مقالة منهجية

إنشاء الإنسان الظهارية Enteroids وColonoids من الأنسجة كامل وخزعة

DOI:

10.3791/52483

⸱

مارس 6, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Medicine, Section of Gastroenterology and Hepatology, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف طريقة لإنشاء الأمعاء البشرية من الخبايا المعوية الدقيقة والقولون من خبايا القولون التي تم جمعها من كل من الأنسجة الجراحية والخزعات. في هذه المقالة المنهجية ، نقدم طرائق الاستزراع الضرورية للنمو الناجح والحفاظ على الأمعاء والقولون البشرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتجدد ظهارة الجهاز الهضمي باستمرار عندما تنقلب. تحدث هذه العملية عن طريق تكاثر الخلايا الجذعية المعوية (ISCs) والنسل الذي يهاجر تدريجيا ويتمايز نحو طرف الزغابات. تمت دراسة هذه العمليات ، الضرورية لتوازن الجهاز الهضمي ، على نطاق واسع باستخدام طرق متعددة. أثبتت تقنيات خارج الجسم الحي ، وخاصة مزارع الخلايا الأولية ، أنها واعدة لفهم الوظائف الظهارية المعوية. تم إنشاء نظام ثقافة أولي طويل الأجل لخبايا الأمعاء الفئرانية لتوليد عضيات ظهارية ثلاثية الأبعاد. تحتوي هذه الهياكل الظهارية على مجالات تشبه الخفاب والزغابات تذكرنا بظهارة الأمعاء الطبيعية. عادة ، يطلق عليها "الأمعاء" عندما تكون مشتقة من الأمعاء الدقيقة و "القولون" عندما تكون مشتقة من القولون ، فهي تختلف عن العضيات التي تحتوي أيضا على أنسجة اللحمة المتوسطة. بالإضافة إلى ذلك ، تنتج هذه الأمعاء / القولون باستمرار جميع أنواع الخلايا الموجودة بشكل طبيعي داخل ظهارة الأمعاء. سرعان ما أصبح نظام الثقافة الشبيه بالأعضاء في المختبر المعيار الذهبي الجديد للتحقيق في بيولوجيا الخلايا الجذعية المعوية وفسيولوجيا الخلايا الظهارية. تم نقل هذه التكنولوجيا مؤخرا إلى دراسة الأمعاء البشرية. كان إنشاء الأمعاء الظهارية والقولون المشتقة من الإنسان ممكنا من خلال استخدام وسائط مزرعة محددة تسمح بنموها وصيانتها بمرور الوقت. هنا ، نصف طريقة لإنشاء نظام مشتق من القبو المعوي الدقيقة والقولون من الأنسجة البشرية الكاملة أو الخزعات. نؤكد على طرائق الاستزراع الضرورية للنمو الناجح والحفاظ على الأمعاء والقولون البشري.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهارة بطانة القناة الهضمية هي في التجديد المستمر. يتم تشغيل هذه العملية من خلال انتشار الخلايا الجذعية المعوية (ISCS) التي تنتج ذرية باستمرار ليحل محل بسرعة ظهارة الأمعاء كما أنه يقلب. يقتصر مقصورة التكاثري تضم ISCS إلى الجزء السفلي من الخبايا. وISCS تثير ذرية والتي تفرق في نهاية المطاف إلى الاستيعابية أو الأنساب إفرازية. الخروج من سرداب وعلى زغابة أو سطح البشرة، والخلايا تفرق تدريجيا كما تهاجر صعودا قبل تقشير في التجويف 1. ISCS تؤدي إلى كل أنواع الخلايا الظهارية المعوية بما في ذلك المعوية وخلايا microfold، وخلايا enteroendocrine، والخلايا الكأسية، وخلايا خصل والخلايا بانيت. ويتميز القولون عن طريق أقبية ممدود تتألف في معظمها من colonocytes والخلايا الكأسية، مع enteroendocrine متناثرة والخلايا خصل 2.

فيفو السابقين طريق مسدودتشكل أنظمة البنية أداة واعدة لدراسة صيانة ISC وتوازن الأنسجة المعوية. ومع ذلك، فمن الصعب الاعتماد على تقنيات زراعة الأنسجة لا ترد الظروف الفسيولوجية بالكامل والمكروية الظهارية في كثير من الأحيان تغيير 3،4. وكان تقدما كبيرا في مجال ISC إنشاء تقنيات زراعة الأنسجة للحفاظ على وتوسيع ISCS الفئران الفردية باستخدام عوامل النمو المحددة لاستبدال الإشارات المتخصصة المعوية العادية. وقد وصفت الظروف الثقافة على المدى الطويل عن طريق ساتو وآخرون، التي أقبية واحدة أو الخلايا الجذعية المعزولة من ظهارة الأمعاء تنمو لتشكيل هياكل الظهارية 3-الأبعاد بما في ذلك تشبه سرداب متعددة المجالات 5-7. هذه الهياكل ثلاثي الأبعاد تخضع الأحداث الانشطار لتوسيع باستمرار. ومن المثير للاهتمام، وجميع أنواع الخلايا المعوية محددة لالأنسجة المنشأ ويتم إنتاج وكذلك تنبثق في التجويف 8. عن طريق إدخال تعديلات على هذا النظام، الظهاريةيمكن أن تتولد organoids من المعدة والأمعاء الدقيقة والقولون. وبشكل أكثر تحديدا، organoids الظهاري من الأمعاء الدقيقة وenteroids 9، وتلك من القولون هي colonoids 9،10. وقد استخدمت هذه الأنظمة الثقافة عضي الظهارية لاختبار قدرة الخلايا وحيدة معزولة لتكون بمثابة الخلايا الجذعية في المختبر، وبالتالي اختبار "stemness" من الخلايا المعزولة 5،6،10-15. وقد استخدم باحثون آخرون كلا enteroids وcolonoids لدراسة وظيفة الخلايا الظهارية الفردية 16-21. وهكذا، والثقافات enteroid وcolonoid يمكن استخدامها لتقييم كل الجذعية والخلايا الجذعية غير وظائف وإعطاء نظرة جديدة في التفاعلات الخلوية الأساسية داخل الأمعاء.

في عام 2011، ولدت ساتو وزملاؤه الثقافة على المدى الطويل organoids الظهارية المستمدة من الأمعاء الدقيقة والقولون البشري 22،23. وإلى جانب الاختلافات في تكوين وسائل الإعلام، وenteroids الظهارية البشريةوcolonoids يحمل نفس خصائص نظيرتها الفئران. وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن أن تتولد من الأنسجة المريضة مثل المريء والورم الحميد باريت أو غدية، والتليف الكيسي 22،24. enteroids الإنسان تشكل نظاما قيما لدراسة المعوية الجذعية خلايا الظهارية المخاطية والبيولوجيا، ويكون بمثابة نظام تجريبي جديد لدراسة علم وظائف الأعضاء الهضمي على حد سواء طبيعية وغير طبيعية 3.

نحن هنا وصف الأساليب لإنشاء enteroids وcolonoids من الأمعاء الدقيقة البشرية والخبايا القولون (الشكل 1). في هذا الاستعراض المنهجي، فإننا نؤكد على جمع سرداب من النسيج كله والخزعات. نحن ألخص طرائق الثقافة التي هي ضرورية لنمو ناجح وصيانة enteroids وcolonoids البشرية والاستراتيجيات الممكنة التجريبية التي قام بها هذا النموذج.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق: ملاحظة: جميع التجريب باستخدام الأنسجة البشرية الموصوفة هنا وافق عليها الاتحاد الدولي للرجبي في CCHMC (IRB # 2012-2858؛ # 2014-0427). تم الحصول على الموافقة المسبقة لجمع الأنسجة، والتخزين، واستخدام عينات من الجهات المانحة في CCHMC.

1. إعداد للثقافة

ملاحظة: يتم سرد كافة الكواشف في الجدول 1.

  1. إعداد EDTA حل الأسهم كما يلي: إعداد 0.5 M حمض ethylenediaminetetraacetic، ودرجة الحموضة 8 (EDTA) في عالى النقاء H 2 O، وتصفية تعقيمها مع 0.22 ميكرون التصفية. اختياريا، تخزين محلول المخزون EDTA في RT أجل غير مسمى.
  2. إعداد عازلة مخلبية كما يلي: مزيج 2٪ السوربيتول، 1٪ السكروز، 1٪ مصل بقري الزلال جزء V (BSA) و1X جنتاميسين / حل الامفوتريسين في الفوسفات Dulbecco ومخزنة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ (DPBS)، فلتر تعقيم مع 0.22 ميكرون التصفية. إعداد BUF مخلبيةفر الطازجة.
  3. إعداد مكيفة WNT-3A المتوسطة على النحو التالي: يتكون المتوسطة مكيفة WNT-3A في المنزل باستخدام خط الخلية L WNT-3A وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (آي تي ​​سي سي، CRL-2647). تكملة المتوسطة مع 2 مم الجلوتامين، 10 ملي HEPES، و 100 U / البنسلين مل، 100 غرام / مل الستربتومايسين، N2 1 الملحق (1)، B27 الملحق، 1٪ BSA وفلتر تعقيم مع فلتر 0.22 ميكرون.
    ملاحظة: اختبار كل دفعة للنشاط WNT باستخدام فحص TOPflash. استخدام مستقر HEK293 TOPflash خط الخلية (هانز كليفرز مختبر) مع Renilla عدة luciferase المراسل الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تطبيع فحص TOPflash مع 100 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف WNT-3A. تأكيد على الأقل نشاطا أضعاف تغيير 10 من وسائل الإعلام مكيفة مقارنة السيطرة. تقسيم الطازجة المتوسطة مكيفة WNT-3A-إلى 10 مل مأخوذة في 15 مل أنابيب مخروطية وتجميد في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. متجر مأخوذة إذابة ما يصل إلى 5 أيام في 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.
  4. العلاقات العامةepare المتوسطة minigut البشري على النحو التالي: الملحق المتقدم DMEM / F12 المتوسطة مع 2 مم الجلوتامين، 10 ملي HEPES، و 100 U / مل البنسلين، و 100 غرام / مل الستربتومايسين، N2 1 الملحق (1)، B27 الملحق، 1٪ BSA وتصفية تعقيمها مع 0.22 مرشح ميكرون.
    ملاحظة: تقسيم الطازجة المتوسطة minigut البشري إلى 10 مل مأخوذة في 15 مل أنابيب مخروطية وتجميد في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. متجر مأخوذة إذابة ما يصل إلى 5 أيام في 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.
  5. إعداد الكامل المتوسطة minigut البشري على النحو التالي: إعداد الطازجة قبل ثقافة سرداب أو تغيير المتوسطة المتوسطة minigut الإنسان (انظر 1.4) تستكمل مع 50٪ WNT-مكيفة 3A المتوسطة (انظر 1.3)، 1 ميكروغرام / مل R-spondin 1 (1: 1،000 التخفيف من 1 ملغ / مل الأوراق المالية)، و 100 نانوغرام / مل رأس (1: 1،000 التخفيف من 100 غرام / مليلتر الأسهم)، 50 نانوغرام / مل EGF (1: 10،000 التخفيف من 500 ميكروغرام / مل الأوراق المالية)، و 500 نانومتر A-83 -01 (1: 1،000 التخفيف من 500 M الأسهم)، و 10 ميكرومتر SB202190 (1: 3،000 التخفيف من 30 ملي الأسهم)، و 10 نانومتر [لوي] 15 الغاسترين 1 (1: 10،000 التخفيف من 100 ميكرومترالأسهم)، 10 ملي نيكوتيناميد (1: 100 التخفيف من 1 M الأسهم) و 1 ملي N أسيتيل (1: 1،000 التخفيف من 1 M الأوراق المالية).
    ملاحظة: مخزن كاملة وسائل الإعلام minigut الإنسان لتصل إلى 2 أيام في 4 درجات مئوية دون فقدان النشاط.

2. القبو عزل من الأنسجة كامل

ملاحظة: من جمع الأنسجة، فمن الضروري للحفاظ على عينة في المياه المالحة. ومن الموصى به للحفاظ على الأنسجة على الجليد أثناء النقل. يجب أن يتم تنفيذ إعداد العينة لعزل سرداب في أقرب وقت ممكن.
ملاحظة: يتم سرد كافة الكواشف في الجدول رقم 1، والأدوات والمعدات والمواد الاستهلاكية مدرجة في الجدول 2.

  1. إعداد جميع الكواشف قبل البدء في التجربة. ذوبان الجليد مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد وقبل احتضان لوحة 24-جيدا في CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: جعل بدلا من طبقة رقيقة من مصفوفة الغشاء القاعدي باستخدام 15 ميكرولتر / جيد في وسط 24لوحة حسنا ووضعه في CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. هذه الخطوة الاختيارية تحافظ على الطابق السفلي مصفوفة الغشاء كما تراجع خلال البلمرة.
  2. غسل الأنسجة مع الجليد الباردة الفوسفات Dulbecco ومخزنة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ (DPBS). المضي قدما حتى محتوى DPBS واضح.
  3. باستخدام 0.2 ملم دبابيس قطر minutien، وتأمين الأنسجة على الزجاج طبق بتري المغلفة سيليكون مليئة DPBS الجليد الباردة. تمتد ويعلقون الأنسجة مسطحة مع الجانب المخاطية مواجهة.
  4. تحت المجهر تشريح، وإزالة الغشاء المخاطي المغطي من تحت المخاطية والأنسجة الضامة باستخدام مقص تشريح الدقيقة ونقطة غرامة ملقط المنحنية (الشكل 2A، B).
  5. تمتد ويعلقون على تشريح شقة الغشاء المخاطي على الزجاج طبق بتري المغلفة السيليكون مع الجانب المخاطية مواجهة. وتحت المخاطية المتبقية والنسيج الضام يمكن التخلص منها أو استخدامها لمزيد من التجارب (الشكل 2C).
  6. بلطفكشط سطح الغشاء المخاطي مع ملقط منحنية. هذه الخطوة ضرورية لتحسين نوعية التحضير.
    1. لالأمعاء الدقيقة، كشط بلطف الغشاء المخاطي لإزالة الزغب.
    2. لالقولون، كشط بلطف الغشاء المخاطي لإزالة المخاط والحطام.
  7. يغسل الغشاء المخاطي 3-4 مرات مع العازلة عملية إزالة معدن ثقيل من الجليد البارد لإزالة الزغب والحطام.
  8. تغطية الغشاء المخاطي مع الطازجة 2mm و EDTA عازلة عملية إزالة معدن ثقيل (200 ميكرولتر 0.5 M EDTA في 49.6 مل عازلة عملية إزالة معدن ثقيل).
  9. وضع طبق بتري على الجليد ويهز بلطف لمدة 30 دقيقة على شاكر المداري الأفقي.
  10. غسل الأنسجة 3-4 مرات مع العازلة عملية إزالة معدن ثقيل الجليد الباردة دون EDTA. بعد الغسيل، وترك الغشاء المخاطي في المخزن عملية إزالة معدن ثقيل الجليد الباردة.
  11. معالجة الغشاء المخاطي تحت المجهر تشريح باستخدام ملقط المنحنية والغرامة. كشط بلطف الغشاء المخاطي للافراج عن الخبايا المعوية باستخدام ملقط منحنية.
  12. إزالة بلطف تعليق سرداب من طبق بتري باستخدام بايpette وتحويلها إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
    ملاحظة: التحقق من الأنسجة للتأكد من أن كل الخبايا تقريبا تم إزالتها من الغشاء المخاطي.
  13. تعليق تصفية أقبية من خلال 150 ميكرون شبكة 2 مرات.
    ملاحظة: التحقق من التدفق من خلال لتخصيب سرداب تحت المجهر (الشكل 2D).
  14. أجهزة الطرد المركزي في سرداب تعليق 5 دقيقة في 50 x ج، 4 ° C. تجاهل طاف.
  15. Resuspend وبيليه في 5 مل الجليد الباردة عازلة عملية إزالة معدن ثقيل.
  16. حساب عدد من الأقبية في انخفاض بنسبة 10 ميكرولتر من تعليق من الخطوة 2.15. نقل عدد من الأقبية اللازمة لتصفيح إلى 5 مل أنبوب الجولة القاع. استخدام 200-500 أقبية لكل بئر من صحن 24-جيدا لإقامة enteroids أو colonoids.
  17. أجهزة الطرد المركزي في جزء سرداب لمدة 10 دقيقة في 150 غ من 4 ° C. إزالة طاف.
  18. استخدام الأقبية للثقافة اللاحقة.

3. عزل القبو من خزعة

  1. إعداد جميع الكواشف قبلبداية التجربة. ذوبان الجليد مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد وقبل احتضان لوحة 24-جيدا في CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. غسل خزعة مع الجليد الباردة الفوسفات Dulbecco ومخزنة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ (DPBS).
  3. باستخدام 0.1 ملم دبابيس قطر minutien، وتأمين خزعة على الزجاج طبق بتري المغلفة سيليكون مليئة DPBS الجليد الباردة. تمتد ويعلقون الغشاء المخاطي مسطح مع الجانب المخاطية تواجه يصل (الشكل 2E).
  4. بلطف كشط سطح الغشاء المخاطي مع ملقط المنحنية لإزالة الزغب والحطام. هذه الخطوة ضرورية لتحسين نوعية التحضير.
  5. غسل خزعة 3-4 مرات مع العازلة عملية إزالة معدن ثقيل من الجليد البارد لإزالة الزغب والحطام.
  6. تغطية خزعة مع الطازجة 2mm و EDTA عازلة عملية إزالة معدن ثقيل (200 ميكرولتر 0.5 M EDTA في 49.8 مل عازلة عملية إزالة معدن ثقيل).
  7. وضع طبق بتري على الجليد ويهز بلطف لمدة 30 دقيقة على شاكر المداري الأفقي.
    8. <لى> غسل خزعة 3-4 مرات مع العازلة عملية إزالة معدن ثقيل الجليد الباردة دون EDTA. بعد الغسيل، وترك الخزعة في المخزن عملية إزالة معدن ثقيل الجليد الباردة.
  8. معالجة الخزعة تحت المجهر تشريح باستخدام ملقط المنحنية والغرامة. كشط بلطف الغشاء المخاطي للافراج عن الخبايا المعوية باستخدام ملقط منحنية.
  9. إزالة بلطف تعليق سرداب من طبق بتري باستخدام ماصة وتحويلها إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
    ملاحظة: التحقق من الأنسجة للتأكد من أن كل الخبايا تقريبا تم إزالتها من الغشاء المخاطي.
  10. تعليق تصفية سرداب من خلال النايلون 150 ميكرون شبكة 2 مرات.
    ملاحظة: التحقق من التدفق من خلال لتخصيب سرداب تحت المجهر.
  11. أجهزة الطرد المركزي في سرداب تعليق 5 دقيقة في 50 x ج، 4 ° C. تجاهل طاف.
  12. resuspend الكرية في 1 مل الجليد الباردة عازلة عملية إزالة معدن ثقيل. نقل تعليق سرداب إلى أنبوب 1.5 مل microfuge.
  13. أجهزة الطرد المركزي في جزء سرداب لمدة 10 دقيقة في 150 x ج، 4 ° C. إزالة طاف.
  14. استخدام الأقبية للثقافة اللاحقة.

4. القبو الثقافة في الغشاء القاعدي مصفوفة

  1. نصائح باستخدام الماصة قبل المبردة، resuspend الكرية سرداب (من الخطوة 2.18 أو 3.15) في الغشاء القاعدي مصفوفة (200-500 أقبية / 50 ميكرولتر الطابق السفلي مصفوفة الغشاء).
  2. تطبيق 50 ميكرولتر من سرداب تعليق في الطابق السفلي مصفوفة غشاء لكل بئر على لوحة ما قبل تحسنت. إخراج ببطء مصفوفة الغشاء القاعدي في وسط البئر.
  3. وضع لوحة 24-جيدا في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح البلمرة كاملة من المصفوفة الغشاء القاعدي.
  4. تراكب مصفوفة الغشاء القاعدي مع 500 ميكرولتر من كامل المتوسطة minigut الإنسان تستكمل مع 2.5 ميكرومتر CHIR99021 (1: 4،000 التخفيف من 10 ملي الأسهم) و 2.5 ميكرومتر Thiazovivin (1: 4،000 التخفيف من 10 ملي الأسهم).
  5. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
  6. استبدال المتوسطة مع هوما كامل الطازجةن minigut المتوسطة كل أيام 2.

5. الركض من مثقف Enteroids وColonoids.

ملاحظة: الممر Enteroids وColonoids كل 7 إلى 10 أيام بعد الطلاء الأولي. عموما، تقسيم واحد بشكل جيد في 3 إلى 4 آبار.

  1. إعداد جميع الكواشف قبل بداية التجربة. ذوبان الجليد مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد وقبل احتضان لوحة 24-جيدا في CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. إزالة وسائل الإعلام باستخدام نصائح عقيمة وتراكب مع 1 مل من DPBS الجليد الباردة.
  3. ماصة ذهابا وإيابا مع طرف 1،000 ميكرولتر. نقل الحل في 15 مل جديد أنبوب مخروطي.
  4. إضافة 2 مل من minigut البشرية المتوسطة تستكمل مع 5٪ FBS لكل 1 مل من المتوسط.
  5. أجهزة الطرد المركزي الحل لمدة 5 دقائق في 50 x ج، 4 ° C. تجاهل طاف.
  6. resuspend الكرية مع 2 مل من انزيم تفارق خلية تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 (1: 1،000 التخفيف من 10 ملي الأسهم). احتضان لمدة 5 مفي عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  7. فصل كتل الخلايا باستخدام 3 مل لور للقفل حقنة مجهزة 18-G ملء / إبرة حادة. ماصة بلطف الحل ذهابا وإيابا باستخدام حقنة 10 مرات.
  8. الطرد المركزي تعليق لمدة 5 دقائق في 500 x ج، 4 ° C. تجاهل طاف.
  9. نصائح باستخدام الماصة قبل المبردة، resuspend الكرية خلية في مصفوفة الغشاء القاعدي.
  10. تطبيق 50 ميكرولتر من سرداب تعليق في الطابق السفلي مصفوفة غشاء لكل بئر على لوحة ما قبل تحسنت. إخراج ببطء مصفوفة الغشاء القاعدي في وسط البئر.
  11. وضع لوحة 24-جيدا في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 20 دقيقة للسماح البلمرة كاملة من المصفوفة الغشاء القاعدي.
  12. تراكب مصفوفة الغشاء القاعدي مع 500 ميكرولتر من كامل المتوسطة minigut الإنسان تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 (1: 1،000 التخفيف من 10 ملي الأسهم).
  13. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
  14. بعد 2 أياماستبدال المتوسطة مع الطازج الكامل المتوسطة minigut الإنسان تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 (1: 1،000 التخفيف من 10 ملي الأسهم). بعد ذلك، استبدل المتوسطة مع الطازجة، كاملة المتوسطة minigut الإنسان كل يوم.

6. تجميد مثقف Enteroids وColonoids

ملاحظة: عادة تجميد بئر واحدة في 2-3 cryovials.

  1. كرر الخطوات من 5،1-5،8.
  2. resuspend الكرية مع المتوسط ​​تجميد الباردة. نقل 1 مل من تجميد الحل في المسمى cryovial. ضع cryovial في حاوية تجميد تحتوي على 500 مل من الكحول الآيزوبروبيل.
  3. نقل الحاوية تجميد إلى 80 درجة مئوية الثلاجة لمدة 24 ساعة، ثم نقل cryovial لتخزين النيتروجين السائل.
    ملاحظة: مخزن Enteroids وColonoids لمدة تصل إلى 1 سنة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 2D مثال نموذجي من أقبية المعزولة حديثا من النسيج كله (الشكل 2D). عدد أقبية معزولة عن الخزعة هو أقل منه في الأنسجة كلها. باستخدام معيار ملقط الخزعة القدرة مع إبرة، ونحن عادة أداء اثنين من لدغات الخزعة على مسار واحد. كل النتائج دغة خزعة في سطح 10 مم 2 بمتوسط ​​50 إلى 100 ​​الأقبية في خزعة (الشكل 2F).

بعد الثقافة في مصفوفة الغشاء القاعدي، الخبايا تعتقل لتشكيل enterospheres للالأمعاء الدقيقة والقولون colonospheres ل. سرداب في مهدها عادة ما يحدث في غضون 5 إلى 6 أيام، بعد البذر. ومع ذلك فإنه ليس من غير المألوف أن نرى إما enteroids (enteroids) أو colonoids (colonoids) تشكيل المجالات في مصفوفة الغشاء القاعدي (الشكل 3A-C، فيلم 1). ويمكن أن يتم الركض بعد 7 أيام، اعتمادا على حجم enteroids. وenteroids أو colonoids أنشأناished من الخزعات الخضوع لنفس التطور في الثقافة. لكن، وكما كثافة سرداب في البذر أقل، وعادة ما يتم القيام به على الركض بعد 10 إلى 12 يوما في الثقافة (الشكل 4A، ب). Enteroids وcolonoids الثقافات توسيع بطريقة استنساخه.

كلا enteroids وcolonoids تقديم الجانب اللمعية وتصطف مع ظهارة (الشكل 5A، B). ويمكن ملاحظة خلايا التكاثري داخل enteroids وتقع ضمن نصائح برعم (الشكل 5C، D). التصوير متحد البؤر من enteroids ملطخة-E كادهيرين (ECAD) يدل على الخلايا الظهارية (الشكل 5E).

يمكن أن تنشأ على حد سواء enteroids وcolonoids من الأنسجة التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من / الاضطرابات الخلقية الوراثية الشكل 6 معارض enteroids ممثل المتزايد من مريض يعانون من التليف الكيسي (الشكل 6A) والأمعاء تلمم بسبب طفرة الخلقية في الإعلان الخلايا الظهاريةالجينات جزيء hesion (EpCAM) (الشكل 6B). بجانب خلل جيني، وenteroids لا يحمل الاختلافات في حالة القاعدية.

figure-results-1
يتم عزل الشكل 1. سير العمل من أقبية التفكك وجيل من enteroids البشرية وcolonoids في الثقافة. الأقبية (من الأمعاء الدقيقة أو القولون البشري) من خلال EDTA عملية إزالة معدن ثقيل. أقبية مثقف تشكل enteroids للالأمعاء الدقيقة وcolonoids لالقولون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. عملية تشريح لعزل سرداب. (A) وspecime الأمعاء الصغيرةويمتد ن ويعلق شقة في طبق بتري المغلفة السيليكون. يتم فصل (ب) الغشاء المخاطي من تحت المخاطية الأساسية. ويمتد (C) والغشاء المخاطي تشريح ويعلق شقة في طبق بتري المغلفة السيليكون. (D) بعد EDTA عملية إزالة معدن ثقيل، يتم عزل الخبايا من الأنسجة. ويمتد (E) واحدة خزعة ويعلق شقة في طبق بتري المغلفة السيليكون. (F) بعد EDTA عملية إزالة معدن ثقيل، يتم عزل الأقبية من الخزعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. ثقافة القبو وenteroid البشرية والجيل colonoid من الأنسجة كلها. (A) أقبية صائمية مطلي في مصفوفة الغشاء القاعدي بعد عزلة. الخبايا ويغلق مرتفعا بعد 3 إلى 4 ساعات والبدء في بالون حتى تشكيل enterospheres بعد هذا الوقت. في 7 أيام، وشكلت enteroids صائمي. (B) بعد العزلة والثقافة، وأقبية اللفائفية تتصرف مثل الخبايا صائمية وتشكل enteroids لفائفي. ومطلي (C) أقبية القولون في مصفوفة الغشاء القاعدي بعد العزلة. الخبايا colonoids وثيقة والنموذج بعد 7 أيام (أشرطة مقياس: 100 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. الثقافة القبو وenteroid البشرية والجيل colonoid من الخزعة. (A) أقبية الاثني عشر مطلي في مصفوفة الغشاء القاعدي بعد العزلة. الخبايا ويغلق مرتفعا بعد 3 إلى 4 ساعات والبدء في بالون يصل beyoالثانية هذا الوقت لتشكيل enterospheres. في 7 أيام، وشكلت enteroids. (B) بعد العزلة والثقافة، ومطلي أقبية القولون في مصفوفة الغشاء القاعدي. الخبايا عن قرب لتشكيل colonospheres ثم colonoids بعد 7 أيام (أشرطة مقياس: 100 ميكرون). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5. الأنساب المعوية من enteroids البشرية. (A) enteroid الإنسان بعد 6 أيام في الثقافة. (B) أقسام الهيماتوكسيلين يوزين من enteroids في (A) تدليل على الطلائية المبطنة (أشرطة مقياس: 100 ميكرون). (CD) التصوير متحد البؤر من enteroids بعد EDU تلطيخ (البنفسجي) يدل على وجود خلايا التكاثري. (E ) التصوير متحد البؤر من enteroids يوضح وجود: E-كادهيرين للخلايا الظهارية (ECAD والأخضر) (شريط مقياس: 50 ميكرون) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6. الثقافة القبو وتوليد enteroid الإنسان من الأنسجة المريضة. (A) Enteroids أنشئت من عينة التليف الكيسي. (B) Enteroids أنشئت من عينة الخلقية تلمم الأمعاء (أشرطة مقياس: 100 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيلم 1. Enterosphere تشكيل enteroid الإنسان في الثقافة. 32 ساعة الوقت فاتويظهر الفيلم على البريد enterosphere أنشئت من الأمعاء الدقيقة البشري التراجع لتشكيل enteroid في الثقافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

0.5 M
اسم الكاشف شركة عدد كتالوج مذيب الأسهم تركيز تركيز النهائي تعليق
الفوسفات Dulbecco ومخزنة المالحة الكالسيوم 2+، والمغنيسيوم 2+ مجانا (DPBS) تقنيات الحياة؛ GIBCO 14190-144 - - 1X
الإيثيلين
حمض tetraacetic (EDTA) 		سيغما الدريتش 431788 عالى النقاء درهم 2 O 2 مم
السوربيتول فيشر العلمي BP439-500 DPBS مسحوق 2٪
سكر القصب فيشر العلمي BP220-1 DPBS مسحوق 1٪
ألبومين المصل البقري (BSA) جزء V فيشر العلمي BP1600-100 DPBS مسحوق 1٪
Gzntamycin / الامفوتريسين B الحل تقنيات الحياة؛ GIBCO R-015-10 - 500X 1X
WNT-3A conditionned المتوسطة في المنزل - - - -
المتقدم DMEM / F12 تقنيات الحياة؛ GIBCO 12634-028 - - -
HEPES 1M تقنيات الحياة؛ GIBCO 15630-080 - 1 M 10 ملي
GlutaMAX (الجلوتامين) تقنيات الحياة؛ GIBCO 35050-061 - 100X 1X
البنسلين، الستربتوميسين (10،000 U / مل) تقنيات الحياة؛ GIBCO 15140-148 - 100X 1X
الملحق N2 تقنيات الحياة؛ GIBCO 17502-048 - 100X 1X
الملحق B27 تقنيات الحياة؛ GIBCO 17504-044 - 50X 1X
N-أسيتيل سيغما الدريتش A9165-5G DPBS 1 M 1 ملم
Nicotidamide سيغما الدريتش N0636 DPBS 1 M 10 ملي
Matrigel، GFR، الفينول (مصفوفة الغشاء القاعدي) مجانا كورنينج 356231 - - - مطلوب
رأس المؤتلف الإنسان R & D 6057-NG / CF DPBS 100 ميكروغرام / مل 100 نانوغرام / مل موردين آخرين: R & D، Anaspec وPreprotech
الإنسان المؤتلف R-Spondin Preprotech 120-38 DPBS 1 ملغ / مل 1 ميكروغرام / مل
EGF المؤتلف الإنسان سيغما الدريتش E9644-.2MG DBPS 500 ميكروغرام / مل 50 نانوغرام / مل
Y-27632 سيغما الدريتش Y0503-1MG DPBS 10 ملي 10 ميكرومتر
A-83-01 Tocris 2939 DMSO 500 ميكرومتر 500 نانومتر
SB202190 سيغما الدريتش S7067-5MG DMSO 30 ملي 10 ميكرومتر
الإنسان [لوي] 15 الغاسترين 1 سيغما الدريتش G9145-.1MG DPBS 100 ميكرومتر 10 نانومتر
CHIR99021 Stemgent 04-0004 DMSO 10 ملي 2.5 ميكرومتر
Thiazovivin Stemgent 04-0017 DMSO 10 ملي 2.5 ميكرومتر
TrypLE اكسبرس أنزيم (1X)، الفينول الأحمر (خلية انزيم تفارق) تقنيات الحياة؛ GIBCO 12605-010 - - - لالركض
مصل بقري جنيني تقنيات الحياة؛ GIBCO 10082-147 - - - لالركض
CTS المركب واحد في تجميد (تجميد المتوسطة) المتوسطة تقنيات الحياة؛ GIBCO A13713-01 - - - لتجميد
L WNT-3A خط الخلية ATCC CRL-2647 - - - WNT-3A conditionned الإنتاج الإعلامي
Renilla luciferase المراسل الفحص PROMEGA E2710 - - - WNT-3A conditionned النشاط الإعلامي
البشري المؤتلف WNT-3A R & D 5036-WN / CF DPBS 100 ميكروغرام / مل 100 نانوغرام / مل النشاط الإعلامي WNT-3A conditionned
خط الخلية HEK293 TOPflash - - - - - WNT-3A conditionned النشاط الإعلامي. هدية من هانز كليفرز المختبر

الجدول 1. قائمة كاشف مفصل مع الشركة المصنعة المفضل ورقم الكتالوج.

معدات مستهلكات أدوات
غطاء تدفق الصفحي 15- و 50 مل أنابيب مخروطية دومون # 5 ملقط القياسية (FST؛ # 11251-20)
CO حاضنة 2 أنابيب microfuge دومون # 7، ملقط غرامة منحني (FST؛ # 11274-20)
ستيريو المجهر 24 لوحات جيدا مقص الدقيقة (FST؛ # 14060-09)
نبذ 0.22 ميكرون مرشحات (سارتوريوس) مقص الربيع Vannas (FST؛ # 15018-10)
شاكر المداري الماصات المصلية قطر minutien دبابيس 0.2 ملم (FST؛ # 26002-20)
حاوية التجمد (Nalgene) نصائح ممص مكروى قطر minutien دبابيس 0.1 ملم (FST؛ # 26002-10)
Sylgard 184 سيليكون (داو كورنينج) 150 ميكرون فتحات شبكة، وفحص النايلون (الديناميكي أكوا العرض)
صحن من الزجاج بيتري 5 مل أنابيب البولي بروبلين جولة القاع (فالكون)
pipettor المصلية 18G التعبئة حادة إبرة (BD)
ممص مكروى 3 مل lsyringes مع نصائح لور-لوك (BD)
Cryovials

الجدول 2. تفصيلية المواد الاستهلاكية والأدوات والمعدات اللازمة لعزل سرداب والثقافة.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا الأسلوب نظام كامل استنساخ الأنساب الظهارية في الأمعاء وديناميكية الظهارية التي تشكل أداة مفيدة لدراسة البيولوجيا الظهارية في الأمعاء. تم تعديل طريقة المقدمة في هذه الوثيقة من دراسة الفئران الأصلية التي كتبها ساتو وكليفرز 22 الذي ينتج بكفاءة في enteroids البشرية وcolonoids. هنا، اخترنا يدويا الخبايا التي كتبها تسليخ مجهري لتجنب أي ملوثات الخلوية. يسمح هذا الأسلوب التصور المباشر من الخبايا ويؤدي إلى العمل الإضافي الاتساق مقارنة جمع سرداب الأصلي "الهز". وضعت مجموعات أخرى مماثلة التقنيات باستخدام أساليب مختلفة قليلا خصوصا استبدال عملية إزالة معدن ثقيل من EDTA مع كولاجيناز 25. وبالإضافة إلى الاختلافات في جمع سرداب، تلك التقنيات استخدام وسائل الإعلام تعريف ما هو مطلوب لزراعة enteroids الإنسان في الثقافة 22. لزيادة كفاءة النمو في سرداب البذر، ونضيف إلى مثبط GSK3 (CHIR99021)لأول يومين 12.

التعامل مع الأنسجة أو الخزعات مهم ويجب أن يتم تنفيذ العزل سرداب بمجرد وصول الأنسجة في المختبر. ومع ذلك، يمكن أن يؤديها تأخر العزلة سرداب والثقافة ما يصل إلى 24 ساعة بعد جمع الأنسجة (لا تظهر البيانات) كما هو موضح سابقا للأنسجة الفئران 26. يجب وضع الأنسجة المعوية في أنبوب مخروطي شغل تماما مع DPBS لتجنب انقطاع الأنسجة وينبغي الحفاظ على 4 درجات مئوية. إعداد تأخر يسمح للشحن الأنسجة ولكن ينبغي تجنب اختلاف درجة الحرارة أثناء النقل. الوقت الكلي اللازم لتصفيح سرداب الأولي حوالي 2 ساعة مع 15 إلى 30 دقيقة لمعالجة الأنسجة و1 إلى 2 ساعة لعزل وصفيحة سرداب. وتسليخ مجهري من النسيج هو المحدد الحاسم والمسند من إعداد سرداب نظيفة. ومع ذلك، وإطلاق سراح سرداب باليد يهز كما هو موضح في مختلف البروتوكولات ممكن 22،23.

وعلى الرغم من التشابه مع نظام enteroid الفئران (enteroids)، وenteroids البشرية تتطلب جزيئات محددة لتعزيز ودعم نموها مع مرور الوقت. عوامل النمو، وتستخدم EGF، رأس، R-spondin على غرار organoids الظهارية الفئران. ومع ذلك، فإن استخدام WNT-3A أمر بالغ الأهمية. لاحظنا أن تشكيل فضلا عن كفاءة نمو أكبر باستخدام وسيلة مكيفة WNT-3A من البروتين المؤتلف البشري. وفي الوقت نفسه، أثبتنا تحسين ظروف التربية باستخدام المانع من كيناز الجليكوجين سينسيز 3 (CHIR99021) 12. يمكن الاستعاضة عوامل النمو المؤتلف من قبل WNT-3A، R-spondin، ورأس مكيفة وسائل الاعلام. خط L-خلية معربا عن WNT-3A-متاح تجاريا (آي تي ​​سي سي). وقد وضعت مجموعات أخرى R-spondin 1- 23،27، Noggin- 19، وWNT-3A / R-spondin3 / 28 Noggin- يعبرون عن خطوط الخلايا. وتستخدم اثنين من مثبطات جزيء صغير في الثقافة ليهي ديا وضروري للحفاظ على ثقافة 29. A-83-01 هو المانع الانتقائي للتحويل β عامل نمو وActivin / مستقبلات العقدية (activin مثل كيناز 4، 5، 7) وSB202190 هو تنشيط mitogen-P38 بروتين كيناز المانع (MAPK). وقد استخدمت كل من مثبطات على التوالي للحفاظ البشرية الناجمة عن الخلايا الجذعية المحفزة التجديد الذاتي وإنشاء الخلايا المحفزة ساذجة الإنسان الجذعية 30-32. أيضا، نيكوتيناميد، تمهيدا لثنائي النوكليوتيد الأدينين نيكوتيناميد، مطلوب للحفاظ على enteroids والتوسع colonoids بطريقة طويلة الأجل 22،29.

وعملية إزالة معدن ثقيل EDTA خطوة هامة كما أنه يحدد العائد من إعداد سرداب. وقد نجحنا مع 2 العلاج ملي EDTA. ومع ذلك، والتركيز EDTA يمكن تعديلها من 2 مم إلى 15 مم فيما يتعلق بنوع من الأنسجة. في هذه الحالة، والوقت من الحضانة يجب أن تحدد تجريبيا. بعد الطلاء الأولي، فإن سرداب ذهابا وشp و في نهاية المطاف تشكل enteroids. ومع ذلك، فإن enteroids أو colonoids غالبا ما يبرهن على وجود "وقف" النمط الظاهري من خلال تشكيل المجالات مع قليل من أي خلايا متباينة. في هذه الحالة، يمكن البدء التمايز من خلال سحب WNT-3A، نيكوتيناميد والمانع P38 MAPK. استخدام الشق المانع مثل DAPT أو DBZ يساعد على تعزيز التمايز داخل enteroids 22.

هذا النموذج يلخص علم وظائف الأعضاء في الأمعاء مع الأحداث في مهدها سرداب المستمرة الناشئة عن حجرة الخلايا الجذعية وكذلك المجالات الظهارية مثل زغابة التي تحتوي على حد سواء الاستيعابية وإفرازية متباينة الأنساب. ومن المثير للاهتمام، وهذا النظام لا يحتوي على أية خلايا اللحمة المتوسطة ويستخدم وسائل الاعلام الظروف المحددة لتلبية متطلبات إشارة المتخصصة.

مثل نموذج الفئران، يمكن أن تتولد enteroids الإنسان من الخلايا الظهارية المعوية المعزولة لاختبار قدرة هذه الخلايا لتكون بمثابة الخلايا الجذعية. سفوقد استخدمت الدراسات راؤول مجموعة من علامات التمايز (CD44، CD24 أو CD166) والخلايا إيجابية EPHB2 لإثراء للخلايا الجذعية مع خصائص 12،23،33. معا، وهذه الدراسات تظهر فائدة enteroids البشرية الثقافات لاختبار stemness. باحثون آخرون يستخدمون هذا النموذج للتحقيق في الأمراض المعوية مثل الإسهال والأمراض المعدية، والتليف الكيسي، أو سرطان القولون والمستقيم 22،34-37. وتبين هذه الدراسات أن enteroids البشرية تشكل نموذجا الأمراض التي تصيب البشر يمكن الاعتماد عليها مع وجود إمكانية للتحرك نحو فحص شخصية. enteroids الإنسان يمكن تعديلها وراثيا باستخدام ترنسفكأيشن DNA أو العدوى مع الجسيمات الفيروسية 38. وهذا يوفر أداة قوية لدراسة وظائف الجينات المحددة ضمن organoids الظهاري البشري أو الطفرات الوراثية الصحيحة. مؤخرا، أظهرت شوانك وزملاؤه إمكانية لتحرير الجينوم مع كريسبر / نظام Cas9 وتصحيح طفرة على ميلان تسبب CFTR الجينالتليف ystic 24. enteroids الإنسان تشكل نظاما قيما لدراسة المعوية الجذعية خلايا الظهارية المخاطية والبيولوجيا، ويكون بمثابة نظام تجريبي جديد لدراسة علم وظائف الأعضاء الهضمي على حد سواء طبيعية وغير طبيعية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعرب عن امتناننا للدكتور هانز كليفرز (معهد هوبريشت لبيولوجيا النمو وأبحاث الخلايا الجذعية ، هولندا) على الهدية اللطيفة لخلايا TOPflash.

تم دعم هذا المشروع جزئيا من قبل NIH-R01DK083325 (MAH) ؛ المعاهد الوطنية للصحة P30 DK078392 (مركز صحة الجهاز الهضمي) ؛ UL1RR026314 المعاهد الوطنية للصحة (CTSA).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دولبيكو s فوسفات مخزن محلول ملحي Ca2+, Mg2+ free (DPBS)تقنيات الحياة; جيبكو14190-144
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتش431788
سوربيتولفيشر العلميBP439-500
السكروزفيشر ScientificBP220-1
ألبومين مصل البقر (BSA) الكسر الخامسفيشر العلميBP1600-100
محلول Gzntamycin / Amphotericin Bتقنيات الحياة؛ GibcoR-015-10
Wnt-3A وسط مكيففي المنزل
تقنيات DMEM / F12 Life المتقدمة؛ تقنيات Gibco12634-028
HEPES 1MLife ؛ جيبكو15630-080
جلوتامكس (الجلوتامين) تقنياتالحياة. Gibco35050-061
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) تقنياتالحياة ؛ Gibco15140-148
N2 تقنيات الحياة التكميلية؛ Gibco17502-048
B27 تقنيات الحياة التكميلية؛ Gibco17504-044
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165-5G
NicotidamideSigma-AldrichN0636
Matrigel ، GFR ، خالي من الفينول (مصفوفة غشاء القاعد)Corning356231
المؤتلف البشري NogginR & D6057-NG / CF
المؤتلف البشري R-SpondinPreprotech120-38
المؤتلف البشريEGF Sigma-AldrichE9644-.2MG
Y-27632Sigma-AldrichY0503-1MG
A-83-01Tocris2939
SB202190Sigma-AldrichS7067-5MG
الإنسان [Leu] 15- Gastrin 1Sigma-AldrichG9145-.1MG
CHIR99021Stemgent04-0004
ThiazovivinStemgent04-0017
إنزيم TrypLE Express (1X) ، فينول أحمر (إنزيم تفكك الخلية) تقنياتالحياة ؛ Gibco12605-010
مصل الجنينالبقري ؛ Gibco10082-147
CTS Synth-a-Freeze Medium (وسط التجميد) تقنياتالحياة ؛ GibcoA13713-01
L Wnt-3A خط الخليةATCCCRL-2647
اختبار Renilla luciferasePromegaE2710
المؤتلف البشري Wnt-3AR & D5036-WN / CF
HEK293 TOPخط
تقنيات خلية فلاش

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).
  2. Shroyer, N. F., Kocoshis, S. Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. Hyams, J. R. W. III , Elsevier. 324-336 (2010).
  3. Leushacke, M., Barker, N. Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications. Gut. , (2014).
  4. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  5. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  6. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  7. Mahe, M. M., et al. Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids. Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).
  8. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  9. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).
  10. Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).
  11. Furstenberg, R. J., et al. Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).
  12. Wang, F., et al. Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay. Gastroenterology. , (2013).
  13. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).
  14. Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  15. Yui, S., et al. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell. Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).
  16. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  17. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
  18. Akcora, D., et al. The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche. Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).
  19. Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
  20. Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
  21. Lau, W., et al. Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts. Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).
  22. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  23. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  24. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  25. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. , (2014).
  26. Fuller, M. K., et al. Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage. Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).
  27. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
  28. Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
  29. Koo, B. K., Clevers, H. Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5. Gastroenterology. , (2014).
  30. Li, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).
  31. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).
  32. Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  33. Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
  34. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med (Maywood). , (2014).
  35. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  36. Kovbasnjuk, O., et al. Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S3(2013).
  37. Fujii, M., Sato, T. Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research. Front Genet. 5, 169(2014).
  38. Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. Retroviral gene expression control in primary organoid cultures. Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6(2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EDTA

مقالات ذات صلة