مقالة منهجية

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

9.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52480

⸱

يناير 7, 2015

 ,  ,  , 
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

في هذه المقالة

ملخص

وينظم قدرة البطانة الملتهبة لتجنيد الكريات البيض من تدفق الخلايا اللحمية الوسيطة. وصفنا اثنين في المختبر نماذج دمج خلايا الإنسان الأساسية التي يمكن استخدامها لتقييم التوظيف العدلات من التدفق ودراسة الدور الذي تلعبه خلايا انسجة الوسيطة في تنظيم هذه العملية.

الملخص

خلايا انسجة تنظم توظيف تعميم الكريات البيض خلال الالتهاب من خلال عبر الحديث مع الخلايا البطانية المجاورة. نحن هنا وصف اثنين في المختبر "الأوعية الدموية" نماذج لدراسة توظيف تعميم العدلات من تدفق الخلايا البطانية الملتهبة. والميزة الرئيسية لهذه النماذج هي القدرة على تحليل كل خطوة في سلسلة التصاق الكريات البيض في النظام، كما أن تحدث في الجسم الحي. وصفنا أيضا كيف يمكن تكييفها كلا النموذجين لدراسة دور الخلايا اللحمية، في هذه الحالة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC)، في تنظيم تجنيد الكريات البيض.

كان المثقف الخلايا البطانية الأولية وحدها أو مع MSC الإنسان في اتصال مباشر على microslides Ibidi أو على طرفي نقيض من مرشح Transwell لمدة 24 ساعة. وقد حفزت الثقافات مع عامل نخر الورم ألفا (TNFα) لمدة 4 ساعة ودمجها في التصاق الفحص القائمة على التدفق. تم perfused لبلعة العدلاتعلى البطانة لمدة 4 دقائق. وقد تصور القبض على تدفق العدلات وتفاعلاتها مع البطانة التي على النقيض من المرحلة المجهري.

في كلا النموذجين، وزيادة خلوى التحفيز التوظيف البطانية العدلات تتدفق بطريقة تعتمد على الجرعة. وأظهر تحليل سلوك العدلات جند انخفاضا تعتمد على الجرعة في المتداول وزيادة تعتمد على الجرعة في التهجير من خلال البطانة. في ثقافة مشتركة، قمعت MSC العدلات التصاق لحفز TNFα البطانة.

لدينا نماذج المستندة إلى التصاق تدفق تحاكي المراحل الأولية لتجنيد الكريات البيض من التداول. بالإضافة إلى الكريات البيض، ويمكن استخدامها لدراسة توظيف أنواع الخلايا الأخرى، مثل MSC أو تعميم الخلايا السرطانية تدار علاجيا. وقد أظهرت لنا نماذج متعددة الطبقات المشارك الثقافة التي MSC التواصل مع البطانة لتعديل استجابتها لالسيتوكينات الموالية للالتهابات، alteriنانوغرام تجنيد العدلات. مزيد من الابحاث التي تستخدم مثل هذه النماذج هو مطلوب لنفهم تماما كيف الخلايا اللحمية من الأنسجة المختلفة والشروط (الاضطرابات الالتهابية أو السرطان) التأثير على تجنيد الكريات البيض خلال الالتهاب.

المقدمة

الالتهاب هو استجابة وقائية لالعدوى الميكروبية أو إصابة الأنسجة التي تتطلب تنظيم محكم من دخول الكريات البيض في والخروج من الأنسجة الملتهبة للسماح قرار 1،2. عبر الحديث بين الخلايا البطانية (EC) أن السفن خط الدم، الكريات البيض وتعميم خلايا انسجة الأنسجة المقيمين ضروري لتنسيق هذه العملية 3. ومع ذلك، والتوظيف غير المنضبط من الكريات البيض وإزالتها غير فعالة ركيزة تطور الأمراض الالتهابية المزمنة 4. فهمنا الحالي للتجنيد الكريات البيض في الصحة والمرض غير مكتمل وهناك حاجة إلى نماذج أكثر قوة لتحليل هذه العملية.

آليات دعم التوظيف من الكريات البيض من الدم من خلال الأوعية الدموية EC في الأوردة ما بعد الشعرية وقد وصفت جيدا 1،2،5. يتم التقاط الكريات البيض الدموية من خلال مستقبلات متخصصة (على سبيل المثال، VCAM-1، E-selectin، ف selectin) الذيوتصل ينظم على البطانة الملتهبة. هذه التفاعلات عابرة تسمح الكريات البيض للتفاعل مع سطح ملزمة كيموكينات وسطاء المشتقة من الدهون (إما البطانية أو اللحمية في الأصل) التي تنشط integrins التي أعربت عنها الكريات البيض 6- 11. وهذا بدوره استقرار التصاق ومحركات الهجرة عبر البطانة وإلى الأنسجة 12- 15. داخل الأنسجة، وتجنيد يتعرضون الكريات البيض إلى وكلاء المشتقة من انسجة التي تؤثر على الحركة والوظيفة والبقاء على قيد الحياة 16،17. أدلة متزايدة تشير بقوة إلى أن إشارات وردت في كل مرحلة من شروط عملية التوظيف الكريات البيض لالمقبل. ومع ذلك، فإن فهمنا للتجنيد الكريات البيض لا يزال غير مكتمل، والقليل جدا هو معروف عن حركة الكريات البيض مكونات تشكيل داخل الأنسجة.

في برمنغهام وضعنا عدة في المختبر "الأوعية الدموية" نماذج لدراسة تجنيد الكريات البيض منتدفق 9،18،19. ونحن نفهم الآن أن الأوعية الدموية فعل EC المنظمين المباشرة اعتبارا من تجنيد الكريات البيض الاستجابة للتغيرات في المكروية المحلية. على وجه التحديد، يمكن للخلايا انسجة الأنسجة مقيمة تنظيم بنشاط الاستجابة الالتهابية، في جزء منه عن طريق التحدث مع الأوعية الدموية EC المجاورة للتأثير على دورها في تجنيد 3. لقد أظهرنا سابقا أن الخلايا اللحمية مختلف تعدل قدرة EC لدعم التصاق وهجرة الكريات البيض بطريقة الأنسجة محددة، وأن هذه الآثار أصبحت تغير في الأمراض المزمنة 13،16،20،21. وهكذا، والخلايا اللحمية تضع الأنسجة "عنوان رموز" التي تحدد سياق كل استجابة التهابية 22. وفي الآونة الأخيرة، لقد أثبتنا أن النخاع العظمي المستمدة MSC (BMMSC) أكثر قدرة أسفل تنظيم استجابة EC لالسيتوكينات، مما يؤدي إلى انخفاض في توظيف كل من العدلات واللمفاويات 23.

آليات الموقع govتوضيح erning التوظيف في المختبر وتستخدم إلى حد كبير المقايسات تتضمن نوع واحد خلية (على سبيل المثال، EC) أو البروتين في عزلة. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات لا تأخذ في الاعتبار آثار البيئة الأنسجة المحلية (أي وجود خلايا انسجة) على تجنيد الكريات البيض وهجرتهم اللاحقة في الأنسجة. نحن هنا وصف طريقتين القائم على التدفق في الخلايا التي اللحمية، وتحديدا الوسيطة تنبع الخلايا (MSC)، هي شارك في تربيتها مع EC 23. مثل هذه النماذج تسمح لنا لدراسة تأثير الخلايا اللحمية على الاستجابات البطانية، ولا سيما قدرتها على دعم التوظيف الكريات البيض من التدفق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. العزلة والثقافة الابتدائي الخلايا البطانية الإنسان والوسيطة الخلايا الجذعية

  1. خلايا العزلة وثقافة الإنسان السري الوريد البطانية (HUVEC):
    1. وضع الحبل السري على صينية مع المناشف الورقية ورذاذ مع الايثانول 70٪. ضع في نسيج الثقافة هود. تحديد الوريد ويقني؛ يدخل القنية في كلا الجانبين. وضع الكابل التعادل قرب نهاية مقنى لضمان الحصول عليها.
    2. تغسل الدم الوريدي مع برنامج تلفزيوني باستخدام حقنة. ملء المحاقن مع الهواء ويمر عبر الوريد لإزالة وتجاهل PBS المتبقية.
    3. ذوبان الجليد 10 ملغ / مل نوع كولاجيناز الأولى أ وتمييع 01:10 في برنامج تلفزيوني (مع الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم) إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. تمرير الحل كولاجيناز في الوريد حتى تمتلئ كل من حقنة عادية. إغلاق المشابك على حقنة عادية في كلا الجانبين.
    4. تغطية صينية مع الأنسجة ورذاذ مع الايثانول 70٪. وضع الحبل في حاضنة لمدة 20 دقيقة عند 37 ° C وCO 2 5٪.
    5. خذ الحبل بهامن الحاضنة وتشديد العلاقات كبل. تدليك الحبل بلطف لمدة 1 دقيقة. طرد تعليق الخلية مع 10 مل PBS وجمع في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    6. ملء المحاقن مع الهواء ويمر عبر الوريد لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية مرتين، وجمع PBS في أنبوب الطرد المركزي 50 مل المستخدمة في الخطوة 1.1.5. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    7. نضح طاف و resuspend بيليه في 1 مل الكامل المتوسطة EC. EC المتوسطة يتكون من M199 تستكمل مع 35 ميكروغرام / مل كبريتات جنتاميسين، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة البشري، 1 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، و 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B، و 20٪ مصل العجل الجنين.
    8. إضافة 4 مل من EC المتوسطة وتعليق EC إلى 25 سم 2 قارورة. تغيير المتوسطة في اليوم التالي وبعد ذلك كل أيام 2.
    9. EC تبدي مثل الحصوه التشكل (الشكل 1Ai). لفحوصات التصاق، EC والمصنفة بشكل عام عندما تصل إلى 100٪ التقاء (انظر القسم 1.4 ).
  2. عزل الخلايا الجذعية الوسيطة جيلي وارتون (WJMSC) من الحبل السري الإنسان:
    1. عزل المستمدة من جيلي MSC ارتون (WJMSC) من الحبل السري جديدة أو من الحبال التي تم بالفعل تستخدم لعزل EC. قطع الحبل السري إلى 5 سم قطعة طويلة. قطع كل قطعة طوليا للكشف عن الأوعية الدموية (الشرايين 2 [أبيض، جامدة] و 1 الوريد [الأصفر، منتفخة]).
    2. باستخدام مقص العقيمة وملقط إزالة الأوعية الدموية وتجاهل. قطع جميع الأنسجة تصبح 2 - 3 مم 3 قطع. باستخدام ملقط مكان 2-3 ملم 3 قطع في أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    3. ذوبان الجليد 100 ملغ / مل نوع كولاجيناز الأسهم II وتمييع 1: 100 في 10 مل PBS إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. ذوبان الجليد 20،000 U / مل الأسهم هيالورونيداز وتمييع 1: 400 إلى تركيز النهائي من 50 U / مل في حل كولاجيناز.
    4. إضافة كوكتيل الأنزيمية إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على شظايا الأنسجة. احتضان fragmen الأنسجةTS لمدة 5 ساعة عند 37 ° C على محور دوار بطيئة.
    5. تمييع تعليق خلية 1: 5 في برنامج تلفزيوني. وضع 100 ميكرون فلتر المسام إلى 50 مل جديد أنبوب الطرد المركزي. صب تعليق الخلية على 100 ميكرون فلتر المسام.
      ملاحظة: باقي أجزاء الأنسجة سيتم الاحتفاظ على مرشح وسيتم جمع الخلايا في أنبوب 50ML أجهزة الطرد المركزي.
    6. تجاهل التصفية. الطرد المركزي تعليق خلية في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. نضح طاف و resuspend WJMSC بيليه في 12 مل الكامل مستنبت WJMSC (DMEM الجلوكوز منخفضا، و 10٪ FCS و 100 U / مل البنسلين + 100 ميكروغرام / مزيج الستربتومايسين مل).
    7. البذور جميع الخلايا في 75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة. تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة مع 12 مل الكامل مستنبت WJMSC. استبدال المتوسطة كل 2 - 3 أيام. خلايا ينبغي أن تصل إلى 70-80٪ التقاء في حدود 2 أسابيع. مرور عند WJMSC تصل 70-80٪ التقاء (انظر القسم 1.4).
  3. التوسع في العظام المستمدة من نخاع MSC (BMMSC):
    1. عزل الإنسان MSC المستمدة نخاع العظام (BMMSC) كما هو موضح سابقا 24. إضافة 10 مل قبل تحسنت المتوسطة النمو MSC (MSCGM) في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    2. ذوبان الجليد قارورة من P2 BMMSC عن طريق وضع في 37 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة. إضافة تعليق BMMSC إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على MSCGM. تخلط جيدا من قبل pipetting.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح طاف تماما.
    4. Resuspend الخلايا في 1 مل MSCGM وعد الخلايا باستخدام haemocytometer أو عداد الخلايا الرقمية مثل cellometer.
    5. خلايا البذور في 75 سم 2 قوارير الثقافة في كثافة 5،000 - 6،000 خلايا لكل سم 2 في 12 مل MSCGM. تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة مع 12 مل MSCGM. خلايا تغذية مع 12 مل MSCGM كل 2 - 3 أيام.
    6. مرور عند BMMSC تصل 70-80٪ التقاء (انظر القسم 1.4). خلايا يحمل مورفولوجيا أرومي ليفي (الشكل 1Aii).
  4. مفرزة من EC وMSC:
    1. نضح المتوسطة من 25 سم 2 قوارير الثقافة. إضافة 2 مل من EDTA 0.02٪ لحوالي 2 دقيقة. نضح EDTA وإضافة 2 مل التربسين (2.5 ملغ / مل). عرض تحت المجهر حتى تصبح الخلايا الجولة.
    2. اضغط على القارورة لفصل الخلايا. إبطال نشاط التربسين بإضافة 8 مل مستنبت (هذا يعتمد على نوع من الخلايا، EC المتوسطة لHUVEC، DMEM LG لWJMSC وMSCGM لBMMSC) إلى قارورة ثقافة ونقل تعليق لأنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نضح طاف و resuspend بيليه كما هو موضح أدناه.
      1. لالركض للجنة السلامة البحرية، بيليه resuspend في 3 مل الثقافة المتوسطة. إضافة 11 مل مستنبت إلى ثلاث قوارير ثقافة منفصلة 75 سم 2. إضافة 1 مل خلية التعليق على كل قارورة الثقافة (1: 3 تقسيم). WJMSC المرور وBMMSC 3 مرات (P3) قبل استخدامها في المقايسات شارك في الثقافة.
      2. لبذر EC أو MSC في المقايسات التصاق - راجع أقسام 2 و 3.
    4. MSC التجمد:
      1. في مرور 3 فصل MSC كما هو موضح في القسم 1.4. نضح وطاف resuspend في 3 مل الجليد الباردة CryoSFM. ماصة 1 مل aliquots من تعليق خلية إلى 1.5 مل cryovials الجليد الباردة. وضع cryovials في حاوية التجمد.
      2. تخزين الحاويات في -80 درجة CO / N. نقل إلى النيتروجين السائل. قارورة ذوبان MSC (اتبع الخطوات من 1.3.1 - 1.3.6). في resuspend MSC في 5 مل مستنبت (اختيار الوسيلة المناسبة لWJMSC أو BMMSC) والبذور إلى 25 سم 2 قارورة.

    2. إنشاء غشائي-الوسيطة الخلايا الجذعية المشارك الثقافات على Ibidi Microslides

    1. يعرض للتريبسين ومتموجة 25 سم 2 قارورة من EC (~ 1.5 × 10 6 خلايا؛ والقسم 1.4). في resuspend EC في 380 ميكرولتر MSCGM (1 × 25 سم 2 قارورة سوف البذور اثنين من 6 قنوات microslides Ibidi (~ 1.25 × 10 5 / قناة)، لفحوصات التصاق كل خلية تايعبوة يتم تربيتها في MSCGM). إضافة 30 ميكرولتر من EC التعليق على كل قناة (هذا سوف تغطي منطقة النمو من خلال العمل الشعري). احتضان Ibidi شريحة مجهرية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة.
    2. إضافة 140 ميكرولتر MSCGM إلى كل قناة وثم نضح تشغيله. كرر مرتين ليصبح المجموع 3 يغسل. إضافة 140 ميكرولتر MSCGM ووضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
    3. للمشاركة في الثقافات فصل MSC (القسم 1.4). إجراء تعداد خلايا باستخدام haemocytometer أو cellometer. ضبط تركيز MSC إلى 1.5 × 10 5 خلية / مل.
    4. نضح المتوسطة الزائدة من القنوات Ibidi (ولم يتبق سوى منطقة نمو القناة في المتوسط). إضافة 30μl من MSC تعليق على القنوات Ibidi. نضح المتوسطة أن طرد من منطقة نمو القناة وإضافة 30 ميكرولتر آخر من MSC تعليق. أكرر مرة أخرى ثم ضع شريحة مجهرية Ibidi في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 </ الفرعية> لمدة 1 ساعة.
    5. إضافة 140 ميكرولتر MSCGM إلى كل قناة وثم نضح تشغيله. كرر مرتين ليصبح المجموع 3 يغسل. إضافة الحجم النهائي من 140 ميكرولتر MSCGM إلى كل قناة ووضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
    6. ذوبان الجليد 1 × 10 5 U / مل الأسهم TNFα وتمييع 1: 1،000 في MSCGM إلى تركيز النهائي من 100 U / مل (أي ما يعادل ~ 10 نانوغرام / مل). إجراء التخفيف المتسلسل عن طريق تمييع 100 U / مل TNFα التي كتبها 01:10 في MSCGM للحصول على 10 U / مل. تمييع 10 U / TNFα مل من 1:10 في MSCGM الحصول على 1 U / مل.
    7. علاج قنوات مع TNFα عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات قبل الفحص. سوف التقلبات في درجات الحرارة خلال العلاج خلوى يغير أنماط التوظيف العدلات ملاحظتها. إضافة MSCGM جديدة لقنوات غير المعالجة.

    3. إنشاء غشائي-الوسيطة الخلايا الجذعية المشارك الثقافات على الفلاتر

    1. فصل WJ أو BMMSC كما هو موضح في القسم 1.4. resuspend الكريةفي 1 مل MSCGM. إجراء الخلايا خلايا باستخدام haemocytometer أو cellometer.
    2. ضبط مستوى الصوت بحيث التركيز النهائي هو 5 × 10 5 MSC في 500 ميكرولتر من MSCGM.
    3. باستخدام ملقط معقم عكس 6 جيدا، 0.4 ميكرومتر مرشحات PET Transwell ومكان في علبة معقم.
    4. البذور 5 × 10 5 MSC على السطح الخارجي للمرشحات. احتضان المرشحات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة.
    5. جمع وسائل الاعلام من السطح الخارجي للمرشح. حساب عدد غير ملتصقة MSC في وسائل الإعلام. إعادة عكس المرشحات باستخدام ملقط معقم ووضعه في مطابقة وحة 6 جيدا تحتوي على 3 مل MSCGM.
    6. إضافة 2 مل من MSCGM على السطح الداخلي للمرشح (الشكل 1B). وضع في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة. يعرض للتريبسين ومتموجة 25 سم 2 قارورة من EC (الشكل 1Ai؛ والقسم 1.4).
    7. و resuspend EC في 8 مل MSCGM (1 س 25cm 2 قارورة وايليرة لبنانية البذور أربع مرشحات 6 جيدا. ~ 5 × 10 5 EC / فلتر). نضح المتوسطة من أعلى وأسفل من المرشحات التي يسهل اختراقها. إضافة MSCGM 3 مل الطازجة في أقل غرفة (تحت التصفية). إضافة 2 مل EC تعليق على السطح الداخلي للكل مرشح. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
    8. نضح المتوسطة ليغسل غير ملتصقة EC واستبدال مع MSCGM الطازجة. إعداد موازية EC مرشحات أحادية الثقافة عن طريق بذر خلايا على السطح الداخلي دون الأولى MSC البذر. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
    9. تأكد من أن أحادي الطبقة EC هي متكدسة ويحتوي على أي ثغرات. الطبقات الوحيدة الفرعية متموجة لا يمكن أن تستخدم لفحوصات التصاق (الشكل 1B).
    10. علاج الغرف العلوية والسفلية من المرشحات مع 1 أو 10 أو 100 U / مل TNFα (أي ما يعادل ~ 10 نانوغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات قبل الفحص (الموصوفة في القسم 2).

    4. عزل الكريات البيضاء

    1. اتخاذ الوريديالدم من المتطوعين الأصحاء وقسامة على الفور في أنابيب EDTA. أنابيب عكس بلطف لخلط.
    2. طبقة 2.5 مل Histopaque 1077 على 2.5 مل Histopaque 1119 في 10 مل القاع جولة أنبوب. طبقة 5 مل الدم كله على التدرج Histopaque. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 40 دقيقة في RT.
    3. الحصاد العدلات المحيطية النوى (PMN) في واجهة Histopaque 1077 و1119 (فوق طبقة كرات الدم الحمراء). ضع في 10 مل القاع جولة أنبوب وجعل ما يصل إلى 10 مل مع PBSA. عكس بلطف أنبوب والطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    4. تمييع 7.5٪ BSA حل 1:50 في 100 مل PBS (مع الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم) إلى تركيز النهائي من 0.15٪ (ث / ت. PBSA). نضح وطاف resuspend في 10 مل PBSA. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    5. Resuspend في 1 مل PBSA. اتخاذ قسامة 20 ميكرولتر من تعليق خلية وإضافة إلى 380 ميكرولتر PBSA (01:20 تمييع). عد الخلايا باستخدام haemocytometer أو cellometer. تمييع للبغية دراسته واقراره المطلوبةntration (1 × 10 6 / مل للمرشحات Transwell وIbidi شريحة مجهرية) في PBSA. الحفاظ على تعليق العدلات في RT حتى الفحص.

    5. تجميع نظام تدفق

    1. إعداد نظام تدفق كما هو مبين في الشكل 1C. بدوره على سخان وتعيين إلى 37 درجة مئوية. نعلق حقنة 20 مل (إزالة الغطاس) وحقنة 5 مل إلى 3 في اتجاه الصنبور. إرفاق الصنبور إلى غرفة البرسبيكس باستخدام شريط من micropore.
    2. قياس وقطع قطعة طويلة من السيليكون 2/4 مم (سميكة) أنابيب أن ما يقرب المسافة بين صمام و3 في اتجاه الصنبور. قطع على 8-10 ملم قطعة طويلة من 1/3 ملم (رقيقة) أنابيب وتضاف إلى واحدة من نهاية الأنبوب سميكة. نولي الجانب أنابيب سميكة على 3 في اتجاه الصنبور.
    3. قم بتوصيل الطرف أنابيب رقيقة على ميناء من microvalve 3 في اتجاه الإلكتروني. هذا هو "خزان غسل". قطع 6-8 ملم قطعة طويلة من الأنابيب السراء والضراء.
    4. إدراج أنابيب رقيقة في واحدة من نهاية الأنبوب سميكة. توريمنظمة العمل ضد الجوع أنابيب سميكة تنتهي على حقنة 2 مل (إزالة الغطاس).
    5. قم بتوصيل الطرف أنابيب رقيقة من حقنة 2 مل على منفذ على microvalve الإلكترونية لجعل "عينة الخزان". ربط صمام إلى غرفة تدفق مرشح من خلال قياس وقطع قطعة طويلة من الأنابيب رقيقة وهذا هو المسافة بين microvalve ومركز للمرحلة المجهر.
    6. لنموذج شريحة مجهرية، إرفاق 8-10 ملم قطعة من أنبوب سميك إلى نهاية أنابيب رقيقة. وضع L على شكل موصل إلى نهاية أنابيب سميكة. وهذا الاتصال إلى شريحة مجهرية. لنموذج الترشيح، إرفاق 8-10 ملم قطعة من بورتكس الخط الأزرق المانومتر ربط أنابيب إلى نهاية أنابيب رقيقة.
    7. ضع نهاية أنابيب رقيقة على microvalve. هذا هو الإخراج المشترك للغسل وعينة الخزانات. ملء الخزانات مع PBSA. أنابيب الوزراء من قبل تتدفق PBSA من خلالهم لإزالة أي فقاعات الهواء.
    8. إرفاق المانومتر الأنابيب إلى 29 ملم (50 مل) الزجاج الصورةyringe. رئيس الوزراء حقنة عن طريق ملء مع 10 مل PBSA. عكس الحقنة بحيث نهاية متصلا أنابيب تواجه صعودا وطرد جميع فقاعات الهواء. الملء مع 5 مل PBSA.
    9. لنموذج شريحة مجهرية فقط، إرفاق 10-12 مم قطعة من أنبوب سميك إلى نهاية الأنبوب المانومتر مما يؤدي إلى الحقنة الزجاج. وضع L على شكل موصل إلى نهاية أنابيب سميكة. وضع حقنة زجاجية إلى ضخ حقنة للتسريب / الانسحاب.
    10. حساب معدل تدفق الملء (Q) المطلوبة لتوليد إجهاد القص الجدار المطلوب (τ ث في باسكال، باسكال) 0.1 (الفلاتر Transwell) با أو 0.05 (microslides Ibidi) با باستخدام الصيغ التالية:
      γ ث = (6.Q) / (WH 2)
      τ = n.γ
      حيث ث = الداخلي العرض وح = العمق الداخلي للقناة التدفق. ن = اللزوجة من الحل المتدفقة. PBSA هو ن = 0.7 mPa.s. لوحة تصفية موازية غرفة التدفق، والعرض (ث) 4 مم وعمق (ح) هو 0.133 ملم. دepth من الغرفة يمكن أن تختلف قليلا بسبب الاختلافات في سمك طوقا بارافيلم المستخدمة. لشريحة مجهرية Ibidi، والعرض هو 3.8 مم وعمق 0.4 مم.
      ملاحظة: نظرا للاختلافات في أبعاد قناة التدفق، وديناميات التقاط نستخدم الضغوط القص المختلفة لنموذج شريحة مجهرية مقارنة مع نموذج فلتر 6.

    6. إعداد لأعلى لوحة موازية غرفة تدفق دمج الفلاتر

    1. قطع قطعة من بارافيلم (نفس حجم ساترة الزجاج) باستخدام قالب معدني. قطع فتحة 20 × 4 مم في بارافيلم (لإنشاء قناة التدفق) باستخدام قالب معدني. استخدام طوقا للاحتفال قناة التدفق على ساترة الزجاج.
    2. محاذاة حواف فلتر 6 جيدا على ساترة الزجاج. تأكد من أن مرشح يغطي علامات قناة التدفق. قطع بعناية من مرشح باستخدام مشرط نوع 10A.
    3. تغطية بعناية فلتر مع طوقا بارافيلم، وضمان أن القناة تدفقفتحة في منتصف فلتر (1D الشكل). استخدام قطعة من النسيج نظيفة وطرد أي فقاعات.
    4. ضع ساترة في عطلة لوحة أسفل من الغرفة تدفق البرسبيكس. ضع أعلى لوحة البرسبيكس فوق الجزء العلوي من طوقا والمسمار لوحات معا (1D الشكل).
    5. تحويل 3 في اتجاه الصنبور للسماح غسل عازلة (PBSA) لتتدفق من خلال الصمام. ربط المانومتر أنابيب إلى ميناء مدخل من أعلى لوحة Persex. تشغيل PBSA من خلال قناة تدفق للسماح فقاعات بالمرور.
    6. قم بتوصيل أنابيب المانومتر من ضخ حقنة في منفذ منفذ لوحة البرسبيكس. تعيين ضخ حقنة لإعادة ملء وتشغيل الصحافة. تنظيف أي PBSA الذي يسيل على طبق العليا من الغرفة.
    7. ضع دائرة على مرحلة مجهر مقلوب على النقيض من المرحلة. ضبط التركيز على تصور EC فوق مرشحات (الشكل 1B).

    7. إعداد Microslides لتدفق

    1. ضع شريحة مجهرية على خشبة المسرح من المجهر النقيض من المرحلة المقلوب. قم بتوصيل موصل L على شكل بمنفذ مدخل قناة. تشغيل PBSA من خلال قناة التدفق.
    2. ضع L على شكل موصل من ضخ حقنة في منفذ مخرج القناة. تعيين ضخ حقنة لإعادة ملء وتشغيل الصحافة. تنظيف أي PBSA الذي يسيل على شريحة مجهرية. ضبط التركيز على تصور أحادي الطبقة EC.

    8. الإرواء من خلايا الكريات البيضاء أكثر من غشائي

    1. ضع 2 مل من العدلات المنقى إلى الخزان عينة وترك لتدفئة لمدة 2 دقيقة. غسل البطانة مع PBSA لمدة 2 دقيقة.
    2. تحويل صمام ON إلى يروي العدلات على البطانة. تقديم البلعة العدلة لمدة 4 دقائق. تحويل OFF صمام ويروي PBSA من الخزان غسل للفترة المتبقية من التجربة.
    3. التأكد من أن فقاعات الهواء لا تمر من خلال قناة تدفق في أي وقت خلال الفحص حيث سيؤدي ذلك إلى تعطيل monolay ECإيه والسبب مفرزة من العدلات ملتصقة.

    9. تسجيل العدلات التقاط والسلوك

    1. سجل العدلات التوظيف سواء أثناء تدفق العدلات أو ما بعد نضح.
    2. جعل جميع التسجيلات الرقمية لا يقل عن 5 - 10 حقول في وسط قناة التدفق. التعرف على مركز للقناة عن طريق تحريك الهدف إلى حافة القناة عند مدخل الميناء وتحديد منتصف الميناء.
      1. لتسجيل خلال تدفق العدلات، واتخاذ الصور من حقل واحد كل 10 ثانية لمدة 1 دقيقة. تحرك على طول القناة وتسجيل حقل آخر لمدة 1 دقيقة. كرر لمدة البلعة.
      2. لتسجيل ما بعد نضح، وجعل 10 ثانية تسجيل من 5 - 10 الحقول أسفل وسط القناة تدفق لتقييم سلوك الكريات البيض (عادة 2 دقيقة بعد نهاية البلعة العدلات). التقاط صور كل ثانية ضمن فترة 10 ثانية. وهذا يسمح الوقت الكافي لالتقاط من تدفق وسلوك neutro ملتصقةفيلس لتحليلها.
      3. تسجيل حقل واحد تحتوي على 10 على الأقل العدلات transmigrated لمدة 5 دقائق، مع أخذ الصور كل 30 ثانية. وهذا يمكن أن تستخدم لحساب سرعة خلايا هاجر (إما فوق أو تحت البطانة).
      4. تسجيل سلسلة أخرى من 10 حقول ثانية (عادة 9 دقيقة بعد التروية). وهذا يسمح العدلات الوقت لتهاجر من خلال أحادي الطبقة البطانية.
      5. وقف ضخ حقنة وإزالة الأنبوب. تفكيك غرفة التدفق وشطف الخزان عينة والأنابيب. أكرر للمرشحات لاحقة / قنوات شريحة مجهرية.

    تحليل 10. من خلايا الدم البيضاء التوظيف والسلوك

    1. حساب عدد العدلات في كل حقل أثناء التسجيلات ثانية 10 في نقطة زمنية 2 دقيقة. يجب أن تكون جميع خلايا موجودة في أول حقل الثاني من أجل لفرزها. يتم تضمين الخلايا التي هي جزئيا في هذا المجال على 2 الجانبين (على سبيل المثال، أعلى / يمين الحدود اليد) من مجال الرؤية فيالتهم، طالما أنها لا تزال في الميدان لمدة 10 ثانية كاملة.
    2. حساب متوسط ​​عدد العدلات ملتصقة لكل حقل. قياس الطول والعرض من حقل المسجلة. حساب مساحة الحقل. حساب عدد الحقول هناك في 1 مم 2. مضاعفة عدد العدلات متوسط ​​من قبل عدد من الحقول في 1 مم 2.
    3. حساب إجمالي عدد العدلات perfused لبضرب كمية من العدلات perfused ل(على سبيل المثال، 2 × 10 6 / مل * Q [على سبيل المثال، 0.0999 مل / دقيقة لوحة موازية تدفق غرفة]) قبل مدة من البلعة (على سبيل المثال، 4 دقيقة ).
    4. تقسيم العدلات العد / مم 2 من إجمالي عدد العدلات perfused للتحديد العدد الكلي للخلايا التي انضمت (ملتصقة خلية / ملم 2/10 6 perfused ل).
    5. تقييم ما إذا كانت ملتصقة العدلات والمتداول، تمسكا راسخا أو transmigrated (التكميلي فيديو 1 و 2).
      1. Aالمتداول العدلات هي مرحلة مشرقة وسوف تتحرك ببطء على طول البطانية أحادي الطبقة (1 - 10 ميكرون / ثانية؛ التكميلية فيديو 1).
      2. الخلايا الملتصقة بحزم هي مرحلة مشرقة ومنضمة إلى السطح EC، إما تبقى ثابتة (أي لا تتحرك أثناء التسجيل) أو خضعوا لتغيير شكل والمهاجرة على سطح EC (الشكل 1Ei).
      3. والعدلات transmigrated هي المرحلة المظلمة وتحت طبقة EC (الشكل 1Eii).
    6. حساب نسبة الخلايا الملتصقة التي يتم المتداول، الثابتة وtransmigrated. بدلا من ذلك، يمكن التعبير عن السلوك العدلات حيث بلغ إجمالي أعداد الخلايا التي تظهر السلوكيات المختلفة من خلال تطبيق نفس الصيغة المستخدمة لحساب مجموع التصاق (كما هو موضح في الخطوات 10،6-10،7).
      1. علامة الحافة الأمامية من العدلات المتداول. بمناسبة الحافة الأمامية من نفس الخلية في نهاية تسلسل 10 ثانية. رسم خط الرهانوين 2 نقطة وقياس المسافة أن الخلية قد سافر.
      2. تقسيم هذه القيمة من خلال مدة التسجيل التي الخلية هو المتداول (أي 10 ثانية). محاولة لتحديد العدلات التي هي في مجال لكامل فترة 10 ثانية.
    7. لحساب سرعة العدلات المهاجرة على سطح (على شكل تغير المرحلة مشرق) أو تحت البطانة (المرحلة الظلام) استخدام 5 دقائق تسجيل (فيديو التكميلي 2).
      1. رسم الخطوط العريضة للخلايا هاجر في بداية تسلسل وتتبع تحركاتهم في جميع أنحاء التسلسل. جعل علما مواقف X و Y من النقطه الوسطى في كل فاصل 1 دقيقة لكل خلية. طرح قيم X و Y الموقف من الصورة الأولى من سلسلة من القيم في الصورة الثانية. ويستند هذا على نظرية فيثاغورس ".
      2. طرح القيم من الصورة الثانية من الصورة الثالثة. نفعل ذلك لجميع الصور في التسلسل. مربع رانه X و Y القيم وإضافتها معا.
      3. الجذر التربيعي القيمة الناتجة. حساب سرعة لكل خلية عن طريق حساب متوسط ​​سرعات محسوبة في كل فاصل زمني دقيقة. المسار 10 هاجر العدلات وحساب السرعة المتوسطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في البداية، قمنا بتحليل تأثير تحفيز EC مع TNFα على تجنيد العدلات من تدفق باستخدام نموذج شريحة مجهرية Ibidi (القسم 7-9). في غياب TNFα، القليل إذا كان أي العدلات الالتزام بها أحادي الطبقة البطانية (الشكل 2A). وكان من المتوقع هذا، كما لم يعالج / يستريح EC لا تعبر عن الجزيئات اللازمة التصاق (selectins) أو كيموكينات لدعم ملزمة 25،26. في المقابل، خلوى التحفيز زيادة كبيرة العدلات الانضمام إلى البطانة في جرعة تبعا للطريقة (الشكل 2A).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن هنا وصف اثنين في المختبر "الأوعية الدموية" نماذج لدراسة توظيف تعميم العدلات من قبل البطانة الملتهبة. والميزة الرئيسية لهذه النماذج هي القدرة على تحليل كل خطوة في سلسلة التصاق الكريات البيض في النظام، كما أن تحدث في الجسم الحي. وقد لاحظنا سابقا زيادة تعتمد على الجرعة في العدلات التصاق لوالتهجير من خلال حفز TNFα EC 9،29. وصفنا أيضا كيف يمكن تكييفها كلا النموذجين لدراسة الآثار المترتبة على خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض. هنا، كان MSC شا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

< p class = 'jove_content'> تم جمع الحبل السري بمساعدة صندوق NHS للرعاية الصحية للمرأة في برمنغهام. تم دعم HMM من قبل زمالة التطوير الوظيفي لأبحاث التهاب المفاصل في المملكة المتحدة (19899) وعلوم النظم من أجل الصحة ، جامعة برمنغهام (5212).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكولاجيناز نوع IaSigmaC2674يخفف في 10 مل PBS للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 مجم / مل. C في 1 مل aliquots.
Dulbecco's PBSSigmaD8662مع كلوريد الكالسيوم والمغنيسيوم. يحفظ معقما ويخزن في RT.
1X متوسط M199Gibco31150-022دافئ في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام.
كبريتات الجنتاميسينSigmaG1397يحفظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية. يضاف إلى زجاجة M199 500 مل.
عامل نمو البشرة البشريSigmaE9644يخزن في -20 درجة ؛ C في 10 & ميكرو; ل aliquots.
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)SigmaF9665FCS لضمان نمو وصلاحية EC المعزول.
أمفوتريسين بجيبكو15290-026قوي ويصبح ساما في غضون أسبوع ، لذا يجب أن يصنع وسط HUVEC كامل طازج كل أسبوع. يخزن في -20 درجة ؛ C في 1 مل aliquots.
هيدروكورتيزونسيجماH0135موجود في الإيثانول. يخزن في -20 درجة ؛ C في 10 & ميكرو; ل aliquots.
كولاجيناز من النوع الثانيسيجماC6885يخفف المرق في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 100 مجم / مل. C في 100 & ل aliquots.
HyaluronidaseSigmaH3631يخفف المخزون في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 20,000 وحدة / مل. C في 100 & ل aliquots.
100 وميكرو ؛ مصفاة الخلايا m لأنبوب الطرد المركزي سعة 50 ملمستلزمات المختبر العلمي (SLS)352360يمكن أيضا استخدام مصافي الخلايا الأخرى المتوفرة تجاريا (مثل Greiner bio-one).
DMEM منخفض الجلوكوزBioseraLM-D1102 / 500دافئ في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام.
مزيج البنسلين / الستربتومايسينسيجماP4333يخزن في -20 درجة ؛ C في 1 مل aliquots.
قارورة 25 سم مكعب لزراعة الأنسجةSLS353109
75 سم مكعب قارورة لزراعةالأنسجة SLS353136
قارورة الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظمLonzaPT-2501يحفظ في النيتروجين السائل عند الوصول. توجد الزنازين عند الممر 2 عند الوصول ولكن تم تعيينها على أنها ممر 0. Exapand إلى المرور 3 وتخزينها في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا.
وسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCGM)LonzaPT-3001دافئ في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام. بالنسبة إلى Cell Tracker Green تلطيخ ، استخدم الوسط بدون FCS.
EDTA (0.02٪)SigmaE8008يخزن في 4 درجات مئوية دافئ في 37 درجة مئوية ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام.
محلول التربسينSigmaT4424يخزن في -20 درجة ؛ C في 2 مل aliquots. قم بإذابة الثلج في RT واستخدمه على الفور.
CryovialsGreiner bio-one2019-02احتفظ بالثلج قبل إضافته قبل إضافة تعليق الخلية.
حاوية التجميد السيد فروستيNalgene5100-0001في RT. عند إضافة cryovials مع تخزين الخلايا عند -80 درجة ؛ C لمدة 24 ساعة قبل نقل الخلايا إلى النيتروجين السائل.
Ibidi u-Slide VI (0.4) ، معالج T / C ، معقمIbidiIB-80606تشمل النماذج البديلة الشعيرات الدموية الزجاجية ، Cellix Biochips (www.cellixltd.com) ، لوحات BioFlux (www.fluxionbio.com/bioflux/) وغرف تدفق الألواح المتوازية GlycoTech (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
تعقب الخلية صبغةخضراء تقنيات الحياةC2925مخزن في 5 وميكرو ؛ ل aliquots عند -20 درجة مئوية. خفف في 5 مل مسخن مسبقا (عند 37 درجة ؛ ج) MSCGM.
غرف عد الخلاياNexcelomSD-100بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مقياس الدم.
عداد الخلايا التلقائي T4 عدادNexcelomAuto T4-203-0238
عامل نخر الورم &alpha ؛ (TNFα)R & D Systems210-TA-100يخفف المخزون في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 100,000 وحدة / مل. C في 10 & ميكرو; ل aliquots.
6-بئر ، 0.4 وميكرو ؛ مرشحات m PET TranswellSLS353090
K2-EDTA في أنابيب 10 مل متجرSarstedtفي RT.
Histopaque 1119Sigma11191يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، يسخن إلى RT قبل الاستخدام.
Histopaque 1077Sigma10771يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، دافئ إلى RT قبل الاستخدام.
10 مل أنبوب دائريالقاع Appleton WoodsSC211 142 AS
7.5٪ BSA Fraction V solutionLife Technologies15260-037Store at 4 درجات مئوية.
20 مل محاقن بلاستيباكBD 300613
5 مل محاقن بلاستيباكصقر BD302187
2 مل محاقن بلاستيباكفالكونBD 300185
3M شريط جراحي مضاد للحساسية 9 م × 2.5 سمMicropore1530-1يستخدم لتثبيت صنبور المحقنة على جدار حجرة البرسبيكس.
أنابيب مطاطية من السيليكون ، القطر الداخلي / القطر الخارجي (ID / OD) 1/3 مم (أنبوب رفيع) FisherScientificFB68854قطع أنابيب السيليكون بالحجم المناسب. يجب أن تكون جميع الأنابيب المؤدية مباشرة إلى الصمام الدقيق الإلكتروني رقيقة.
معرف أنابيب مطاط السيليكون / OD من 2/4 مم (أنابيب سميكة)فيشر ساينتفيكFB68855
بورتكس بلو لاين مانومتر الأنابيبسميثس200/495/200الأنابيب المؤدية إلى مضخة المحقنة.
3-way محقنةBOC Ohmeda AB
Glass 50 مل لمضخةبوبرميكروميت 550962يجب تحضيرها قبل الاستخدام عن طريق إزالة أي فقاعات هواء.
غطاء زجاجيRaymond A Lamb26 × 76 مم أغطية مصنوعة حسب الطلب. رقم الدفعة 2440980.
حشية بارافيلمNational CanCompany قم بقص قطعة من البارافيلم مقاس 26 × 76 مم باستخدام قالب من الألومنيوم وقم بقص فتحة مقاس 20 × 4 مم فيها باستخدام مشرط 10 أمبير. سمك الحشية حوالي 133 ميكرو ؛ م.
لوحان متوازيان برسبيكسولفسون للتكنولوجياالتطبيقية غرفة مصممة خصيصا تتكون من ألواح متوازية مثبتة معا بواسطة 8 براغي. تحتوي اللوحة السفلية على فتحة عرض مقطوعة في المنتصف وتجويف ضحل مطحون لإتاحة مساحة للغطاء والفلتر والحشية. تحتوي لوحة البرسبيكس العلوية على فتحة مدخل ومخرج موضوعة فوق قناة التدفق.
صمام صغير إلكتروني ثلاثي الاتجاهات مع الحد الأدنى للمساحة الميتةLee Products Ltd.LFYA1226032Hمتصل إلكترونيا بمصدر طاقة 12 فولت تيار مستمر.
مضخة حقنة للتسريب / السحب (PHD2000) جهازهارفارد70-2001اضبط القطر على 29 مم ومعدل إعادة التعبئة (التدفق).
موصل على شكل حرف LLabhutLE876للتوصيل بمنافذ المدخل والمخرج على قناة Ibidi microslide.
كاميرا الفيديوQimaging01-QIC-F-M-12-Cمتصل بجهاز كمبيوتر يتيح تسجيل مقاطع الفيديو الرقمية بالكامل.
Image-Pro Plus 7.0Media Cybernetics41N70000-61592لتحليل البيانات. وضع علامات يدويا على الخلايا التي تعرض السلوكيات المختلفة. تتبع الخلايا لتحليل سرعات التدحرج والترحيل.
ارجع إلى أوراق بيانات المنتج للحصول على تفاصيل حول مخاطر استخدام الكواشف الموضحة هنا.
يجب اختبار مخزون محلول مخزن الخلايا صقر شركة American مختبر

المراجع

  1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
  4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
  5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
  6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
  7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
  8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
  9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
  10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
  11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
  12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
  13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
  14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177(2009).
  15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
  16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
  17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
  18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
  19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
  20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
  21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
  22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
  23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
  24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
  25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
  26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
  27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
  28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
  29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
  30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة