام ويسمح لتحديد منافذ نخاع العظام متني بين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النقاط الحرجة للفي الجسم الحي منهجية التصوير في ضمان الاستقرار في التركيز من أجل تحقيق أقصى مدة التصوير والتقليل من خطر التلوث الجرثومي والتهاب، والتي قد تؤثر على ديناميات الخلايا الالتهابية. التصوير من نخاع عظم الجمجمة يتبع هذه الأهداف كما أجريت عملية جراحية للوصول إلى نخاع العظم هو الحد الأدنى. استخدام المواد المعقمة والمطهرات أمر ضروري للحد من خطر العدوى التي يمكن أن تحفز اضطراب في توازن الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أود أن أشكر آن دارون وبيير لويس Loyher للحصول على المساعدة التحرير، وPlateforme IMAGERIE بيتييه-Salpêtrière (PICPS) للحصول على المساعدة مع المجهر ثنائي الفوتون ومرفق الحيوان "NAC" وكميل Baudesson بالنسبة للفئران تربية المساعدة. تلقت الأبحاث الرائدة لهذه النتائج بتمويل من البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) بموجب اتفاقية منحة رقم 304810 - الغارات، و n ° 241440-Endostem، من INSERM، من جامعة بيير وماري كوري "ظهور "من لا" الدوري الفرنسي مناهضة جنيه السرطان "، من" جمعية صب لا بحوث سور جنيه السرطان "ومن" الوكالة الوطنية للبحوث "ظهور برنامج عام 2012 (ANR-EMMA-050). وأيد PH التي كتبها la "الدوري الفرنسي مناهضة جنيه السرطان".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كيتامينميريال100 مجم / مل ، مخدر
زيلازينباير هيلث كير10 مجم / مل ، مخدر
إيزوفلورانباكستر2.5٪ ، مخدر
O2< / sub> / NO2< / sub>70/30 خليط ، مخدر
Rhodamin-DexterrnInvitrogen2 MDa ، 10 مجم / مل ، تلطيخ الأوعية الدموية
Ly6G-PEBecton-Dickinsonاستنساخ 1A8 ، تلطيخ العدلات
حامل التجسيميةالجراحةالمنزلية
الإيثانول 70٪جراحة
مقص معقم وجراحة كماشة
حلقة مطاطيةبقطر 18 مم ، جراحة
Glubran 2Queryo الغراء الجراحي الطبي، تثبيت الحلقة المطاطية
إبر قياس صغيرةTerumo
Zeiss LSM 710 NLO مجهر متعدد الفوتون كارل زايسمجهر
Ti: ليزر كريستال ياقوت  متماسكة الحرباء الترا140 نبضات fsec من ضوء NIR
Zen 2010Carl ZeissAcquistion
Software Imaris Bitplane Bitplane، تتبع تلقائي ثلاثي الأبعاد
PBS 1XD. جراحة Dutscher
غرفة حراريةكارل زايسالتصوير داخل الحياة
جراحة برنامج تحليل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
  2. Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
  3. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
  4. Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
  5. Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
  6. Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
  7. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  8. Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
  9. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
  10. Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
  11. Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
  12. Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
  13. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
  14. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
  15. Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
  16. Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
  17. Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
  18. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
  19. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
  20. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  21. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
  22. Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
  23. Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CSF1R

مقالات ذات صلة