مقالة منهجية

دليل لتوليد واستخدام hiPSC الشخصيات المستمدة لدراسة الأمراض العصبية

DOI:

10.3791/52495

⸱

فبراير 21, 2015

 ,  , 
1Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيف يمكن تمييز الخلايا السلفية العصبية عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، من أجل إنتاج مجموعة خلايا عصبية قوية وقابلة للتكرار ، والتي يمكن استخدامها لتحديد المسارات التنموية التي تساهم في التسبب في المرض في العديد من الاضطرابات العصبية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسات ما بعد الوفاة للأمراض العصبية ليست مثالية لتحديد الأسباب الكامنة وراء بدء المرض ، حيث تتضمن العديد من الأمراض فترة طويلة من تطور المرض قبل ظهور الأعراض. نظرا لأنه يمكن إعادة برمجة الخلايا الليفية من المرضى والضوابط الصحية بكفاءة إلى خلايا جذعية متعددة القدرات (hiPSCs) ، ثم يتم تمييزها لاحقا إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs) وخلايا عصبية لدراسة هذه الأمراض ، فمن الممكن الآن تلخيص الأحداث التنموية التي حدثت قبل ظهور الأعراض لدى المرضى. نقدم طريقة يمكن من خلالها تمييز hiPSCs بكفاءة إلى غير قابلة للعب ، والتي بالإضافة إلى كونها قادرة على مزيد من التمايز إلى خلايا عصبية وظيفية ، يمكن أيضا تمريرها بقوة أو إذابتها بالتجميد أو نقلها لتنمو كمجالات عصبية ، مما يتيح الفحص الجيني السريع لتحديد العوامل الجزيئية التي تؤثر على الأنماط الظاهرية الخلوية بما في ذلك النسخ المتماثل والهجرة والإجهاد التأكسدي و / أو موت الخلايا المبرمج. تعد nipsc غير القابلة للعب المشتقة من المريض منصة فريدة من نوعها ، ومناسبة بشكل مثالي للاختبار التجريبي للعواقب الخلوية أو الجزيئية للتلاعب بالتعبير الجيني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسات التعبير الجيني للخلايا العصبية متباينة في المختبر من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) من قبلنا 1 وغيرها 2،3 تشير إلى أن الخلايا العصبية hiPSC تشبه الجنين بدلا من الكبار أنسجة المخ. في الوقت الحاضر، قد تكون النماذج القائمة hiPSC-أكثر ملاءمة لدراسة الاستعداد ل، بدلا من الميزات في وقت متأخر من، والأمراض العصبية. لقد ذكرت سابقا أن جزءا كبيرا من التوقيع الجيني لفصام الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC يتم حفظها في الفصام الخلايا الاصلية العصبية المشتقة من hiPSC (الشخصيات)، مشيرا إلى أن الشخصيات قد يكون نوع من الخلايا مفيدة لدراسة المسارات الجزيئية المساهمة في الفصام 1 . نحن وغيرنا وأفادت الهجرة الشاذة، وزيادة الإجهاد التأكسدي وأنواع الاكسجين التفاعلية، حساسية للضغوط البيئية عتبة الفرعية وظيفة الميتوكوندريا ضعف في الفصام hiPSC الشخصيات 1،4-6، وكذلك انخفضت العصبية جonnectivity وظيفة متشابك في الخلايا العصبية الفصام hiPSC 5،7-10. إذا كانت العوامل الجزيئية المساهمة في الهجرة الشاذة و / أو الاكسدة في الفصام hiPSC الشخصيات أيضا تكمن وراء اتصال الخلايا العصبية انخفاض في الفصام الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC، يمكن أن تكون الشخصيات السكان العصبي القوي وتنسخي للغاية مع الذي لدراسة الآليات المسؤولة عن المرض. وعلاوة على ذلك، لأن واحدا يمكن أن تولد بسرعة أعداد كبيرة من الخلايا وليس من الضروري الانتظار أسابيع أو أشهر لنضوج الخلايا العصبية، المقايسات مقرها NPC-هي مناسبة لدراسة الأفواج الكبيرة المرضى واكثر سهولة في ارتفاع الفرز الإنتاجية. ونحن نعتقد أن hiPSC الشخصيات يمكن أن تكون بمثابة وكيل لمسارات التنمية المحتمل أن تساهم في التسبب بالمرض، كما سبق أن تظاهروا في اضطرابات متنوعة مثل انفصام الشخصية (1) وهنتنغتون المرض 11.

للتمييز الشخصيات من hiPSCs، العصبية الأولية فيويتم إنجاز الدرفلة الجديد من قبل المزدوج لل Smad تثبيط (0.1MM LDN193189 و 10mm SB431542) 12. عن طريق استعداء BMP و TGF يشير مع هذه الجزيئات الصغيرة، ويتم حظر الأديم الباطن ومواصفات الأديم المتوسط، وتسريع تمايز الخلايا العصبية ويؤدي إلى تشكيل ريدات العصبية واضحة خلال أسبوع واحد من الطلاء. يحدث الزخرفة العصبية في هذه العملية في وقت مبكر، ويفترض خلال فترة تشكيل ريدة العصبي وبعد ذلك مباشرة. في غياب العظة أخرى، تفترض هذه الخلايا العصبية البدائية لمثل الدماغ الأمامي مصير الأمامي 13. مباشرة بعد تشكيل ريدة العصبي، ومستمرة طوال التوسع مجلس الشعب، الشخصيات الدماغ المقدم تستزرع مع FGF2 8،14. لديهم إمكانات النسب المزدوجة، ويمكن أن تكون متباينة للسكان العصبي من 70-80٪ الخلايا العصبية III-تويولين إيجابية و20-30٪ ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) النجمية -positive (الشكل 1). الغالبية العظمى من الخلايا العصبية الدماغ الأمامي hiPSC هي-VGLUT1 إيجابية، وهكذا هي يفترض glutamatergic، على الرغم من أن ما يقرب من 30٪ من الخلايا العصبية هي-GAD67 الموجب (GABAergic) 8.

الشخصيات و passaged بشكل روتيني أكثر من عشر مرات في المختبر، مع الحفاظ على ملامح التمايز متسقة، وبدون تراكم التشوهات النمط النووي. وذكرت جماعات الشخصيات الركض أكثر من 40 مرة 15، ومع ذلك، نجد أن وراء عشر الممرات والشخصيات تظهر زيادة الميل للنجمية التمايز. الشخصيات جيدا يتسامح متعددة تجميد يذوب ويمكن تحويلها لزراعة كما neurospheres ببساطة عن طريق زراعة في لوحات غير ملتصقة. وtransduced الشخصيات بكفاءة عن طريق النواقل الفيروسية، التي تمكن من تقييم سريع للعواقب الجزيئية والخلوية من اضطراب وراثي، وقابلة للتوسيع بسهولة لانتاج مادة كافية للدراسات كيميائية حيوية. وعلاوة على ذلك، لأن ناقلات فيروسية قوية تسمح الإفراط في التعبير و / أو ضربة قاضية للجينات الأمراض ذات الصلة، في أي سيطرة أو المريض المستمدة neurخلايا القاعدة ويمكن للمرء أن استخدام هذه المنصة لاختبار تأثير الخلفية الوراثية على هذه التلاعبات. وإن لم تكن مناسبة لمتشابك أو فحوصات على أساس النشاط التي تتطلب الخلايا العصبية الناضجة، قد الشخصيات يكون بديلا عمليا لكثير من التحليلات الجزيئية أو البيوكيميائية واضحة من الخلايا المشتقة من المريض العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hiPSC التمايز إلى خلايا العصبية السلف

  1. النمو والتوسع hiPSCs في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HES) وسائل الاعلام (الجدول 1) شارك في تربيتها على الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEF) طبقة المغذية حتى كبيرة (ولكن subconfluent) مستعمرات جاهزة للالتمايز العصبي عن طريق هيئة مضغي الشكل (EB) وسيطة (الشكل 2). ووصف الظروف الروتينية ثقافة hiPSC جيدا في أماكن أخرى 16،17. لفترة وجيزة، وتنمو hiPSCs في وسائل الإعلام HES على طبقة المغذية MEF حتى متموجة، والمرور ثم إنزيمي مع كولاجيناز (1mg / مل في DMEM) وتوسيع ما يقرب من 1: 3 كل 7 أيام.
  2. لإعداد بولي-L-الأورنيثين / laminin لوحات مغلفة، لوحات معطف مع 10 غرام / مل بولي-L-الأورنيثين في الماء المعقم للأسطح البلاستيك (50 غ / مل للأسطح الزجاج)، واحتضان في RT ل3-24 ساعة. يغسل مرة واحدة على الأقل مع الماء المعقم ثم معطف مع 5G / مل Laminin في برنامج تلفزيوني العقيمة في RT ل3-24 ساعة.
    ملاحظة: إذا ملفوفة في البلاستيك، لوحات يمكن أن يكونتخزينها لمدة تصل إلى ستة أشهر عند -20 درجة مئوية.
  3. في يوم 1، ورفع إنزيمي hiPSCs subconfluent (نمت بشكل عام على MEFS، أو hiPSCs نمت في وسائل الاعلام محددة مثل TeSR 18 على Matrigel) من لوحة مستعمرات كبيرة مثل استخدام 1mg / مل كولاجيناز الرابع في DMEM / F12.
    ملاحظة: بعد 1-2 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، المستعمرات سيتم يتحرك في الطبق.
  4. غسل بلطف المستعمرات hiPSC (عن طريق تسوية، وليس الطرد المركزي) 1-2x مع DMEM / F12، resuspend في 2ML / بئر N2 / وسائل الإعلام B27 (الجدول 1) ونقل إلى أطباق غير ملتصقة 6 جيدا (الجمع بين 3 آبار في 1 حسنا) (19).
    ملاحظة: بين عشية وضحاها، والمستعمرات تشكل العائمة تجمعات كروية وصفته "الهيئات مضغي الشكل" (EBS). نتوقع الموت الخلوي كبير.
  5. في يوم 2، لوحات الميل والسماح لتسوية EBS. إزالة بعناية وسائل الإعلام، ويغسل مرة واحدة مع DMEM / F12 لإزالة الحطام. تغذية مع N2 / B27 وسائل الإعلام تستكمل مع مثبطات لل Smad المزدوجة (0.1M LDN193189 و10M SB431542) 12 .
  6. على أيام 3-7، سيحدث neuralization في سياق ثنائي تثبيط لل Smad. تأكد من أن EBS هي مستديرة ولكن ليس الكيسي. تغذية EBS كل يوم الثاني مع وسائل الإعلام N2 / B27 تستكمل مع 0.1M LDN193189 و10M SB431542.
  7. في أيام 7-14، بعد الطلاء من EBS لبولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحات المغلفة، تحقق باستخدام المجهر brightfield أن ريدات العصبية تبدأ في الظهور في غضون بضعة أيام (وصفها بأنها مجموعات من خلايا عصبية ظهارية مستديرة مع apico القاعدية قطبية. الشكل 1). تواصل تغذية EBS ملتصقة كل يوم الثاني مع N2 / B27 وسائل الإعلام تستكمل مع 0.1M LDN193189، 10M SB431542 و 1 غرام / مل laminin.

2. حصاد العصبية ريدات

ملاحظة: نوصي بأن ريدات العصبية أن تحصد إنزيمي باستخدام العصبية روزيت اختيار الكاشف 20 أو كاشف اختيار مماثل. على الرغم ريدات العصبية يمكن التقاطها يدويا في 6 جيدا بولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحة المغلفة، ثيالصورة منهجية تأخذ تدريبا مكثفا لسيده، وتعتمد على مهارة المستخدم، قد تحتاج إلى الجولة الثانية من قطف في يوم 20 إلى إثراء للالشخصيات وتستنزف أنواع الخلايا غير العصبية.

  1. لاختيار الأنزيمية من ريدات العصبية في اليوم 14، وسائل الإعلام نضح من EBS الالتزام وإضافة 1 مل من كاشف العصبي اختيار ردة لكل بئر لوحة 6 جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. مع pipetman P1000، وإزالة بلطف الانزيم من كل بئر. إضافة 1 مل من DMEM / F12 لكل بئر لغسل.
  3. مع P1000، وجمع 1 مل من DMEM / F12 وسرعان ما طرد DMEM / F12 مرة أخرى إلى البئر، وبالتالي فصل وريدات من لوحة. جمع ريدات في أنبوب الصقر.
  4. الماصة 1 مل أخرى من DMEM / F12 وسرعان ما طرد في نفس البئر لفصل ريدات المتبقية. (لا يسحن. حاول أن لا تفريق المجاميع ردة). جمع ريدات العصبية في نفس أنبوب الصقر.
  5. كرر الخطوة 2.4 الضرورة. إذا ريدات لا فصل بسهولة، إضافة موإعادة انزيم وتكرار هذه العملية (الخطوات 2،1-2،4)
  6. تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح غسل، وإعادة تعليق ريدات في 2 مل من مجلس الشعب وسائل الإعلام (الجدول 1). نقل الخلايا (1: 1) في بولي-L-الأورنيثين / Laminin المغلفة 6 لوحة جيدا.
  7. من يوم 15-21، فإن ريدات العصبية التوسع؛ ريدات تغذية كل يوم الثاني مع وسائل الإعلام مجلس الشعب.
  8. تقييم جودة ريدات العصبية والتأكد من أن خلايا تشبه الخلايا الليفية مسطحة لا تتوسع داخل الثقافة.
    ملاحظة: إذا استمرت غير ريدات، ثقافة NPC يمكن في بعض الأحيان إنقاذه من قبل قطف اليدوي، واختيار أفضل فقط من ريدات التقطت في Accutase. فصل 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بيليه، وغسل وصفيحة في وسائل الإعلام مجلس الشعب على 24 جيدا بولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحة المغلفة.

3. التوسع في الخلايا العصبية السلف

ملاحظة: hiPSC الشخصيات يمكن زراعتها على أي Matrigel- أو بولي-L-الأورنيثين / Laminin لوحات المغلفة. نحن عادة استخدام Matrigeل-لوحات لأنها يمكن أن تكون مستعدة بشكل أسرع وبتكلفة أقل.

  1. لإعداد لوحات Matrigel المغلفة، وبسرعة ذوبان الجليد و resuspend قسامة المجمدة 1mg من Matrigel في 24 مل الباردة DMEM / F12 وتوزيعها على الفور 2 مل إلى كل بئر من اثنين من لوحات ستة جيدا. احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: Matrigel يحتاج فقط إلى أن يستنشق، وليس غسلها، مباشرة قبل الاستعمال.
  2. تغذية الشخصيات كل يوم الثاني على التوالي والحفاظ على كثافة عالية جدا أو أنها سوف تفرق تلقائيا إلى الخلايا العصبية.
    ملاحظة: على الرغم من الشخصيات الأكثر رسوخا عادة تقسيم 1: 4 كل أسبوع، الشخصيات مرور منخفضة جدا يمكن تقسيم 1: 2 ونادرا ما مرة واحدة كل أسبوعين.
  3. لتقسيم والإعلام نضح الأولى وإضافة 1 مل دافئ Accutase (1X) لكل بئر من لوحة 6 جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
  4. بلطف نقل خلايا منفصلة في أنبوب 15 مل تحتوي على DMEM / F12 مع إجهاد أقل قدر ممكن. لا يعاير خلايا بينما في الانزيم. خلايا بيليه بواسطة spinniنانوغرام في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. نضح غسل، واعادة تعليق الشخصيات في ~ 1 مل سائل الإعلام NPC لكل بئر الأصلي من 6 جيدا.
    ملاحظة: نتوقع أن بئر متموجة من صحن 6 جيدا ديه مليون 5-10 خلايا. هذا ويمكن التأكد عن طريق عد قسامة 10L من الخلايا باستخدام عدادة الكريات مسبق لإعادة الطلاء.
  6. وبعد اعادة تعليق، الشخصيات إعادة لوحة كما الشخصيات، الخلايا العصبية أو neurospheres. للحفاظ على الشخصيات، لوحة حوالي 1-2000000 خلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا. كفاءة تشكيل neurosphere يمكن أن تختلف بين التجارب وخطوط الخلايا، ولكن يحدث عادة أفضل إذا هي المصنفة بين 200،000 و 1،000،000 خلايا لكل بئر من غير ملتصقة وحة 6 جيدا. إذا حدث التثاقل من neurospheres، والحد من عدد الخلايا المصنف. التفريق إلى الخلايا العصبية، لوحة حوالي 200،000 الخلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا، لتحل محل وسائل الإعلام مجلس الشعب مع وسائل الاعلام الخلية العصبية.
  7. Immunohistochemically التحقق من صحة كل سطر مجلس الشعب المقررة. مرة واحدة وكانت المواد الخلوية كافية EXPANدائرة التنمية الاقتصادية، الشخصيات التسمية مع الأجسام المضادة للNESTIN وSOX2. كما ينبغي التفريق بين خطوط المصادق عليها مجلس الشعب في الخلايا العصبية لمدة 4-6 أسابيع، وصفت مع الأجسام المضادة للIII-تويولين وMAP2AB.
    1. إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني في 4C لمدة 10 دقيقة. Permeabilize الشخصيات في RT لمدة 15 دقيقة في 1.0٪ تريتون في برنامج تلفزيوني، ومن ثم منع في 5٪ المصل حمار مع 0.1٪ تريتون في RT لمدة 30 دقيقة.
    2. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في 5٪ المصل حمار مع 0.1٪ تريتون، بين عشية وضحاها في 4C.
      ملاحظة: نوصي الأجسام المضادة التالية: الماعز المضادة للSox2، 1: 200. Nestin الماوس مكافحة الإنسان، 1: 200. أرنب مكافحة βIII تويولين، 1: 500. الماوس مكافحة βIII تويولين، 1: 500. الماوس المضادة للMAP2AB، 1: 200. (الشكل 2).
    3. بعد غسل مع PBS، واحتضان خلايا الأجسام المضادة الثانوية مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق المناسبة لالماعز، والماوس أو أرنب في 1: 300، في في 5٪ مصل حمار مع 0.1٪ تريتون لمدة 1-2 ساعة على RT. لتصور النوى، وخلايا وصمة عار مع 0.5 ميكروغرام / مل دابي (4 '6-diamidino-2-phenylindole) ثم جبل مع Vectashield.

4. مجلس الشعب تنبيغ

  1. استخدام spinfection (الطرد المركزي لوحات زراعة الخلايا في وجود الفيروس في 1،000 x ج لمدة 1 ساعة) لزيادة نسبة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل 21. وسائل الإعلام نضح واستبدال overexpression ذات الصلة (أو السيطرة) lentiviruses (أو الفيروسات القهقرية)، titered لتعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) (عادة 1-10)، مخففة في وسائل الإعلام مجلس الشعب. استخدام 1.5 مل حجم لكل بئر من لوحة 6 جيدا (أو حجم تحجيمها بشكل مناسب لأنواع أخرى من لوحات زراعة الأنسجة). تدور في 1،000 x ج و 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في لوحة أجهزة الطرد المركزي.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، تنبيغ الشخصيات مع lentiviral أو ناقلات فيروسات في غضون 1-2 أيام من تقسيم. سواء باستخدام الفيروسات التجارية أو إعداد المختبر، ويمكن ان يكون من المفيد عيار بشكل مناسب دفعات من الفيروس في وقت مبكر عن طريق التخفيف المتسلسل. (الشكل 3).
  2. للحد من سلالموت lular، استبدال وسائل الإعلام في غضون 8 ساعة من spinfection.
    ملاحظة: التكامل الفيروسية والتحوير التعبير يجب أن تكون قابلة للكشف خلال 24 ساعة من قبل مضان مراسل الجين. (إذا كان الفيروس يفتقر مراسل الفلورسنت، وهذا هو أكثر صعوبة لتقييم، ويمكن أفضل ترنسفكأيشن ناجحة يتم التصديق عليها من قبل طخة مناعية، المناعية أو QPCR للمنتجات overexpression.) التعبير كامل قد يستغرق 3-7 أيام؛ قد تكون هناك حاجة spinfections المتكررة بفيروس إضافي لزيادة نسبة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. يمكن أن يحدث spinfections المتكررة يوميا ولكن لا يلزم أن يكون تكرارا لذلك. من الناحية المثالية، إذا كان استخدام مراسل الفلورسنت،> يجب أن يكون المسمى 80٪ من الخلايا.

5. Neurosphere الهجرة الفحص

ملاحظة: Neurospheres شكل عفوي، في أعقاب تفكك الأنزيمية من الشخصيات (بواسطة بطريقة مماثلة لتلك المستخدمة في التوسع مجلس الشعب - خطوات 3،3-3،6)، إذا الخلايا المستزرعة في تعليق في وسائل الإعلام مجلس الشعب.

  1. لفترة وجيزة، وتنمو فصلد الشخصيات في وسائل الإعلام مجلس الشعب لمدة 48 ساعة في لوحات غير ملتصق من أجل توليد neurospheres. (الشكل 4).
  2. للهجرة neurosphere، وإعداد لوحات Matrigel جديدة باستخدام وسائل الإعلام NPC الباردة، بدلا من DMEM، في لوحة 96-جيدا، 1-2 ساعة قبل neurosphere قطف. لا نضح Matrigel من الآبار.
  3. كما نشرت أصلا لالجذعية الجنينية المستمدة من الخلايا neurospheres 22، واختيار يدويا neurospheres مجلس الشعب المستمدة من تحت المجهر، بعد غسل مرة واحدة في وسائل الإعلام للمجلس الوطنى لإزالة الحطام الخلوي. نقل neurosphere واحدة على كل جانب من Matrigel المغلفة لوحة 96-جيدا.
  4. إضافة 0.5 ملغ إضافي Matrigel، مخففة في وسائل الإعلام NPC البرد، إلى neurospheres في كل لوحة 96-جيدا.
  5. تركز يدويا في كل neurosphere الفردي في منتصف البئر باستخدام طرف الماصة.
    ملاحظة: من المهم أن يلتقط neurospheres مشابهة من حيث الحجم، من أجل الحد من التباين في النتائج.
  6. السماح الهجرة تحدث لمدة 48 ساعة ومن ثم إصلاح خلايا ثإيث 4٪ امتصاص العرق وصمة عار مع علامات المناعى المرجوة.
  7. إذا الهجرة الشعاعية هي أن تحدد، neurospheres صورة في حياتهم تماما باستخدام الهدف 4X المجهر. استبعاد أي neurospheres الاتصال حافة البئر أو neurosphere الثاني من التحليل.
    ملاحظة: في حالة حدوث الهجرة لمدة أطول من 48 ساعة، سوف ينتج عنها من الهجرة شعاعي من المرجح أن تكون كبيرة جدا لصورة باستخدام الهدف 4x و.
  8. قياس متوسط ​​الهجرة من كل neurosphere باستخدام NIH يماغيج البرمجيات (الشكل 5). ويمكن القيام بذلك باستخدام أي من أساليب التحليل هو موضح أدناه:
    1. الهجرة شعاعي:
      1. تتبع حافة الخلايا أبعد المهاجرة باستخدام أداة التحديد مرفوعة ثم استخدام مقياس (السيطرة + M) وظيفة لحساب مساحة الشكل الناتج يدويا. قبل قياس مساحة تأكد من أن المساحة محددا في مجموعة القياسات نافذة وجدت تحت علامة التبويب تحليل. استخدامقيمة قياس المنطقة والمعادلة لمساحة الدائرة (A = πr 2) لتحديد دائرة نصف قطرها (الخارجي).
      2. تتبع حافة neurosphere الأصلي، وقياس وحساب مساحة دائرة نصف قطرها (الداخلي) بنفس الطريقة. حساب مجموع الهجرة شعاعي بالفرق بين أنصاف أقطار الخارجي والداخلي.
    2. أعظم الهجرة الخلوية:
      1. قياس المسافة انتقلت من أبعد خلايا خمسة من حافة neurosphere الداخلي باستخدام أداة التحديد القسط الثابت تليها قياس (السيطرة + M) وظيفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن تحديد ريدات العصبية شكليا، وذلك باستخدام المجهر brightfield، من خلال مظهرها المميز في شكل مجموعات جولة من خلايا عصبية ظهارية مع apico القاعدية قطبية (الشكل 1). على الرغم من الشخصيات تستزرع عادة في كثافة الخلايا عالية جدا، وذلك مباشرة بعد الركض، قليلا سوما هرمي الشكل والهيكل Neurite النوعي القطبين مرئيا (الشكل 1D). الشخصيات التحقق من صحة تعبر عن NESTIN وSOX2 في معظم الخلايا، على الرغم III-تويولين تلطيخ هو أيضا واضحة في جميع السكان مجلس الشعب،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفناها الطرق التي يمكن من خلالها تمييز hiPSCs في اللجان التحضيرية الوطنية، وهو نوع من الخلايا العصبية التي يتم حفظها جزءا كبيرا من التوقيع الجيني للخلايا العصبية hiPSC المشتقة والتي قد تكون بمثابة وكيل لمسارات التنمية المحتمل أن تساهم في التسبب بأمراض 8، 11. بالإضافة إلى ذلك، كما قمنا بالتفصيل، الشخصيات هي السكان العصبي تنسخي بقوة وtransduced بسهولة، والتي نعتقد أنها قد تكون مناسبة للدراسات الجزيئية والكيمياء الحيوية من الاستعداد المرض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كريستين بريناند هي مؤسسة الخلايا الجذعية في نيويورك - محقق روبرتسون. يتم دعم مختبر بريناند من خلال منحة الباحث الشاب للدماغ والسلوك ، ومنحة المعهد الوطني للصحة (NIH) R01 MH101454 ومؤسسة نيويورك للخلايا الجذعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM / F12Life Technologies# 11330for HES media
DMEM / F12Life Technologies# 10565للوسائط العصبية
KO-Serum ReplacementLifeTechnologies # 10828يحتاج إلى اختبار
GlutamaxLifeTechnologies # 35050
NEAALife Technologies # 11140
N2Life Technologies #17502-048يحتاج إلى اختبار كبير
B27-RALife Technologies #12587-010يحتاج إلى اختبار كبير
FGF2Life Technologies# 13256-029Resuspend in PBS + 1٪ BSA
LDN193189Stemgent# 04-0074
SB431542Stemgent# 04-0010
BDNFPeprotech# 450-02Resuspend في PBS + 0.1٪ BSA
GDNF   ؛Peprotech  # 450-10إعادة التعليق في PBS + 0.1٪ BSA
ثنائي بوتيريل دوري-AMPسيجما #D0627إعادة التعليق في PBS + 0.1٪ BSA
حمض الأسكوربيكL-Ascorbic سيجما#A0278إعادة التعليق في H2< / sub>0
الخلايا الجذعيةلاختيار الوردة العصبيةSTEMdiff   # 05832
AccutaseInnovative تقنيات الخليةAT-104
كولاجيناز IVLife Technologies# 17104019
CF1 mEFsMillipore#PMEF-CF
Poly-L-OrnithineSigmaP3655
Laminin ، ماوس طبيعي 1 مجمLife Technologies# 23017-015
BD MatrigelBD# 354230أعد تعليقه على الثلج في DMEM البارد بمعدل 10 مجم / مل ، استخدم 1 مجم لكل مكافئتين من 6 ألواح بئر
مكافئة لثقافة الأنسجة المعالجة 6 آبارCorning3506
ألواح 6 آبارCorning3471
ماعز مضاد ل Sox2   ؛سانتا كروزsc & خجول; 17320استخدام في 1: 200
الفأر المضاد للإنسان NestinMilliporeMAB5326استخدامه في 1: 200
أرنب مضاد وبيتا ؛ III-tubulinكوفانسPRB & خجول ؛ استخدام 435Pفي 1: 500
ماوس مضاد وبيتا ؛ III-tubulinكوفانسMMS & خجول ؛ استخدام 435Pعند 1: 500
استخدام الماوس المضاد ل MAP2ABSigmaM1406عند 1:200
لوحة الطرد المركزيBeckman CoulterBeckman Coulter Allegra X-14 (مع حامل لوحة SX4750)
تقنيات منخفضة للغاية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630(2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

hiPSC Derived NPCsNeural Progenitor CellsDual SMAD InhibitionNeural RosettesLentiviral TransductionNeurosphere FormationCell Migration AssayOxidative Stress AnalysisApoptosis MeasurementNestin SOX2 Expression

مقالات ذات صلة