شرطي عبر التشابك الوراثية للبحث عن المفقودين في المخ الجنينية الماوس

Devesh Kumar; Ulrich Boehm

doi:10.3791/52487

مقالة منهجية

شرطي عبر التشابك الوراثية للبحث عن المفقودين في المخ الجنينية الماوس

DOI:

10.3791/52487

⸱

ديسمبر 22, 2014

Devesh Kumar¹ , Ulrich Boehm¹

¹Department of Pharmacology and Toxicology, University of Saarland School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالاستفادة من استراتيجية وراثية ثنائية ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتتبع الدوائر العصبية في الفئران التي تعبر عن متتبعات تكميلية عبر المشبكي بعد إعادة التركيب بوساطة Cre. نظرا لأن إنتاج التتبع الخاص بالخلية مشفر وراثيا ، فإن نهجنا التجريبي مناسب لدراسة تكوين ونضج الدوائر العصبية أثناء نمو الدماغ الجنيني للفئران بدقة خلية واحدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تتبع المسار التشريحي ذا أهمية محورية لفك تشفير العلاقة بين الدماغ والسلوك. ومع ذلك ، فإن كشف تكوين الدوائر العصبية أثناء النضج الجنيني للدماغ يمثل تحديا تقنيا لأن معظم طرق التتبع عبر المشبكي التي تم تطويرها حتى الآن تعتمد على حقن التتبع التجسيمي. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير استراتيجية وراثية ثنائية للتتبع الجيني المشروط عبر المشبكي في دماغ الفأر. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بإنشاء سلالتين تكميليتين من الفئران للتعبير بشكل انتقائي عن ليكتين الشعير ثنائي الاتجاه عبر المشبكي (BL) وجزء التتبع عبر المشبكي الرجعي من موضع ROSA26 بعد إعادة التركيب بوساطة Cre. يتم ترميز إنتاج التتبع الخاص بالخلايا في هذه الفئران وراثيا ولا يعتمد على حقن التتبع الميكانيكي. لذلك فإن نهجنا التجريبي مناسب لدراسة تكوين الدوائر العصبية في دماغ الفئران الجنينية. علاوة على ذلك ، نظرا لأن نقل التتبع عبر نقاط الاشتباك العصبي يعتمد على النشاط المشبكي ، يمكن استخدام سلالات الفئران هذه لتحليل الاتصال بين مجموعات الخلايا العصبية المحددة وراثيا أثناء نمو الدماغ بدقة خلية واحدة. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا للتتبع عبر المشبكي في أجنة الفئران باستخدام أليلات ROSA26 المؤتلفة الجديدة. لقد استخدمنا هذه التقنية التجريبية من أجل تحديد الدوائر العصبية الكامنة وراء نضج المحور التناسلي في دماغ أنثى الفأر النامي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتبع مسار التشريحية هي واحدة من الأدوات المستخدمة الأكثر شيوعا فك العلاقة بين الدماغ والسلوك ^1. التقدم في تقنيات تتبع الدائرة العصبية أسبغها علماء الأعصاب لديهم القدرة على تتبع الدوائر العصبية من الخلايا العصبية التي تم تحديدها السكان وراثيا في الفئران ^2. وعلى الرغم من هذه التطورات التقنية التي لا يزال تحديا لكشف تشكيل الدوائر العصبية وخاصة أثناء نضوج الجنينية. وذلك لأن معظم طرق تتبع ضعت حتى الآن تعتمد على حقن التجسيمي من استشفاف عبر التشابك أو الفيروسات موجه للعصب المعدلة وراثيا (الشكل 1) ^2،3. في حين أن هذه التقنيات في تحقيق قرار المكاني والزماني للاتصال، العديد من القيود المتأصلة مثل الحقن تحديا تقنيا التتبع في الدماغ النامية، استنساخ موقع الحقن، والتهاب محتمل في موقع الحقن والأكثر المجمدةسمية الخلايا tantly التي تسببها الفيروسات موجه للعصب تحد من استخدامها ^4.

طريقة بديلة هو للتعبير عن استشفاف عبر التشابك كما الجينات المحورة في الفئران المعدلة وراثيا. لقد تم تعديلها مؤخرا هذه التقنية، ووضع عبر التشابك الجيني النظام الثنائي تتبع لرسم خريطة الدوائر العصبية من الخلايا العصبية التي تم تحديدها أية مجموعة من السكان وراثيا ^5. ويستند لدينا استراتيجية تجريبية على اثنين من سلالات جديدة الضربة القاضية في الماوس والتي تعبر إما كتين ثنائي الاتجاه التتبع الشعير (BL) ⁶ أو التتبع الوراء الكزاز السمية جزء C تنصهر إلى GFP (GTT) ⁷ من موضع ROSA 26 بعد بوساطة لجنة المساواة العرقية- إعادة التركيب. نحن هنا تستخدم هذه السلالات الماوس للتعبير عن انتقائي BL وGTT في الخلايا العصبية التي تنتج kisspeptin، وهو نيوروببتيد الذي تورط في تنظيم نضوج محور الإنجاب ^8،9. علينا أن نظهر أن هذه التقنية هي مناسبة لتصور تنمية ونضوج قبلةالدوائر العصبية peptin أثناء التطور الجنيني للدماغ الفأر الإناث ^5.

استراتيجية تربية

وR26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) وR26-GFP-TTC (GTT) خطوط التتبع هي الضربة القاضية في سلالات ⁵ التي تحمل أليل ROSA26 المؤتلف. وR26-BIZ والأليلات R26-GTT صامتون transcriptionally بسبب وجود إشارة توقف النسخي قوية، والتي يحيط بها موقعين loxP ^5. يتم تنشيط تعبير عن BIZ وGTT التحوير عن طريق إزالة لجنة المساواة العرقية بوساطة إشارة توقف النسخي. الأليلات R26-R26-BIZ وGTT يمكن استخدامها بشكل مستقل من قبل ببساطة الحدودي مع خط سائق لجنة المساواة العرقية. يمكن للحيوانات تحليل متخالف لجنة المساواة العرقية وR26 الأليلات منها استخدامها. تتزاحم تحمل لجنة المساواة العرقية واحد أو واحدة R26 أليل، على التوالي، وينبغي أن تستخدم والضوابط. بدلا من ذلك، فمن الممكن أيضا لتوليد رriple الضربة القاضية في الحيوانات التي تحمل لجنة المساواة العرقية، R26-R26-BIZ وGTT الأليلات، ولكن هذا سيتطلب واحد عبر إضافية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتمت الموافقة على إجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان من جامعة هامبورغ وجامعة سارلاند: ملاحظة: أخلاقيات الإعلان.

1. إعداد وتثبيت من الأنسجة الجنينية

ترتيب جميع المعدات اللازمة لتشريح من الأجنة وإعداد الحلول لتثبيت لاحق من الأنسجة قبل التضحية الحيوانات.
ملاحظة: إعداد دائما الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) حل (4٪ PFA في 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4).
الموت ببطء توقيت الماوس الإناث الحوامل مع إجراء الموافقة أخلاقيا.
نقل الماوس في الصعود إلى المنصة. الرطب الجانب البطني من البطن مع الايثانول 70٪ وجعل شق عمودي باستخدام مقص حاد لفضح تجويف البطن.
تحديد سلسلة الجنينية والخروج به باستخدام ملقط بعناية حادة ووضعه في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
إزالة الأجنة الفردية منسلسلة الجنينية باستخدام مقص الجميلة وملقط. إزالة الأنسجة الزائدة حول الأجنة وغسلها في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
أخذ خزعة ذيل صغير (قبل نقل الجنين إلى PFA)، واحتضان في ذيل العازلة تحلل لتحديد نوع الجنس والتتبع أليل التنميط الجيني PCR.
نبدأ من الجنين في الجانب الأكثر الجانبي ونقل كل جنين منفصل في أنبوب يحتوي على الجليد الباردة PFA 4٪ على الجليد على شاكر.
نقع الأجنة في سن E13.5 أو أقل مقابل 1.5 ساعة على الجليد مع الهز المستمر. نقع الأجنة في E14.5 العمر وE15.5 مقابل 2.5 ساعة على الجليد مع الهز المستمر.
لE16.5 الأجنة العمر أو كبار السن، وقطع رأس وإزالة الجلد الخارجي قبل تمرغ رأسه في حل PFA. رؤساء الأجنة E16.5 يمكن أن تكون غارقة ل 4.5 ساعة على الجليد مع الهز المستمر.
بعد تثبيت المناسب، وغسل الأجنة ثلاث مرات مع PBS الجليد الباردة. نقل الأجنة إلى 30٪ السكروز في حل PBS في 4 درجات مئوية حتى تغرقإلى أسفل.

2. التجميد

ترتيب كل المواد المطلوبة قبل البدء في عملية التجميد: البرد العفن، والبرد القفازات، وملقط وزن الريشة علم الحشرات، علامة من ركلة جزاء والقطع الأمثل درجة حرارة مجمع (OCT)
تسمية العفن البرد مع مقاومة للكحول دائمة علامة (ناهيك عن التوجه من الأنسجة، وتاريخ وراثى). إعداد طين من سحق الثلج الجاف، و 100٪ من الإيثانول في دلو الجليد. وضع دورق زجاجي داخل تحتوي على isopentane. الانتظار لمدة 10 دقيقة لisopentane ليبرد.
وفي الوقت نفسه إزالة الأنسجة من محلول السكروز، تمحو السكروز الزائدة حول الأنسجة باستخدام مناديل المختبر. نقل الأنسجة إلى صفت ما قبل البرد العفن مع ما يكفي من أكتوبر لتغطية الأنسجة. تجنب أي فقاعات الهواء في OCT. وخصوصا حول الأنسجة.
توجيه الأنسجة في أكتوبر باستخدام ملقط علم الحشرات وزن الريشة لتجنب تلف الأنسجة. بدء التجميد عن طريق نقل البرد مولد في حمام isopentane تبريد مسبقا. لا دفقة isopentane في OCT لأنها لن تجمد بشكل صحيح. التفاف العينات في رقائق الألومنيوم وتخزينها في -80 ° C.

3. Cryosectioning

قطع 14 ميكرون أقسام مسلسل رقيقة في سلسلة 'من خمسة باستخدام ناظم البرد وجمع على الشرائح الزجاجية SuperFrost® زائد لالمناعي (IF) التحليل. تخزين الشرائح في -80 ° C لحين الاستفادة منها.

4. الراسم التصور عن طريق بروتوكول (TSA) Tyramide الإشارة التضخيم

إعداد مخازن والكواشف اللازمة لتلطيخ. دائما طازجة إعداد عازلة تريس، كلوريد الصوديوم-توين (تي ان تي) في يوم من الاستخدام.
1. إعداد TNT عازلة باستخدام 100 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 30 مل من 5 M كلوريد الصوديوم وده ₂ O تصل إلى الحجم النهائي من 1 L. إضافة 500 ميكرولتر من توين 20 باستخدام ماصة 1 مل. إضافة توين 20 ببطء وتدفق ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات للتأكد من أن جميع توين 20 فيالحل.
2. إعداد تريس، كلوريد الصوديوم-حجب (TNB) عازلة باستخدام 100 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 30 مل من 5 M كلوريد الصوديوم وده ₂ O تصل إلى الحجم النهائي من 1 L. إضافة 5 ز حجب الكاشف (المتوفرة مع طقم) ببطء بزيادات صغيرة إلى المخزن المؤقت مع التحريك. تسخين حل تدريجيا إلى 55 درجة مئوية مع التحريك المستمر بحل تماما الكاشف حجب (هذا لا ينبغي أن يستغرق وقتا أطول من 30-60 دقيقة). لتحقيق التدفئة متجانسة استخدام حمام مائي عند 55 ° C. فإن الحل يبدو حليبي. جلب الحل لدرجة حرارة الغرفة قبل استخدام. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
3. إعادة البيوتين tyramide كاشف (المقدمة مع عدة) في علم الأحياء الجزيئية / HPLC الصف DMSO. اعتمادا على أساسها يستخدم عدة كمية مناسبة من DMSO قد تختلف. تخزين الحل السهم عند 4 درجات مئوية.
  ملاحظة: أقسام من الحيوانات متخالف لجنة المساواة العرقية وR26 الأليلات منها يمكن استخدامها لتحليل الدوائر. استخدام الصورةections من تتزاحم تحمل لجنة المساواة العرقية واحد أو واحدة R26 أليل، على التوالي، وضوابط السلبية. علاج الشرائح سيطرة سلبية تماما مثل الشرائح من الحيوانات متخالف مزدوجة. وبالإضافة إلى ذلك، تشمل شريحة واحدة تحكم من حيوان متخالف مزدوجة ولكن يستبعد الكاشف TSA (مراقبة unamplified).
باستخدام مشرط حاد الطازجة إزالة الزائد أكتوبر المحيطة أقسام الأنسجة وعلامة الحدود حول أقسام بالقلم PAP.
تجف الشرائح لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق لكل منهما. احتضان الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة في 0.3٪ H ₂ O ₂ حل في الميثانول الجليد الباردة لإرواء النشاط البيروكسيداز الذاتية.
غسل 3X مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل في RT. احتضان لمدة 10 دقيقة في 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني عن permeabilization الأنسجة. تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق لكل منهما.
كتلة مع TNB (عرقلة الحل، 200-300 ميكرولتر لكل شريحة) لمدة 30دقيقة في RT في غرفة ترطيب. تأكد من تغطية جميع الأقسام بالكامل من قبل TNB. لا تدع الشرائح تجف بين الخطوات.
تصريف عازلة تمنع الزائد وتطبيق مصل الأساسي الاعتراف التتبع (1: 1،000 الماعز المضادة للWGA لBL، 1: 15،000 أرنب مكافحة GFP لGTT) مخففة في TNB لمدة 2 ساعة على RT أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تأكد من استخدام حجم ما يكفي لتغطية كامل قسم الأنسجة (200-300 ميكرولتر لكل شريحة).
ملاحظة: والتخفيفات أمصال مضادة الأولية الموصى بها هنا قد تضطر إلى تعديل.
تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق مع كل الانفعالات.
احتضان المقاطع مع مصل الثانوي المعقدة البيروكسيديز الاعتراف المضيف للمصل الأول (1: 500 حصان مكافحة الماعز مفتش لمكافحة WGA، 1: 5،000 الماعز مفتش المضادة للأرنب لمكافحة GFP في TNB لمدة 1 ساعة على RT).
غسل 3X مع TNT في RT لمدة 5 دقائق مع كل الانفعالات. احتضان في 1: 100 streptavidin (SA) -conjugated الفجل البيروكسيديز (SA-HRP، شريطة وايث طقم) في TNB لمدة 30 دقيقة في RT في غرفة ترطيب. تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق لكل منهما. وفي الوقت نفسه ذوبان الجليد في TSA.
تمييع TSA 01:50 في TSA التضخيم مخفف (تقدم مع عدة، واستخدام عدة TSA لتصور BL وعدة TSA + لGTT). احتضان أقسام الأنسجة في المخفف TSA للبالضبط 10 دقيقة في RT. تمييع TSA فقط قبل الاستخدام، من الناحية المثالية خلال الخطوة غسل السابقة، لا تستخدم أي المتبقية المخفف كاشف TSA للتجارب في المستقبل؛ إعداد دائما الطازجة.
تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق مع كل الانفعالات. احتضان مع 1: 500 اليكسا Fluor® 546 streptavidin المتقارن في TNB لمدة 30 دقيقة في RT. تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق مع كل الانفعالات.
احتضان لمدة 10 دقيقة في 5٪ محلول bisbenzimide في برنامج تلفزيوني في RT لتلطيخ النووي. تغسل الشرائح في RT 3X مع تي ان تي لمدة 5 دقائق مع كل الانفعالات. جبل مع Fluromount G وأداء epifluorescence أو المجهري متحد البؤر.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: سوف فاعلية نقل التتبع تعتمد على مستوى التعبير عن موضع ROSA26 في الخلايا المنتجة (يحدده خط سائق لجنة المساواة العرقية المستخدمة) وعلى الدوائر العصبية تحليلها (مثل عدد من الخلايا العصبية المنتجة للالتتبع، والتقارب الخ). وبالتالي فإن التخفيفات أمصال مضادة الأولية الموصى بها هنا قد يكون من الضروري تعديلها لمنع إشارة منخفضة أو الزائدة. وينبغي دائما أن تحليل الخلفية باستخدام الشرائح المكافحة المناسبة (انظر أعلاه).

5. τlacZ تلطيخ لأقسام الجنينية

إعداد مخازن والكواشف اللازمة لتلطيخ. دائما طازجة إعداد LacZ عازلة C قبل الاستخدام.
إعداد 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-غال) حل سهم (40 ملغ / مل) وذلك بإضافة 40 غرام من X-غال إلى 1 مل 70٪ ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF). يغطى الطبق بورق الألمنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
إعداد نتروبلو الأزرق نيترو (NBT) شارعاوك الحل (50 ملغ / مل) وذلك بإضافة 50 غرام من NBT إلى 1 مل 70٪ DMF. يغطى الطبق بورق الألمنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
إعداد LacZ تثبيتي باستخدام 80 ميكرولتر من 25٪ غلوتارالدهيد، 5 مل من 4٪ PFA، 20 ميكرولتر من 1 M MgCl _2، 100 ميكرولتر من 500 ملي EGTA، 1 مل من 1 M الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.4 و ده ₂ O ما يصل الى المباراة النهائية حجم 10 مل.
إعداد LacZ العازلة وباستخدام 1 مل من 1 M MgCl _2، 5 مل من 500 ملي EGTA، 50 مل من 1 M عازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4 و ده ₂ O تصل إلى الحجم النهائي من 500 مل.
إعداد LacZ عازلة B باستخدام 1 مل من 1 M MgCl _2، 5 مل من 500 ملي EGTA، 5 مل من 1٪ deoxycholate الصوديوم، و 100 مل من 10٪ NP-40، 50 مل من 1 M الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.4 و ده ₂ O تصل إلى الحجم النهائي من 500 مل.
إعداد LacZ عازلة C من خلال إضافة 10 ميكرولتر من NBT حل الأسهم و 12.5 ميكرولتر من X-غال حل الأسهم إلى 1 مل من LacZ عازلة B. جعل الطازجة قبل استخدامها، وتغطي بورق الألمنيوم.

تجفيف الشرائح في RT على الأقل لمدة 10-15 دقيقة (في الوقت نفسه إعداد الشرائح مع PAP القلم).
إصلاح القسم مع LacZ تثبيتي لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة ترطيب داخل مادة كيميائية الدخان هود. يغسل 3 مرات مع PBS تستكمل مع 2 مم MgCl _2.
شطف الشرائح مع LacZ عازلة A. تغسل الشرائح مع LacZ العازلة و3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT. اغسل 2 مرات مع LacZ عازلة B لمدة 5 دقائق لكل منهما. احتضان الشرائح في LacZ عازلة C في 30-37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو طوال الليل في غرفة ترطيب.
ملاحظة: إضافة كمية كافية من LacZ عازلة C. يجب أن الشرائح لا تجف أثناء الحضانة.
بعد مرور فترة الحضانة المناسبة غسل الشرائح مع PBS تستكمل مع 2 مم MgCl _2. شطف أقسام لفترة وجيزة مع DDH ₂ O. ساترة مع الجلايسين الجيلاتين ماير. مناسبة للمجهر الضوء مجهزة تدخل الفرق النقيض (DIC) تصوير مجموعة المتابعة.
6. Gendإيه والراسم انماط
إعداد ذيل العازلة تحلل باستخدام 1 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.5، 100 ميكرولتر من 500 ملي EGTA، 200 ميكرولتر من 10٪ SDS، 400 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم وده ₂ O لتعويض الحجم النهائي من 10 مل.
إضافة 500 ميكرولتر من العازلة ذيل تحلل لكل أنبوب إيبندورف تحتوي على خزعة الذيل. إضافة بروتين K إلى التركيز النهائي من 100 ملغ / مل. احتضان بين عشية وضحاها على شاكر في 55 ° C.
عينات الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. نقل طاف لأنبوب الطرد المركزي الجديدة. إضافة 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول لطاف. مزيج لمدة 5 دقائق على الأقل قبل قلب الأنابيب صعودا وهبوطا.
تدور في أجهزة الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تخلصي من طاف. إضافة 200 ميكرولتر من الايثانول 70٪. يهز لمدة 5 دقائق على الأقل.
أجهزة الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف مع Pipetman (لا صب إيقاف). تجفيف بيليه في غرفة دافئة (37 درجة مئوية) لمدة 15-30 دقيقة.
بيليه resuspend في 100 ميكرولترمن انخفاض TE الرقم الهيدروجيني 8.0 أو المياه باستخدام نصائح واسعة الجوف تصفيتها. وضعت في 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وعند 37 درجة مئوية خلال الليل لتذويب المناسب. تخزينها في 4 ° C.
استخدام 1 ميكرولتر من الحمض النووي للتفاعل PCR (50 ميكرولتر خليط التفاعل تحتوي على 1 ميكرولتر من الحمض النووي الذيل، 2.5 ميكرولتر DMSO، 10 مساء من كل التمهيدي، 25 ميكرومتر لكل dNTP، و1M البيتين). وترد الاشعال PCR لالتنميط الجيني وتحديد نوع الجنس في جدول المواد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرض هذا القسم نتائج ممثلة التي يمكن الحصول عليها العمل مع R26-BIZ (B L- I RES-τlac Z) وR26-GTT (G FP- TT C) الأليلات. نحن هنا استخدام R26-BIZ والأليلات R26-GTT لتحليل نضوج الدوائر العصبية التي تنظم محور الإنجاب. يتم التحكم الاستنساخ في الفقاريات مركزيا من قبل مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية في منطقة ما تحت المهاد، التي تفرز هرمون إفراز الغدد التناسلية (نره]). Kisspeptin، منشط قوي من الخلايا العصبية نره]، وقد تورط في تنظ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معربا عن استشفاف عبر التشابك كما الجينات المحورة لتتبع الدوائر العصبية من السكان العصبية محددة وراثيا ديها العديد من المزايا مقارنة مع الحقن التجسيمي من استشفاف أو الفيروسات neurotopic. أولا، يتم إنتاج التتبع باعتبارها بروتين الذاتية، وبالتالي لا تثير أي رد فعل مناعي ويمكن تحليل مسار العصبي انتقائية في الحيوانات المختلفة مع استنساخ عالية. ثانيا، لأن هذا هو أسلوب غير الغازية فإنه يمكن استخدامها لتتبع الدوائر من الخلايا العصبية لا يمكن الوصول إليها بسهولة لحقن التجسيمي، على سبيل الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مايكل كاندليش على التعليقات النقدية على المخطوطة. تم دعم هذا المشروع من قبل منح Deutsche Forschungsgemeinschaft BO1743 / 6 و SFB / TRR 152 P11 و Z02 إلى أولريش بوهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بيسبينزيميد (صبغة Hoechst 33258)	Sigma	14530-100MG
Ethanol	Sigma	32205-1L
Cryo Mould (Peel-a-way)	Polyscience Inc.	18646A-1	22 × 22 × 20 مم
DMSO	Sigma	D8418-100ML
ثنائي ميثيل فورماميد (DMF)	VWR للكيماويات	23470،293
EGTA	ROTH	3054.3
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
Glutaraldehyde	Sigma	G5882-50ML
بيروكسيد الهيدروجين	Sigma	34988-7
إيزوبنتان (ميثيل 2-بيوتان)	سيجما	M32631-2.5L
جيلاتين كايزر	ميرك	1092420100
ميثانول	سيجما	494437-1L
MgCl_{2< / sub>}	Sigma	M2670-100G
كلوريد الصوديوم		ROTH HN00.2
NBT	سيجما	298-83-9
بديل Nonidet P40	Fluka	743.85
OCT	Leica	14020108926
قلم PAP	Dako	S2002
Parafarmaldehyde	Sigma	P6148-1KG
ديوكسيكولات الصوديوم	Sigma	D6750-25G
السكروز	Sigma	S7903-1KG
شرائح Superfrost	Thermo Scientific	FT4981GLPLUS
مجموعة TSA	PerkinElmer	NEL700
TSA plus kit	PerkinElmer	NEL749A001KT
Tris	ROTH	AE15.2
Triton-X 100	ROTH	3051.2
Tween 20	ROTH	9127.1
X-gal	ROTH	2315.1
مجهر Cryostat	Leica	na
Light مزود بتصوير DIC	Zeiss	Axioskop2 مزود ببرنامج
مجهر Fluroscence	Zeiss	Axioskop2 المجهز ببرنامج
Photoshop	Adobe	PS6
Goat anti-WGA (يتعرف على BL)	Vector Laboatories	AS-2024
البيوتينيلاتد الحصان المضاد للماعز IgG	Vector Laboatories	BA-9500
البيوتينيل الماعز المضاد للأرانب IgG	Vector Laboatories	BA-1000
Rabbit anti-GFP (يتعرف على GTT)	Invitrogen	A11122
Rabbit anti-GnRH	Affinity Bio Recode	PA1-121
Dylight488-donkey مضاد للأرانب IgG	Thermo Scientific	SA5-10038
SA-Alexa Fluor 546	Life Technologies	S-11225
Primers
BL Fwd (للتنميط الجيني BIZ)	Eurofins MWG Operon		ATGAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (للتنميط الجيني BIZ)	Eurofins MWG Operon		AGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (للتنميط الجيني ل Cre)	Eurofins MWG Operon		GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (للتنميط الجيني Cre)	Eurofins MWG Operon		CCAGGCTAAGTGCCTTCTCACCTGC
TTC Fwd (للتنميط الجيني GTT)	Eurofins MWG Operon		AGCAAGGGCGAGGCTGTT
TTC Rev (للتنميط الجيني GTT)	Eurofins MWG Operon		GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (للتنميط الجيني للجنس)	Eurofins MWG Operon		TGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (للتنميط الجيني للجنس)	Eurofins MWG Operon		CCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 Fwd	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTGAGTTGTTATC
ROSA26 Rev	Eurofins MWG Operon		GCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA Rev	Eurofins MWG Operon		CGAAGTCGCTGAGTTGTTATC

Axio VisionAxio Vision

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).
Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291, 2608-2613 (2001).
Kumar, D., et al. Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero. J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).
Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. A genetic approach to trace neural circuits. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).
Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).
De Roux, N., et al. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).
Seminara, S. B., et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).
Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).
Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).
Seibler, J., et al. Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice. Nucleic Acids Res. 33, e67(2005).
Semaan, S. J., Kauffman, A. S. Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene. Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).
Feil, R., et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cre ROSA26 C

شرطي عبر التشابك الوراثية للبحث عن المفقودين في المخ الجنينية الماوس

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة