Method Article

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/52484

⸱

March 17th, 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وجود العديد من الطرق المختلفة لقياس الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) باستخدام التدفق الخلوي (FCM). وينبغي النظر في العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. يتم عرض بروتوكولين لقياس المركبات الكهربائية، وذلك باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خارج الخلية الحويصلات (المركبات الكهربائية) هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك بشكل كبير في التواصل خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام التدفق الخلوي (FCM) بالغ الصعوبة نظرا لصغر حجمها وقلة السكان منفصلة إيجابي لعلامات من الفائدة. طرق للتحليل EV، في حين تحسنت تحسنا كبيرا على مدى العقد الماضي، لا يزال التقدم في العمل. لسوء الحظ، ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع البروتوكول، ويجب اعتبار العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. المقدمة هنا عدة تقنيات مختلفة لمعالجة المركبات الكهربائية وبروتوكولين لتحليل المركبات الكهربائية باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. الأساليب المذكورة هنا سوف تساعد في القضاء على المجاميع الأجسام المضادة التي توجد عادة في المستحضرات التجارية، وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووضع بوابات في و عقلانيةashion أن يقلل من الكشف عن مضان الخلفية. يستخدم البروتوكول الأول لطريقة الكشف الفردية التي هي خاصة مناسبة تماما لتحليل كميات كبيرة من العينات السريرية، في حين يستخدم بروتوكول الثاني النهج القائم على حبة لالتقاط وكشف المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خارج الخلية الحويصلات (المركبات الكهربائية) هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك بشكل كبير في التواصل خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام التدفق الخلوي (FCM) بالغ الصعوبة نظرا لصغر حجمها وقلة السكان منفصلة إيجابي لعلامات من الفائدة. طرق للتحليل EV، في حين تحسنت تحسنا كبيرا على مدى العقد الماضي، لا يزال التقدم في العمل. لسوء الحظ، ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع البروتوكول، ويجب اعتبار العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. المقدمة هنا عدة تقنيات مختلفة لمعالجة المركبات الكهربائية وبروتوكولين لتحليل المركبات الكهربائية....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: لقد تم تنفيذ البروتوكولات التالية في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية من أجل رفاهية الإنسان. تم اختبار جميع العينات موضوع الإنسان في إطار مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) البروتوكول وافق عليها وللموافقة المسبقة عن موضوع من الموضوعات.

1. طريقة A: كشف فردي طريقة

1.1) تجهيز الدم عينة / عزل المركبات الكهربائية

  1. سحب الدم من الجهات المانحة / المريض الى قسمين 10 مل أنابيب زجاجية تحتو....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1 الخطة الشاملة لعزل وكشف عن المركبات الكهربائية باستخدام إما طريقة القائم على حبة أو طريقة الكشف الفردية المعالجة. كشف الفردية من المركبات الكهربائية باستخدام FCM يعمل بشكل جيد لتحليل المركبات الكهربائية الكبيرة إلا أن معظم cytometers ليست قادرة على كشف فردي جزيئات صغيرة مثل exosomes. النهج القائم على حبة يسمح المركبات الكهربائية الصغيرة ليتم الكشف عن، ومع ذلك، هناك عيوب المرتبطة باستخدام هذه الطريقة، على النحو المبين في الجدول 1. عمو.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقدمت اثنين من بروتوكولات مختلفة لعزل ومعالجة وتحليل المركبات الكهربائية، وذلك باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. اختيار أنسب طريقة لاستخدام ليست دائما واضحة ويتطلب فهما للعينة التي يجري اختبارها وكذلك مجموعات سكانية فرعية فردية من الفائدة. وعلاوة على ذلك، يجب النظر حساسية عداد الكريات المستخدمة للحصول عند اختيار أنسب طريقة. في كثير من الأحيان ليس هناك أفضل بروتوكول واحد للاستخدام، بل مزيج من الأساليب يوفر مزيد من المعلومات حول عينة من أي طريقة واحدة فقط. من الناحي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر دايل Hirschkorn من معهد بحوث النظم الدم لمساعدته مع تدفق عداد الكريات ضبط الصك. كان مدعوما من المعاهد الوطنية للصحة هذا العمل يمنح HL095470 وU01 HL072268 وعقود وزارة الدفاع W81XWH-10-1-0023 وW81XWH-2-0028.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LSR II مقياس التدفقBiosciences3-الليزر (20 ميجاوات ياقوت متماسك 488 نانومتر أزرق ، 25 ميجاوات Vioflame متماسك 405 نانومتر بنفسجي ، و 17 ميجاوات JDS أحادي الطور HeNe 633 نانومتر أحمر)
FACS Diva   ؛BD Biosciencesإصدار 6.0
FlowJo software Treestar USMac الإصدار 9.6.1 أو الكمبيوتر الشخصي الإصدار 7.6.5
556298جسيمات الفلورسنت Sphero RainbowBD Biosciencesلضبط جميع الفولتية للقناة للحفاظ على اتساق شدة التألق  
الجسيمات الفلورية Ultra Rainbow SpherotechURFP-10-5تستخدم بالإضافة إلى حبات Megamix-Plus SSC لضمان اتساق بوابات EV من دفعة إلى أخرى
حبات Megmix-Plus SSCBiocytex7803المستخدمة لضبط FSC و SSC & nbsp; الفولتية للحفاظ على الاتساق   بين الأشواط. يمكن استخدامها أيضا لمراقبة معدل التدفق وقرص معدل التدفق العادل من أجل ضمان استخدام نفس معدل التدفق في جميع عمليات التشغيل
AbC Anti-Mouse Bead KitLife TechnologiesA-10344المستخدمة لعناصر التحكم في التعويض وخرز AbC السلبي المستخدم للطريقة القائمة على الخرز
Nonidet P-40 البديل (NP-40) (CAS 9016-45-9)سانتا كروز & nbsp ؛SC-281108تستخدم في طريقة الكشف الفردية فقط لتحليل العينات بعد القراءة الأولية لاستخدامها كعناصر تحكم سلبية. يمكن تخفيف المخزون إلى 1:10 في PBS وتخزينه في الثلاجة لمدة تصل إلى شهر واحد.
340334BD TruCOUNT TubesBD Biosciencesعند الحاجة إلى تركيزات EV المطلقة
Ultrafree-MC و GV 0.22 و micro ؛ م وحدات تصفية الطرد المركزيMillipore UFC30GVNBتستخدم لغسل Evs و / أو تجزئة EVs بناء على حجم
زجاج Vacutainer أنابيب الدم الكاملة ACD-ABD Biosciences364606
Facs أنابيب 12x75 بوليستيرينBD Biosciences352058
50 مل خزانات ملفوفة بشكل فردي   ؛PhenixRR-50-1s
أطراف ماصة Green-Pak - 10 & لنصائح ماصة RaininGP-L10S
Green-Pak -200 & micro ؛ l RaininGP-L250S
أطراف ماصة خضراء - 1,000 وميكرو ؛ l RaininGP-L1000S
Stable Stack L300 نصائح معقمة مسبقاRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 قنوات LTS  قابل للتعديل  Spacer RaininLA8-300XLS
96 ألواح ثقافة الأنسجة الجيدةE & K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Media (بدون Hepes)زراعة الخلايا UCSFCCFAE001الوسائط المستخدمة لطريقة الكشف القائمة على الخرز
Dulbeccos PBS D-PBS ، خالية من CaMg ، 0.2 & micro ؛ ممنشأة ثقافة الخلايا UCSFالمفلترة CCFAL003
أنبوب الطرد المركزي الفائق ، Thinwall ، لوحة 344058 فائقة الوضوحBECKMAN COULTER INC
I CD3
PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 & micro ؛ ل
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 & micro ؛ ل
CD16 V450BD Biosciences5604742 & micro ؛ ل
CD28 FITCbiolegend3029062 & micro ؛ ل
CD152 APCBD Biosciences5558552 & micro ؛ ل
CD19 A700Biolegend3022262 & micro ؛ ل
لوحة II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 & micro ؛ ل
CD62L APCBiolegend3048102 & micro ؛ ل
CD108 PE & nbsp ؛BD Biosciences5528302 & micro; ل
CD235a FITCbiolegend3491042 & micro ؛ ل
لوحة III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 & micro ؛ ل
CD62p APCBiolegend3049102 & micro ؛ ل
CD66b PE & nbsp ؛Biolegend3051062 & micro; ل
CD15 FITCexalphaX1496M5 & micro ؛ ل
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 MS IgG2a ، & kappa ؛بيوليجند400230
الخلوي BD برنامج تستخدم استخدام مرفق

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesFlow CytometryBead Based DetectionIndividual DetectionPlatelet Poor PlasmaAntibody StainingCytometer SetupFluorescent ParticlesPolystyrene BeadsForward Scatter

Related Articles