مقالة منهجية

ترنسفكأيشن، اختيار، ومستعمرة قطف من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية TALEN المستهدفة مع جين GFP في AAVS1 الملاذ الآمن

DOI:

10.3791/52504

⸱

فبراير 1, 2015

 ,  ,  , 
1National Institute of Arthritis, Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 2Q Therapeutics

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يتيح تحرير الجينات بوساطة < p class = 'jove_content'> TALEN في موضع الملاذ الآمن AAVS1 إضافة الجينات المعدلة وراثيا عالية الكفاءة في iPSCs البشرية. يصف هذا البروتوكول إجراءات إعداد iPSCs ل TALEN وتسليم ناقلات المتبرع, نقل iPSCs, واختيار وعزل استنساخ iPSC لتحقيق التكامل المستهدف لجين GFP لتوليد خطوط المراسل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن توفر إضافة الجينات المعدلة وراثيا مستهدفة تعبيرا جينيا مستمرا أثناء التحايل على إسكات الجينات والطفرات الإدخالية الناجمة عن التكامل العشوائي بوساطة النواقل الفيروسية. يصف هذا البروتوكول منصة إضافة مستهدفة عالمية وفعالة للجينات المعدلة وراثيا في iPSCs البشرية بناء على استخدام TALENs مفتوحة المصدر التي تم التحقق من صحتها ومتبرع يشبه مصيدة الجينات لإيصال الجينات المعدلة وراثيا إلى موضع ملاذ آمن. الأهم من ذلك ، أن التحرير الجيني الفعال محدود المعدل من خلال كفاءة توصيل نواقل تحرير الجينات. لذلك, يركز هذا البروتوكول أولا على إعداد iPSCs للتعداء لتحقيق كفاءة عالية في التوصيل النووي. عندما يتم تفكيك iPSCs إلى خلايا مفردة باستخدام كاشف تفكك الخلية اللطيفة ونقلها باستخدام برنامج محسن, >50٪ يمكن حث الخلايا على أخذ ناقلات تحرير الجينات الكبيرة. نظرا لأن موضع AAVS1 يقع في إنترون الجين النشط (PPP1R12C), متقبل التضفير (SA)- الجين المقاوم للبورومايسين المرتبط (PAC) تم استخدامه لتحديد iPSCs المستهدفة مع استبعاد الخلايا العشوائية للتكامل فقط وغير المنقولة. تزيد هذه الإستراتيجية بشكل كبير من فرصة الحصول على المستنسخة المستهدفة ، ويمكن استخدامها في تجارب استهداف الجينات النشطة الأخرى أيضا. بعد أسبوعين من اختيار بورومايسين بالجرعة المعدلة لخط iPSC محدد, المستنسخة جاهزة ليتم انتقاؤها عن طريق التشريح اليدوي للكبيرة, مستعمرات معزولة إلى قطع أصغر يتم نقلها إلى وسط جديد في بئر أصغر لمزيد من التوسع والفحص الجيني والوظيفي. يمكن للمرء أن يتبع هذا البروتوكول للحصول بسهولة على خطوط iPSC متعددة مراسل GFP مفيدة للتصوير في الجسم الحي وفي المختبر وعزل الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اكتشفت القدرة على إعادة برمجة الخلايا الجسدية الإنسان في الجذعية الجنينية التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة تشبه الخلايا (iPSCs) أول من تاكاهاشي آخرون في عام 2007 1. الليفية الجلدية الإنسان transduced مع الفيروسات القهقرية معربا عن أربعة عوامل النسخ (وياماناكا ذلك يطلق عليها اسم العوامل Oct3 / 4، Sox2، عرضت ج. Myc على، وKlf4) لتكون مشابهة إلى حد كبير للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على أساس التشكل، والانتشار، والتعبير الجيني، وحالة جينية. بشكل حاسم، iPSCs هي أيضا قادرة على التفريق في الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث 1. القدرة التكاثري المحتملة والتفريق بين iPSCs يجعلها أدوات جذابة للغاية. عن طريق إعادة برمجة الخلايا من المرضى الذين يعانون من أمراض معينة، يمكن استخدام iPSCs على حد سواء كما نظم في المختبر نموذج المرض والعلاجات كما المحتملة.

لغرض الأخير، يجب أن تعالج العديد من القضايا قبل الإمكانات الكاملة للiPSCsفي عملية إعداد سريرية يمكن أن تتحقق. إمكانيات مكون للأورام في المختبر hESCs مثقف وiPSCs، واستخدام المشتقات xenogenic خلال إعادة برمجة وصيانة الخلايا، والحاجة لتتبع الخلايا المزروعة في الجسم الحي كلها عقبات حاسمة إلى التطبيق السريري من الخلايا الجذعية المحفزة (التعليق بواسطة Hentze آخرون في. 2). سيكون حلا مثاليا للحاجة لتتبع خلايا متمايزة في مرحلة ما بعد زرع ينطوي على علامة للكشف بصريا أن يقاوم إسكات وتلون بغض النظر عن التطبيق. التعبير القوي والمستدام من الجينات المحورة المتكاملة هو الأكثر بسهولة يمكن تحقيقه عندما يتم إدخال الحمض النووي الخارجية إلى ميناء آمن مواضع. وهذا هو، مواقع الجينومية التي تمكن النسخ كاف من متجه متكامل، وفي الوقت نفسه تخفيف الاضطرابات التعبير في الجينات المجاورة 3. واحد موقع من هذه المواقع التي تميزت بشكل جيد جدا منذ اكتشافه هو integr فيروس الغدة المرتبطةالموقع أوجه 1 (AAVS1)، في إنترون الأول من بروتين الفوسفاتيز 1 التنظيمي فرعية 12C (PPP1R12C) الجين. وقد تبين هذا الموضع ليس فقط أن يسمح لحقت والتعبير القوي من الجينات المحورة المتكاملة من خلال تمديد الوقت في الثقافة والتمايز في المختبر 3، ولكن أيضا لحماية المحيطة الجينات من اضطراب النسخي 4؛ ويعتقد أن كل من الميزات أن ذلك يعود إلى وجود عناصر داخلية عازل لونين المرافقة الموقع AAVS1 5.

التقدم في الأدوات الهندسية الجينوم ما يزيد قليلا على مدى العقد الماضي قد سهلت كثيرا من السهولة والكفاءة التي يمكن تحقيقها التلاعب الجيني في أي نوع من الخلايا. بينما اعتمدت التجارب الناجحة الأولى على مستويات منخفضة جدا من إعادة التركيب مثلي الذاتية (HR) مع الجهات المانحة التي أدخلت على تحقيق استهداف الجينات في المجالس الاقتصادية والاجتماعية 6،7، واستخدام nucleases في مواقع محددة، مثل nucleases إصبع الزنك (ZFNs)، أن significantly لحث على إعادة التركيب مثلي من خلال توليد استراحة DNA المزدوج تقطعت بهم السبل وزيادة كبيرة في كفاءة مثل هذه التجارب 8،9. جعلت تطويعها لأغراض أخرى كل النسخ مثل المنشط المستجيبات (حكايات) من النباتات المسببة للأمراض زانثوموناس جنسا وبدائية النواة تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / نظام Cas9 إلى كفاءة مصمم nucleases في مواقع محددة استهداف الجينات في الخلايا الجذعية المحفزة على الوصول إليها و منهجية العملية 10-13.

ووصفت ورقة الأخيرة وسيلة فعالة لتحقيق التكامل مستقر من الأخضر الفلورسنت مراسل الكاسيت في AAVS1 آمن الميناء مكان في iPSCs الإنسان باستخدام nucleases حكاية (TALENs) 14. حافظت هذه iPSCs استهدفت مضان حتى بعد التمايز الموجهة إلى العضلية وزرع في نموذج الفأر من احتشاء عضلة القلب (MI)، وتوفير أدلة قوية لفائدة مثلثابت المحفزة الفلورسنت الخلايا الجذعية 14. للحصول على المستعمرات المستهدفة، تم استخدام طريقة الجينات فخ فيه على الربط-متقبل (SA)، 2A-الشق الذاتي تسلسل الببتيد يضع بوروميسين N-أسيتيل ترانسفيراز (PAC) الجينات تحت سيطرة PPP1R12C المروج الذاتية. وبالتالي، iPSCs فقط التي أدرجت المتبرع DNA في موضع AAVS1 تعبر عن PAC، مما يجعلها اختيار على أساس بوروميسين المقاومة. (الشكل 1، 15). تفاصيل هذا البروتوكول إجراءات لتوليد AAVS1-GFP iPSCs ذكرت في الورقة الأخيرة 14، بما في ذلك عملية transfecting iPSCs مع TALENs والجهات المانحة 9.8 كيلوبايت لدمج جزء DNA 4.2kb في موضع AAVS1 آمن الميناء، واختيار iPSCs على أساس بوروميسين المقاومة، واختيار المستعمرات للتوسع نسيلي. التقنيات الموضحة في هذه الوثيقة يمكن تطبيقها على العديد من التجارب الهندسة الجينوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد مصفوفة الغشاء القاعدي وطلاء بلستيكور

  1. وضع الغشاء القاعدي الأسهم مصفوفة المجمدة من -20 ° C على الجليد وذوبان الجليد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  2. بعد ذوبان الجليد، مأخوذة ماصة 2 ملغ من الطابق السفلي مصفوفة الغشاء في أنابيب إيبندورف قبل المبردة. تخزين هذه في -20 ° C لحين الحاجة إليها.
  3. لإعداد الغشاء القاعدي لوحات المغلفة المصفوفة، ذوبان الجليد قسامة واحد على الجليد حتى آخر قطعة من الجليد في يختفي أنبوب إيبندورف (عادة في غضون ~ 2 ساعة).
  4. بعد ذوبان الجليد، إضافة مصفوفة الغشاء القاعدي إلى 12 مل من البرد (4 ° C) DMEM / F12 لجعل الغشاء القاعدي حل مصفوفة الطلاء.
  5. إضافة الغشاء القاعدي حل مصفوفة لسفينة الثقافة المناسبة. لوحة 6 جيدا، الاستغناء 1 مل لكل بئر. دوامة لوحة للتأكد من حل مصفوفة الغشاء القاعدي يغطي تماما كل بئر.
  6. بارافيلم ختم الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة لوحة / طبق، واحتضان عند رودرجة حرارة م لمدة 1 ساعة قبل الاستخدام. بدلا من ذلك، متجر الغشاء القاعدي لوحات المغلفة مصفوفة / أطباق في 4 درجات مئوية، وتستخدم في حدود 2 أسابيع من الطلاء.
    ملاحظة: إضافة DMEM إضافية / F12 إلى الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة لوحة / طبق لمنع جفاف. قبل استخدام 4 ° C الغشاء القاعدي المخزنة المغلفة مصفوفة لوحة / طبق، وضعه في خزانة السلامة البيولوجية والسماح لها أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  7. نضح مصفوفة الغشاء القاعدي تماما قبل إضافة المتوسطة والخلايا.

2. إعداد E8 المتوسطة

  1. إعداد E8 مستنبت من قبل ذوبان E8 تكملة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  2. إزالة 10 مل من E8 المتوسطة القاعدية من الأسهم 500 مل وتجاهل.
  3. ماصة كامل 10 مل قارورة من E8 تكملة مباشرة في 490 مل من E8 المتوسطة القاعدية. لا الدافئ الكامل المتوسطة E8 في حمام مائي 37 ° C، والتقلبات في درجات الحرارة المتكررة يمكن أن تتحلل في bFGF في مجمعاتالشركة المصرية للاتصالات E8 المتوسطة.
  4. استخدام كامل المتوسطة E8 حدود 2 أسابيع من إضافة الملحق.

3. ذوبان iPSCs

  1. إزالة قارورة من iPSCs المجمدة من النيتروجين السائل ومكان على الثلج الجاف.
  2. ذوبان الجليد بسرعة القارورة في حمام مائي 37 ° C. دوامة القارورة في حمام مائي حتى سوى جزء صغير من بقايا الجليد.
  3. رش القارورة مع الايثانول 70٪ ونقل إلى خزانة السلامة البيولوجية.
  4. إضافة 1 مل من درجة حرارة الغرفة E8 قطرة قطرة المتوسط ​​مباشرة إلى القارورة.
  5. باستخدام ماصة 2 مل، ونقل قطرة قطرة تعليق خلية في 9 مل من E8 المتوسطة في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. دوامة أنبوب في كثير من الأحيان للتأكد من أن الخلايا والمتوسطة تخلط جيدا بسرعة.
  6. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. نضح طاف، و resuspend بيليه الخلية في حجم مناسب من E8 تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632.
  8. إضافة الخلايا لعدد مناسب من الطابق السفلي MEMBRANه-مصفوفة المغلفة الآبار، ومكان في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها. فمن المستحسن أن لوحة 0.2 على الأقل × 10 6 IPSC لكل بئر من لوحة 6 جيدا لتمكين الانتعاش السريع بعد الذوبان.

4. صيانة والركض الروتيني لiPSCs

  1. تحديث E8 المتوسط ​​يوميا.
  2. مراقبة التشكل وconfluency من الخلايا مع مجهر مقلوب. iPSCs ذات جودة عالية تنمو في مستعمرات مسطحة ذات حدود واضحة. المستعمرات الفردية تمتلك مظهر "مثل حصاة كبيرة".
  3. مرور الخلايا iPSCs عندما تصل ~ 70٪ confluency.
  4. تحضير محلول EDTA الركض من خلال إضافة 0.9 غرام كلوريد الصوديوم و 500 ميكرولتر 0.5 M EDTA إلى 500 مل DPBS. تخلط جيدا لإذابة كلوريد الصوديوم، وفلتر فراغ لتعقيم. تدفئة قسامة من الحل الركض في 37 ° C حمام الماء قبل الركض.
  5. إلى مرور، نضح قضى مستنبت وغسل خلايا مرة واحدة مع حجم مساو من با الحارةsaging الحل. نضح، وماصة ما يكفي من EDTA حل الركض إلى معطف الخلايا (1 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا).
  6. وضع الخلايا تحت مجهر مقلوب ومراقبة المستعمرات IPSC. وينبغي أن تصبح ظهور ثقوب داخل المستعمرات والحدود أثار على ما يبدو في حدود 2 إلى 5 دقائق.
  7. نضح بعناية الحل EDTA الركض.
  8. باستخدام ماصة 10 مل، الاستغناء 4 مل من E8 المتوسطة (في حالة استخدام لوحة 6 جيدا) تحت ضغط عال بشكل مباشر في كل بئر إلى أن passaged.
  9. جمع كتل IPSC، وتنقسم إلى عدد مناسب من الآبار اعتمادا على نسبة الانقسام من 1: 8 إلى 1:12. لا الإفراط في ماصة، وتجزئة كتل الخلايا سوف يؤدي ذلك إلى ضعف قدرتها على البقاء.
  10. وضع لوحة في حاضنة، والصخور لوحة ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب عدة مرات لتفريق الخلايا.

5. إعداد MEFS وiPSCs لTansfection

  1. 48 ساعة قبل transfectioن، iPSCs مرور في ~ 1: 6 إلى أربعة أو المزيد من الآبار من الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة لوحة 6 جيدا، بحيث سيكون 70٪ متموجة يومين من الآن.
  2. في اليوم التالي، ذوبان الجليد DR4 MEFS في المتوسط ​​MEF تتألف من DMEM (الجلوكوز عالية) تستكمل مع 10٪ FBS و1X MEM-NEAA.
  3. لوحة DR4 MEFS إلى طبقين 10 سم في ~ 2 × 10 4 خلية / سم 2 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  4. في يوم ترنسفكأيشن، تغيير المتوسطة MEF إلى E8 تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 30 دقيقة قبل تنفيذ ترنسفكأيشن على iPSCs.
  5. اختياري: إذا كان المطلوب تحليل تدفق cytometric من iPSCs بعد ترنسفكأيشن، وإزالة لوحة المغلفة مصفوفة الغشاء القاعدي من 4 ° C ومكان في درجة حرارة الغرفة.
  6. اختياري: 4 ساعة قبل ترنسفكأيشن، تكملة ما قبل ترنسفكأيشن الثقافة IPSC مع Y-27632 في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر.

6. لطيف خلية التفكك الكاشف علاج لالثانية ترنسفكأيشن من iPSCs باستخدام نظام Electroporation لل

  1. إزالة P3 الحل ترنسفكأيشن الخلية الأولية من 4 ° C والسماح لها أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ~. إضافة ملحق كامل 100 ميكرولتر إلى حل ترنسفكأيشن قبل استخدامها.
  2. دافئ خلية لطيف-التفكك كاشف في 37 ° C حمام الماء.
  3. الحصول AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 وPZT-AAVS1-R1) وAAVS1-CAG-EGFP المانحة من -20 ° C.
  4. إزالة iPSCs من الحاضنة ويغسل مرة واحدة مع DPBS.
  5. إضافة 1 مل من خلية لطيف-التفكك كاشف لكل بئر، واحتضان iPSCs عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، أو حتى فصل أكثر من 50٪ من الخلايا من سفينة الثقافة.
  6. ماصة الخلايا صعودا وهبوطا عدة مرات باستخدام ماصة P1000 لفصل أي الخلايا المتبقية من سفينة الثقافة، وتفتيت كتل IPSC.
  7. إضافة 2 مل من E8 المتوسطة إلى كل بئر، وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات باستخدام ماصة 10 مل لفورثإيه تفصيل كتل الخلايا إلى خلايا واحدة
    ملاحظة: الكفاءة ترنسفكأيشن تنخفض بشكل كبير إذا كتل الخلايا يست مفصلة بما فيه الكفاية.
  8. جمع iPSCs في أنبوب مخروطي 15 مل، والطرد المركزي في 100 x ج لمدة 3 دقائق.
  9. نضح طاف، وخلايا resuspend في الحد الأدنى من E8 المتوسطة.
  10. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات بعد تطبيق وصمة عار الحيوية مثل 0.4٪ التريبان الأزرق. تأكد من أن الخلايا نأت بما فيه الكفاية في حين عد (1-3 خلايا في "أجمة").
  11. الاستغناء 3 × 10 6 خلايا في كل من اثنين من أنابيب مخروطية 15 مل، وتدور باستمرار مرة أخرى في 100 x ج لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: انخفاض سرعة الطرد المركزي يقلل من الإجهاد الخلية ويتيح سهولة اعادة تعليق من iPSCs قبل Electroporation لل.
  12. ضبط نظام Electroporation لللبرنامج الخلية من نوع محدد لالجنينية خط الخلايا الجذعية البشرية H9 (برنامج CB-150).
  13. بعد الطرد المركزي، ونضح طاف من سلالكريات لتر. لبيليه واحد، إضافة 10 ميكروغرام من المتبرع HR كما عينة السيطرة. لبيليه آخرين إضافة 10 ميكروغرام من المتبرع HR، جنبا إلى جنب مع 5 ميكروغرام لكل TALEN (PZT-AAVS1-L1 وPZT-AAVS1-R1) كما عينة التجريبية.
  14. و resuspend كل بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من محلول ترنسفكأيشن الخلية الأولية P3، ونقل إلى كوفيت.
  15. أداء ترنسفكأيشن وإضافة على الفور 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة E8 المتوسط ​​إلى كل كفيت.
  16. نقل iPSCs قطرة قطرة transfected لواحد 10 سم صحن يحتوي MEFS DR4 أعدت في الخطوة 5.4.
  17. اختياري: اضافة عدة قطرات من كل تجربة في بئر واحدة من الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة لوحة 6 جيدا إذا كان المطلوب التدفق الخلوي anaylsis الكفاءة ترنسفكأيشن.
  18. كرر الخطوات 6،15-6،17 لإنهاء كل من العينات. في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع DPBS مرتين والتبديل مستنبت لNutriStem، الذي يظهر لدعم الثقافة IPSC على مغذيات أفضل من E8.
  19. TRansient قمم EGFP التعبير في 48 إلى 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. تقييم كفاءة ترنسفكأيشن كما تريد.

7. بوروميسين اختيار iPSCs المستهدفة

  1. بدء اختيار بوروميسين 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن عندما تصل iPSCs 70٪ confluency.
  2. لNCRM5 iPSCs، تبدأ اختيار بوروميسين عند 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين (1/2 الجرعة الكاملة) المخفف في NutriStem مستنبت. قد تختلف تركيز بوروميسين الأمثل ،25-1 ميكروغرام / MLL لبعض الخطوط التوجيهية.
  3. iPSCs الثقافة في NutriStem + 0.5 ميكروغرام / مل بوروميسين لمدة 3 أيام، ومنعش المتوسط ​​يوميا.
  4. بعد 3 أيام، وزيادة تركيز بوروميسين إلى 1 ميكروغرام / مل.
  5. iPSCs ثقافة أقل من 1 ميكروغرام / مل اختيار بوروميسين لمدة 7 إلى 8 أيام أخرى، أو حتى تظهر المستعمرات متميزة كبيرة بما يكفي لمستعمرة قطف.

8. مستعمرة الإلتقاط والتوسع من iPSCs المستهدفة

  1. استخدام الغشاء القاعديمصفوفة لمعطف لوحة 96-جيدا من قبل الاستغناء 50 ميكرولتر من الغشاء القاعدي حل مصفوفة طلاء (2 ملغ مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف إلى 12 مل DMEM / F12) في كل بئر. تخزين لوحة عند 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الاستخدام.
  2. بعد السماح لوحة المغلفة مصفوفة الغشاء القاعدي أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة، ونضح الطابق السفلي مصفوفة الغشاء والاستغناء 100 ميكرولتر E8 تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 في كل بئر.
  3. وضع مجهر مقلوب في خزانة السلامة البيولوجية، ورذاذ بخفة مع 70٪ ETOH لتعقيم.
  4. سحب ماصة باستير الزجاج على موقد بنسن للحصول على أداة مستعمرة قطف المثالية التي لديها "هوك" صغيرة على الحافة. تعقيم مع ETOH 70٪، وتضع في غطاء محرك السيارة لتجف.
  5. إزالة صحن يحتوي على المستعمرات IPSC المستهدفة من الحاضنة، ومكان في غطاء محرك السيارة تحت المجهر.
  6. اختيار iPSCs عن طريق تتبع دائرة حول الحدود مستعمرة مع أداة قطف مستعمرة.
  7. استخدام "هوك" من أداة مستعمرة قطف لكشط بلطف وإزالة مستعمرة IPSC من سطح اللوحة. للمستعمرات أكبر مما أثار X مع أداة قطف مستعمرة إلى الربع فإن مستعمرة تسهل نمو الخلايا بعد إعادة الطلاء.
  8. مرة واحدة يتم فصل كتل الخلايا وعائمة بحرية، واستخدام تشكيلة ماصة P200 ل~ 30 ميكرولتر لجمع iPSCs. لوحة الخلايا مباشرة في لوحة 96-جيدا.
  9. اختياري: استخدام ماصة P20 المقرر أن ~ 5 ميكرولتر لجمع iPSCs في أنبوب إيبندورف، ثم إضافة 50 ميكرولتر خلية لطيف-التفكك كاشف لهضم لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الهضم، وإضافة 500 ميكرولتر E8 المتوسطة في أنبوب إيبندورف لتمييع الخلية لطيف-التفكك كاشف وتدور أسفل الخلايا في 200 x ج في القياسية فوق المنضدة ميكروسنتريفوج لمدة 5 دقائق. ثم نضح معظم المتوسطة وترك ~ 30 ميكرولتر ل resuspend ونقل الخلايا إلى لوحة 96-جيدا.
    ملاحظة: هذاسوف نهج تسهيل تفكك أجمة الخلية والتوسع السريع للمستعمرة التقطت.
  10. مواصلة مستعمرة قطف حتى تم جمع عدد كاف من المستعمرات IPSC (حوالي 20-30 المستعمرات في التجربة هو مستحسن).
  11. بعد قطف مستعمرة، وضع لوحة 96-جيدا في حاضنة بين عشية وضحاها. تحديث مع كامل المتوسطة E8 في اليوم التالي، والثقافة حتى ~ 70٪ متموجة.
  12. خلايا مرور من جيدا 96 إلى 24 جيدا، ثم إلى 6 جيدا، كما هو موضح في الخطوات 4،5-4،10.
    ملاحظة: كميات EDTA الحل وE8 المتوسطة ينبغي خفض بشكل متناسب عند استخدام الآبار أصغر من لوحة 6 جيدا.
  13. تقييم استهداف النجاح من خلال تقاطع PCR وتحليل لطخة الجنوبي لتأكيد التكامل كاسيت المستهدفة وغياب ناقلات إدراجها بشكل عشوائي 16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد التصور للبروتوكول في الشكل 2، مع الفترات التي iPSCs هي المستزرعة في مختلف المتوسطة التي أبرزها إما أخضر أو أزرق لE8 لNutriStem. من المهم أن بالنقل فقط iPSCs ذات جودة عالية؛ دراسة أطباق الثقافة في جميع أنحاء الصيانة الروتينية والتحقق من أن الثقافات IPSC تحتوي على المستعمرات متميزة أساسا تحمل التشكل مثل الحصوه (الشكل 3A)؛ خلايا متباينة لا ينبغي أن تشغل أكثر من 10٪ من الثقافة. ويتم تقييم Transfectability من iPSCs والأمثل باستخدام ناقلات صغيرة pM...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الأكثر أهمية للجيل ناجح من AAVS1 آمن الميناء استهدفت iPSCs الإنسان هي: (1) يعطي كفاءة TALEN والجهات المانحة البلازميدات إلى iPSCs من قبل ترنسفكأيشن. (2) تحسين تفكك iPSCs إلى خلايا واحدة قبل ترنسفكأيشن والطلاء كثافة بعد ترنسفكأيشن. (3) تحسين الجرعة ووقت المخدرات الاختيار على أساس نمو خط IPSC. (4) تشريح بعناية واختيار المستعمرات المستهدفة ونقل لوحة جديدة / جيد. بالمقارنة مع الطرق المماثلة المستخدمة في ورقة Hockemeyer في 10، وتستخدم هذا البروتوكول زوج من المصدر الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل الصندوق المشترك للمعاهد الوطنية للصحة وبرنامج البحوث الداخلية التابع للمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض الجهاز العضلي الهيكلي والجلد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مصفوفة غشاء قاعدي لعامل النمو المخفض (GFR) من ماتريجل ، * خالية من LDEV ، 10 ملCorning354230يخزن عند -20 درجة مئوية.
متجر DMEM / F-12Life Technologies11320-033عند 4 درجات مئوية.
Costar 6 Well Clear Multiple Well Well Processor TCCorning3506
Essential 8Medium Life TechnologiesA1517001تخزين الوسط القاعدي عند 4 درجات مئوية. تخزين المكملات الغذائية عند -20 درجة مئوية.
Y-27632 ثنائي هيدروكلوريدتوكرس1254يحفظ في درجة حرارة الغرفة. بمجرد إذابتها في H2< / sub>O ، قم بتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
كلوريد الصوديومSigmaS5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0Life Technologies15575-020
DPBS ، بدون كالسيوم ، خال من المغنيسيومLife Technologies14190-250
100 مم طبق الثقافة المعالج TCCorning430167
DR4 MEF 2M IRR - AcademicGlobalStemGSC-6204Gيخزن في النيتروجين السائل.
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، بيروفاتلايف تكنولوجيز11995-040يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
مصل الأبقار الجنيني المحدد ، من أصلأمريكي HyCloneSH30070.03يخزن عند -20 درجة مئوية ؛ ذوبان الجليد عند 4 درجات ؛ ج بين عشية وضحاها ونقل الصوت. تخزين الكميات عند -20 درجة ؛ ج لحين الحاجة.
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100X)Life Technologies11140-050يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
4D-Nucleofector الوحدة الأساسية LonzaAAF-1001Bجزء من نظام التثقيب الكهربائي
4D-Nucleofector X وحدة   ;LonzaAAF-1001Xجزء من نظام التثقيب الكهربائي
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)LonzaV4XP-3024عند الوصول ، قم بإزالة محلول الخلية الأولية واستكمله وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
تقنيات كاشف حياة تفكك الخلايا StemPro AccutaseA1110501في -20 درجة مئوية ، قم بإذابة الثلج بين عشية وضحاها عند 4 درجات ؛ C وتسخين aliquot في 37 & deg; ج حمام مائي قبل الاستخدام.
NutriStem XF / FF Culture MediumStemgent01-0005يخزن في -20 درجة مئوية ، قم بإذابة الثلج بين عشية وضحاها عند 4 درجات ؛ C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 و pZT-AAVS1-R1)Addgene52637 و 52638
AAVS1-CAG-EGFP المتبرع بإعادة التركيب المتماثلAddgene22212
Puromycin DihydrochlorideLife TechnologiesA11138-03يخزن في -20 درجة مئوية. قم بإعداد كميات العمل من 1 مجم / مل في ddH 2< / sub>O.
زجاج البورسليكات القابل للتصرف باستور بيبيتسفيشر سيانتيفيك13-678-20A
سورفال ليجند XTR (مبرد) ، 120 فولت 60 هرتزحراري علمي75-004-521
TX-750 4 & مرات 750 مل دلو متأرجح الدوارالحراري العلمي75003607
محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪تقنيات الحياة15250-061
يتم تخزين < td colspan = "4" > [header]

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
  3. Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
  4. Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
  5. Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
  6. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  7. Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
  8. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
  9. Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
  10. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
  11. Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
  12. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  13. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  14. Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
  15. Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
  16. Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
  17. Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: http://www.stembook.org/node/1438 (2008-2013).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TALEN GFP E8

مقالات ذات صلة