مقالة منهجية

عزل الحمض النووي الريبي من خلية مجموعات سكانية فرعية محددة عن طريق الليزر والتقاط تسليخ مجهري جنبا إلى جنب مع رابيد Immunolabeling

DOI:

10.3791/52510

⸱

أبريل 11, 2015

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Neurosciences, Faculty of Medicine, Université Laval, 2Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجينات تحليل التعبير عن مجموعة فرعية من الخلايا في الأنسجة محددة يمثل تحديا كبيرا. توضح هذه المقالة كيفية عزل الحمض النووي الريبي مجموع عالية الجودة من السكان خلية معينة من خلال الجمع بين طريقة immunolabeling السريع مع ملقط ليزر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملقط ليزر (LCM) يسمح للعزل خلايا معينة من أقسام الأنسجة رقيقة لقرار مكانية عالية. يتطلب LCM فعال التحديد الدقيق للخلايا القطعان من الأنسجة غير المتجانسة. عادة ما يستند تحديد الخلايا التي تهم LCM على معايير شكلية أو على صحفيين بروتين فلوري. الجمع بين LCM وimmunolabeling السريع يوفر وسيلة بديلة وفعالة لتصور أنواع معينة من الخلايا وعزلهم عن الأنسجة المحيطة. ويمكن بعد ذلك عالية الجودة RNA كنت استخرجت من السكان الخلية نقية ومواصلة تجهيزها لتطبيقات المصب، بما في ذلك RNA-التسلسل، ميكروأري أو QRT-PCR. وقد تم إجراء هذا النهج سابقا ووصف لفترة وجيزة في عدد قليل من المنشورات. والهدف من هذه المقالة هو لتوضيح كيفية تنفيذ immunolabeling السريع لسكان الخلية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، وكيفية عزل هذه الخلايا محددة باستخدام LCM. هنا، نحن لتوضيحد هذا الإجراء متعددة خطوة immunolabeling والتقاط الخلايا الدوبامين في أنسجة المخ من الفئران عمرها يوم واحد. نسلط الضوء على الخطوات الحاسمة الرئيسية التي تستحق اهتماما خاصا. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من الأنسجة والخلايا في المصالح. وسوف يقوم الباحثون من مختلف المجالات من المرجح أن تستفيد من المظاهرة لهذا النهج.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون الدماغ من مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا العصبية المختلفة وتشكيل شبكات معقدة. ويتم تنظيم هذه الخلايا العصبية في مجموعات متميزة والمجموعات الفرعية وفقا لمورفولوجيا والاتصال والتعبير الجيني نمطها 1. عرضت تطوير ميكروأرس، الجيل التالي من التسلسل، وQRT-PCR إمكانية للمقارنة ملامح التعبير الجيني للسكان الخلايا العصبية في سياقات البيولوجية المختلفة 1،2. هذه التحليلات حساسة تتطلب التحديد الدقيق وعزل أنواع الخلايا في المصالح مع الحفاظ على سلامة RNA 2-4. تم الفلورسنت تنشيط الخلايا الفرز (FACS) التقنية المستخدمة على نطاق واسع لعزل أنواع معينة من الخلايا على أساس علامات سطح الخلية و / أو التشكل. يتطلب FACS خطوة التفكك الخلية قبل الفرز، مما يؤدي الى فقدان كامل للقرار المكاني 5. العديد من مجموعات سكانية فرعية العصبية تتميز عن بعضها البعض وفقا للتوزيع تشريحي في عشرالبريد الدماغ. ملقط ليزر تطبيقها على أقسام الدماغ رقيقة يوفر خيارا مناسبا لعزل معينة من الخلايا لقرار مكانية عالية 6-8. وكان أحد أوجه القصور الرئيسية لLCM الحاجة إلى تحديد خلايا الفائدة على أساس معايير شكلية أو على صحفيين بروتين فلوري المعدلة وراثيا في النماذج الحيوانية. تطوير تقنيات جديدة لأداء الطرق السريعة التي immunolabeling الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، بالاشتراك مع LCM، يسمح الآن عزلة المجموعات السكانية الفرعية خلية المضي قدما في تجارب التنميط الجيني.

وقد تم إجراء هذا النهج سابقا ووصف لفترة وجيزة في عدد قليل من المنشورات 1،9-13. هنا، علينا أن نظهر إجراء مفصل للحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي مجموعة فرعية معينة من الخلايا في بنية النسيج المعقد من خلال الجمع بين immunolabeling سريع مع LCM. وتبين لنا كيفية تنفيذ الخطوات الحاسمة الرئيسية للحصول على الانتعاش RNA القصوى وتجنب تدهور RNA لأنها قد سيجnificantly تأثير الجينات التعبير التنميط.

للمظاهرة من هذا البروتوكول، تم استهداف الخلايا العصبية الدوبامين من المخ الأوسط الماوس عمره يوم واحد. الخلايا العصبية الدوبامين يمكن immunolabeled استخدام أجسام مضادة موجهة ضد هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، وإنزيم معدل الحد لتخليق الدوبامين. وبعد المناعية TH، فرد أو مجموعة من الخلايا العصبية الدوبامين ويمكن بعد ذلك تكون معزولة باستخدام LCM. يتم جمع خلايا Microdissected في المخزن المؤقت تحلل، ويتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طقم العزلة RNA. يتم قياس نوعية وكمية الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام bioanalyzer 5. المزيد من التحليل في التعبير الجيني باستخدام: RNA التسلسل، ميكروأري، أو QRT-PCR يمكن بعد ذلك أن يؤديها 2،4،6. وكمثال على ذلك، وأظهرت من خطوتين QRT-PCR على الليزر استولت على المجالات الدوبامين معزولة. الكمي النسبي لمستويات التعبير من اثنين من جينات الخلايا العصبية الدوبامين علامة يوضح الانتقائية من هذا البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت التجارب وفقا لدليل الكندية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة حماية الحيوان لافال جامعة: ملاحظة.

التحضير 1. عينة

ملاحظة: في هذا المثال، استخدمنا أدمغة فئران في يوم ما بعد الولادة 1.

  1. استخدام التخدير انخفاض حرارة الجسم في الثلج المجروش لمدة 3 إلى 4 دقائق لالجراء، ثم تشريح أدمغة في أسرع وقت ممكن في الجليد الباردة المتوسطة L15. تنفيذ هذه الخطوة ضمن 2 دقيقة.
  2. نقل تشريح أدمغة في تضمين العفن. (راجع. قائمة العتاد) وملء مع الأنسجة المجمدة تضمين وسائل الاعلام مع الحرص على توجيه العينة في الموضع المطلوب. تجميد العينات مباشرة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 ° C. تنفيذ هذه الخطوة في غضون 30 ثانية.
    ملاحظة: العينات ويمكن تخزين بضعة أشهر دون المساس بنوعية RNA.

2. باجتزاء

  1. علاج الص الغشاءالشرائح الزجاجية تيد (راجع. قائمة المواد) مع حل ريبونوكلياز سطح تطهير للقضاء على أي أثر للRNAses. تغسل الشرائح في الماء DEPC والسماح لهم الجافة. بدلا من ذلك، والشرائح خبز بين عشية وضحاها في 200 ° C.
  2. نقل العينات المجمدة في ناظم البرد تنظيفها سابقا مع حل سطح ريبونوكلياز إزالة التلوث. ضبط درجة الحرارة الغرفة ناظم البرد في -20 ° C وشريحة العينات في 10 ميكرون سمك. جمع أقسام الأنسجة على الغشاء المغلفة الشرائح والسماح لهم الجاف 10 دقيقة قبل تلطيخ. بدلا من ذلك، والشرائح تخزينها في -80 درجة مئوية حتى تلطيخ.

3. إعداد حلول تلطيخ

  1. إعداد جميع الحلول فقط قبل بدء التجربة، واستخدام المانع ريبونوكلياز في جميع الحلول تلطيخ (باستثناء حلول الغسيل) لمنع تدهور الحمض النووي الريبي.
  2. إعداد الحل العازلة. استخدام نفس عازلة في جميع الحلول (التي تتألف من ريبونوكلياز خالية من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل من 1٪ BSA،0.2٪ تريتون و 2٪ ريبونوكلياز المانع). لكل شريحة، وإعداد 400 ميكرولتر من حل العازلة (200 ميكرولتر للالابتدائي و 200 ميكرولتر لالأجسام المضادة الثانوية).
  3. إعداد الحل تثبيتي: استخدام 70٪ من الإيثانول أبقى في -20 ° C. إبقاء الأنسجة إجراء تثبيت الحد الأدنى لتجنب انخفاض حاد في محصول استخراج الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم 95٪ من محلول الإيثانول تستكمل من حامض الخليك 5٪ الاحتفاظ بها في -20 ° C.
  4. إعداد الحل الأجسام المضادة الأولية عن طريق تمييع الأجسام المضادة الأولية في حل العازلة. لالخلايا العصبية الدوبامين وضع العلامات، واستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف هيدروكسيلاز التيروزين (TH، ومعدل الحد انزيم لإنتاج الدوبامين). استخدام تركيزات عالية من الأجسام المضادة للتعويض عن فترة حضانة سريع. استخدام TH الأجسام المضادة في التخفيف 1:25.
    ملاحظة: في بروتوكول المناعي الطبيعي، وهذا الجسم المضاد يعطي إشارة قوية عندما حضنت بين عشية وضحاها في التخفيف من 1: 1،000. في هذا البروتوكول، ويتم استخدامها 40X أكثر ويركزإد بسبب فترة حضانة قصيرة. نظرا لتركيز عال من الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الطريقة، إجراء المناعية القياسية بالتوازي من أجل التحقق من أي زيادة في وضع العلامات غير محددة.
  5. إعداد الحل الضد الثانوية عن طريق تمييع الأجسام المضادة الثانوية في حل العازلة. استخدام الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز بتركيز 1: 100.
    ملاحظة: في هذا المثال، استخدمنا المعقدة البيروكسيديز الأضداد المضادة للأرنب.
  6. إعداد معقدة (ABC) حل أفيدين البيوتين للكشف عن الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز. جعل حل ABC بإضافة مركب A و B المركب بتركيز 1: 100 المخفف في DEPC PBS تستكمل مع 2٪ ريبونوكلياز المانع. إعداد أفيدين-البيوتين معقد 30 دقيقة قبل إضافتها إلى الشرائح.

4. تلطيخ

  1. ذوبان الجليد واحدة أو شريحتين في الوقت من -80 ° C كتبها عبها بها في الهواء بسرعة (أو استخدام منفاخ الهواء). أقسام تحيط مع مسعورالقلم الحاجز والسماح جافة لعدد قليل من ثانية.
    1. وضع الشرائح في حل تثبيتي البارد لمدة لا تزيد عن 5 دقائق عند -20 درجة مئوية. يهز مرة واحدة في الهواء لإزالة الفائض من حل تثبيتي ثم، وسرعان ما تراجع الشرائح في أوقات DEPC PBS 6-8 للغسيل.
    2. نفض الغبار الشرائح لإزالة الفائض من DEPC PBS. تأكد من أن الشرائح إزالة الجليد خطوة لا تتجاوز 5 دقائق.
  2. مكان الشرائح على صينية نظيفة (سابقة التجهيز مع حل سطح ريبونوكلياز تطهير للقضاء على أي أثر للRNAses) ووضع 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية على كل شريحة (أرنب مكافحة TH) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تراجع الشرائح بسرعة في DEPC PBS 3 مرات للغسيل ونفض الغبار الشرائح مرة واحدة لإزالة الزائدة من DEPC PBS.
  3. وضع 200 ميكرولتر من الحل الضد الثانوية على كل شريحة لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تراجع الشرائح بسرعة 3 مرات في DEPC PBS للغسيل ونفض الغبار الشرائح لإزالة الفائض من DEPC PBS.
  4. وضع 200 ميكرولتر من المحاليل ABCنشوئها على كل شريحة لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تراجع الشرائح بسرعة في DEPC PBS 3 مرات للغسيل ونفض الغبار الشرائح لإزالة DEPC الزائد PBS.
  5. يعد حل خلال دقيقة 4 من الحضانة في حل ABC على DAB (3،3 'diaminobenzidine). استخدام الكواشف المنصوص عليها في عدة (DAB البيروكسيد الركيزة كيت). مزيج 1 قطرة من المقدمة العازلة، 1 قطرة من حل DAB و1 قطرة من 30٪ H 2 O 2 في 2.5ML من المياه DEPC. مزيج الحل بواسطة قلب.
  6. تأخذ 196 ميكرولتر من محلول DAB وإضافة 4 ميكرولتر (2٪) من ريبونوكلياز حل المانع فقط قبل أن ينتشر على الشرائح. مكان الشرائح على صينية نظيفة (سابقة التجهيز مع حل تطهير ريبونوكلياز السطح) وضعت 200 ميكرولتر من حل DAB على الشرائح.
    ملاحظة: حل DAB يجب أن تتفاعل within1 أو 2 دقيقة.
  7. تراجع الشرائح بسرعة في DEPC PBS 3 مرات لغسل ووضع الشرائح لبضع ثوان في الايثانول المطلق. تجفيف الشرائح التي كتبها عبها بها في الهواء (أو استخدام منفاخ الهواء). <ر /> ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل أو المجهزة للLCM.

5. الليزر التقاط تسليخ مجهري

  1. تذويب الشرائح بسرعة عن طريق التحريك بها في الهواء (أو استخدام منفاخ الهواء). تأكد من أن الشرائح إزالة الجليد خطوة لا تتجاوز 5 دقائق.
  2. انتقل إلى LCM. ضع الشريحة تحت المجهر مع الجانب عينة التي تواجه غطاء أنبوب جمع. اختيار أفضل التكبير للعينة. ضبط التركيز لرؤية خلايا الفائدة.
    1. تحديد منطقة القطع والبدء في قطع مع الليزر. جمع الخلايا تشريح أو قطعة من الأنسجة في غطاء أنبوب جمع مليئة 50 ميكرولتر من تحلل العازلة (من RNA عدة الاستخراج). ضمان أن خطوة LCM لا تتجاوز 30 دقيقة.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من خلايا معزولة باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي (راجع. قائمة المواد). اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
    1. احتضان الخلايا التي تم جمعها لمدة 30 دقيقة في 42 ° C لليز الخلايا. الشرط المسبق العمود تنقية RNA من خلال إضافة 250 ميكرولتر من تكييف العازلة. تحميل 50 ميكرولتر من الإيثانول إلى الخلايا هي lysed. تحميل 100 ميكرولتر من الخلايا هي lysed على عمود تنقية شروطا مسبقة.
    2. أجهزة الطرد المركزي لعمود في 16،000 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل العمود مرتين مع غسل المخازن المؤقتة. أزل في حجم الموصى بها الحد الأدنى (11 ميكرولتر) خالية من ريبونوكلياز المياه (لا DEPC معاملة لأنها قد تتداخل مع bioanalyser). حافظ على 2 ميكرولتر لاختبار جودة.
      يتم توفير جميع الحلول والكواشف في عدة: ملاحظة.

6. [كدنا] التجميعي والكمية RT-PCR

  1. عكس نسخ عينات من الحمض النووي الريبي ليزر القبض على خلايا الدوبامين في الحمض النووي مكملة باستخدام الناسخ العكسي وبنسبة ضئيلة (DT). اتبع بروتوكول الشركة المصنعة (راجع. قائمة المواد).
  2. استخدام 1 ميكرولتر من [كدنا لQRT-PCR التضخيم مع الاشعال الجينات المحددة. إعداد الجرمية PCRctions في حجم 20 ميكرولتر مع الساخن مزيج رد فعل بدء مكون واحد لالكمي PCR على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. تنفيذ كل رد فعل في ثلاث نسخ.
    1. لوصف التجارب هنا، استخدم أزواج التمهيدي التالية: GAPDH-F (5'-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 ') / GAPDH-R (5'-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3')؛ Rpl13a-F (5'-ACA ACT دول مجلس التعاون الخليجي CTG GAG GAG AA-3 ') / Rpl13a-R (5'-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3')؛ ث-F (5'-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 ') / ث-R (5'-غا AAT CAC GGG CAG ACA G-3')؛ شركة العين للتوزيع-F (5'- CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 ') / شركة العين للتوزيع-R (5'- GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3').
  3. أداء الكمي RT-PCR التضخيم باستخدام المعلمات الدراجات السريعة التالية: 95 ° C لمدة 5 دقائق تليها 45 دورات من 10 ثانية 95 درجة مئوية، و 10 ثانية في 60 ° C و 10 ثانية في 72 ° C. لتحليل منحنى ذوبان باستخدام الإعداد الافتراضي للأداة لdetermiتشكيل المنتج متجانس شمال شرق.
  4. تحليل البيانات باستخدام برنامج المضمنة.
    1. تطبيع قيم التعبير عن DA علامات الجينات ث وشركة العين للتوزيع مع التعبير عن اثنين من الجينات GAPDH إشارة وRpl13a للحصول على مستويات التعبير النسبية كما هو موضح سابقا 14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح هذا الإجراء immunolabeling السريع التصور من خلايا الفائدة مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. الشكل 1 يوضح خطوات إعداد الأنسجة قبل استخراج الحمض النووي الريبي. بعد cryosectioning، وصفت الخلايا العصبية الدوبامين استخدام أجسام مضادة موجهة ضد هيدروكسيلاز التيروزين (تظهر الخلايا العصبية المسماة في البني). تبعا لمسألة تجريبية، والخلايا واحدة أو منطقة أكبر من الفائدة يمكن أن تكون معزولة باستخدام LCM (الشكل 1D - E). من المهم تق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النقطة الأكثر أهمية لهذا الأسلوب تتمثل في وصفها خلايا الفائدة في حين منع تدهور الحمض النووي الريبي. كما RNAses ينشطون في المحاليل المائية، وخفض مرات الحضانة يحسن الحفاظ RNA 11،15. يجب أن يعامل جميع الحلول المستخدمة مع DEPC لتعطيل RNAses. جميع المواد والأسطح تحتاج إلى أن تعامل مع سطح حل ريبونوكلياز إزالة التلوث لمنع التلوث RNAses. وأخيرا، في هذه الظروف، إضافة ريبونوكلياز المانع في جميع حلول فعالة في الحفاظ على الحمض النووي الريبي من تتعرض للتدهور. استخدام الظروف الملح عا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل مدعوم بمنحة من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC: 418391-2012). حصلت AC على منحة دراسية من المركز البحثي في علوم الأعصاب (CTRN). يتم تمويل HDB من خلال منحة دراسية من Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) و ML هي FRSQ Chercheur-Boursier.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شرائح مغلفة بالغشاء Leica Biosystems11505158MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 & micro; m; 50 قطعة من
حل إزالة التلوث السطحي RNAseتقنيات الحياةAM9780RNaseZap
مثبت70٪ إيثانول محفوظ عند -20 درجة ؛ ج
مكافحة TH   ؛بيل فريزP40101  1:25
مخزن مؤقتDEPC PBS + 1٪ BSA + 0.02٪
مثبط تريتون RNAsePromegaN2615Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 كيلو وتر / مل (مخزون)
مختبرات ناقلاتالبيوتينيل المضادة للأرانبBA-1000
Vectastain Elite ABC kitمختبرات ناقلاتPK-61008 & micro ؛ لتر / مل
DAB بيروكسيداز الركيزة كيت   ؛من مختبرات ناقلاتSK-4100
تقنيات الحياةKIT0204مجموعة عزل الحمض النووي الريبي Arcturus PicoPure
H2O2< / sub> 30٪SigmaHC4060
نظام التشريح الدقيق بالليزرالمطلق
DEPCAlfa AesarB22753-14
BioanalyzerAgilentAgilent 2100
Bioanalyzer تضمين القالب   ؛Leica Biosystems14702218311
قلم حاجز مسعور 6x8mm  Vector LaboratoriesH-4000
وسائط تضمين الأنسجة المجمدةTissue-Tek4583
رقاقة المحلل الحيويAligent Technologies5067-1513RNA 6000 Pico LabChip المستخدمة مع Agilent 2100 Bioanalyzer
مزيج تفاعل البداية الساخنة ل PCRالكميRoche 6402712001بدء التشغيل السريع أساسي الحمض النووي الأخضر
ماستر النسخ العكسيالحياة تقنيات11752-050SuperScript III أول حبلا توليف SuperMix ل qRT-PCR
خال من RNAse قياسية مجموعة عزل الحمض النووي الريبي من لايكا نموذج AS-LMD

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
  4. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  5. Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
  6. Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
  7. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
  8. Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
  9. Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
  10. Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938(2013).
  11. Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
  12. Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
  13. Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
  14. Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , International University Line (IUL). La Jolla, CA. (2004).
  15. Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
  16. Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
  17. Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
  18. Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
  19. Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cell SubpopulationsBrain TissueRNA IntegrityRNA ExtractionqRT PCRRNA SequencingMicroarray

مقالات ذات صلة