مقالة منهجية

بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

DOI:

10.3791/52531

⸱

أبريل 20, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gasteroenterology and Hepatology, Academical Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في بروتوكول الفيديو هذا ، نقدم شرحا خطوة بخطوة لنقل الفيروسات في العضيات في ظهارة الأمعاء الأولية ومعالجة وتحليل المصب لهذه الثقافات عن طريق RT-PCR و RNA-microarray والكيمياء المناعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يمكن الاحتفاظ ب

هياكل الزغابات المعوية التي تسمى العضيات ، في ثقافة مستدامة ثلاثية الأبعاد عند استكمالها بعوامل النمو المناسبة. نظرا لأن العضيات تشبه إلى حد كبير الأنسجة الأصلية من حيث تمايز الخلايا الجذعية المتجانسة وقطبية الخلية ووجود جميع أنواع الخلايا المتمايزة نهائيا المعروفة لظهارة الأمعاء البالغة ، فإنها تعمل كمورد أساسي في البحث التجريبي على الظهارة. أدت إمكانية التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا أو الحمض النووي الريبي المتداخل باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية أو الفيروسات القهقرية في الأعضاء إلى زيادة فرص التحليل الوظيفي للظهارة المعوية والخلايا الجذعية المعوية ، متجاوزة الجينات المعدلة وراثيا التقليدية للفأر من حيث السرعة والتكلفة. في بروتوكول الفيديو الحالي ، نوضح كيفية استخدام نقل العضيات المعوية الدقيقة مع نواقل الفيروس الموضحة باستخدام الجينات المعدلة وراثيا المحفزة الدوكسيسيلين ، أو الحمض النووي الريبي القصير المحفز IPTG للإفراط في التعبير أو ضربة قاضية للجينات. علاوة على ذلك ، بالنظر إلى أن الثقافة العضوية تنتج عددا دقيقا للخلايا يمكن تقليله عن طريق العلاج التجريبي ، فإننا نوضح كيفية معالجة العضيات لتحليل المصب الذي يهدف إلى RT-PCR الكمي و RNA-المصفوفة الدقيقة والكيمياء المناعية. تساهم التقنيات التي تمكن من التعبير الجينات المعدلة وإسقاط الجينات في العضيات المعوية في إمكانات البحث التي تحملها هذه الهياكل الظهارية المعوية ، مما يؤسس للثقافة العضوية كمعيار جديد في زراعة الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الظهارة المعوية هي واحدة من أنسجة الجسم المتكاثرة بسرعة أكبر، الأمر الذي تسبب بها لجذب اهتمام واسع من البحوث على الخلايا السرطانية والجذعية. في عام 2009 تم نشر تقنية لتوليد الثقافات طويلة الأمد من الخبايا المعوية صغيرة في matrigel، والحفاظ على الأبعاد هيكل 1 3. هذه الهياكل، وصف organoids الأمعاء، يمكن تربيتها باستخدام تقنيات القياسية، مع توضيح تستكمل المتوسطة مع عدد من عوامل النمو محددة، بما في ذلك BMP-يشير مسار المانع رأس (نوج)، وWNT-يشير محسن مسار rspondin 1 (Rspo1) و عامل نمو البشرة (EGF) وجد كل لتعزيز انتشار الأمعاء 2-4.

Organoids تجاوز خطوط الخلايا السرطانية التقليدية في الجوانب التي هم غير المتحول، حافظوا على التسلسل الهرمي الخلايا الجذعية، وعرض الاستقطاب الخلوي سليمة ومعرض التمايز في جميع الأنساب الخلية وجدت في كثافة العمليات الصغيرة الوليدةظهارة estinal. لأنها يمكن transduced للقيام الجينات المحورة أو تدخل RNA يبني 5، وأنها تستخدم لدراسة عناصر وراثية محددة، تفوق التجارب باستخدام الفئران المعدلة وراثيا في جوانب التكلفة والسرعة. التعبير المعدلة وراثيا في organoids يمكن القيام بها باستخدام إما فيروسات أو الفئران ناقلات lentiviral 6،7. بسبب القيود المفروضة على الفيروسات القهقرية الفئران، قادرة على transducing الخلايا الإنقسامية حصرا 8، هو أكثر كثيرا ما تستخدم تنبيغ lentiviral للخلايا التي يصعب أن تصيب، مثل organoids.

transduced فيروسي والتعبير عن ثابت organoids المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم للعديد من التحليلات المصب، بما في ذلك RNA الكمي التحليلات والمناعية. أخذت معا، وتطورت ثقافة organoids من الخلايا الظهارية في الأمعاء الأولية في تقنية الروتينية التي هي سهلة لتنفيذ دون متطلبات مختبر معينة، وأصبحت المعيار رواية في مالثقافة ليرة لبنانية في البحث على ظهارة الأمعاء.

تقنيات تنبيغ الفيروسية وتحليل المصب لاحق في organoids هي شاقة لأداء وللمساعدة تجارب عضي ولدت لنا هذا البروتوكول الفيديو، والتي تبين طرق lentiviral تنبيغ organoids مثقف. وتبين لنا بالإضافة إلى ذلك كيف يصح تجهيز organoids يمكن زيادة الغلة، وبالتالي تعزيز أداء تحليل المصب باستخدام تقنيات RNA أو المناعية. في البروتوكول، واستخدمت organoids التي هي مستمدة من الخبايا المعوية الصغيرة حصرا، على الرغم من أن التقنيات الموضحة يمكن تطبيقها على organoids القولون أيضا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد Polyethylenimine (PEI) كما ترنسفكأيشن الكاشف

  1. حل حوالي 150 ملغ من PEI إلى 100 ​​مل من H 2 O.
  2. ضبط حل لدرجة الحموضة 7.4 بإضافة حمض الهيدروكلوريك حتى يصبح حل واضح ويقلب حتى يذوب تماما. وهذا قد يستغرق ما بين 10 و 60 دقيقة والمياه إضافة إلى تركيز نهاية 1 ملغ / مل.
  3. عندما اضح، تصفية حل PEI من خلال معقم مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية في aliquots من 5 مل.

2. إنتاج Lentiviral الجسيمات

اليوم 1:

  1. خلايا HEK293T انقسم الى 60٪ -80٪ confluency في 162 سم 2 قارورة أو طبق بتري كبير في خط الخلية مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 2 ملي الجلوتامين الملحق).

يوم 2:

  1. إعداد DNA الحل ترنسفكأيشن التي تحتوي على 45 ميكروغرام من إجمالي DNA البلازميد بإضافة معاناقلات lentiviral التعبئة والتغليف (7 ميكروغرام من pVSVg، 5 ميكروغرام من pRSV مراجعة (13)؛ ميكروغرام من pMDL) و 20 ميكروغرام من البلازميد lentiviral ترميز الجينات في المصالح أو shRNA من الاهتمام. التكيف مع حجم 1 مل باستخدام DMEM.
  2. إعداد PEI الحل ترنسفكأيشن من خلال إضافة 90 ميكرولتر من 1 ملغ / مل PEI إلى 930 ميكرولتر من DMEM واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة DNA الحل ترنسفكأيشن إلى حل PEI. دوامة أو عكس عدة مرات واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حل ترنسفكأيشن الحمض النووي.
  4. بالتنقيط 2 مل من محلول ترنسفكأيشن الحمض النووي على الخلايا HEK293T واحتضان لمدة 4 ساعات في ترطيب حاضنة الثقافة خلية على 37 ° C.
  5. بعد 4 ساعات، وتحديث مستنبت لإزالة PEI. وليس من الضروري أن يغسل خلايا قبل أن يضيف الوسيلة الجديدة.
    ملاحظة: PEI غير السامة للخلايا وحضانة مرات أطول من 4 ساعات قد يسبب ضررا للخلايا HEK293T.

اليوم 4:

  1. استبدال سوبrnatant مع الجديد مستنبت. الحفاظ طاف (التي تحتوي على فيروس)؛ هذا وسوف تستخدم في الخطوة 2.10.
  2. وضع طاف في 15 مل قارورة. لإزالة الخلايا الميتة، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
  3. دفع طاف من خلال 0.45 ميكرون فلتر باستخدام حقنة كبيرة 60 مل. تخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

يوم 5:

  1. جمع الدفعة الثانية من طاف. الطرد المركزي ومرشح كما هو الحال في الخطوات 2،8-2،9.
  2. تجميع supernatants من الخطوات 2.9 و 2.10 في أنابيب نابذة فائقة السرعة وأجهزة الطرد المركزي في 50،000 x ج في نابذة فائقة السرعة لمدة 90 دقيقة.
  3. تأخذ بها كبسولات تحتوي على أنابيب نابذة فائقة السرعة بعناية فائقة ووضعها في غطاء تدفق الصفحي، وتذكر التوجه من الأنبوب داخل أجهزة الطرد المركزي.
  4. كبسولة مفتوحة عقد أنبوب نابذة فائقة السرعة والمتوسطة صب بعناية في مثل هذه الأزياء التي بيليه على الجانب العلوي من الأنبوب. منذ الكريات الفيروسية قد يكون من الصعب تصور، تذكر على ماجانب من أنبوب بيليه سيكون قد تشكلت. اتخاذ ممص مكروى وإزالة الجزء الأخير من المتوسط ​​مع الحرص على عدم تستنهض الهمم بيليه البني مبهمة التي مرئيا على جانب من الجزء السفلي من أنبوب نابذة فائقة السرعة.
  5. و resuspend هذا بيليه في 500 ميكرولتر من عضوي الشكل مستنبت تستكمل مع 10 ملي نيكوتيناميد، 10 ميكرومتر Chir99021، 10 ميكرومتر Y27632 و 8 ميكروغرام / مل polybrene. إعادة تعليق في هذه الوسيلة هي مهمة منذ يستخدم الفيروس عيار عالية لtransduct organoids مباشرة.
  6. اختياريا: تجميد الفيروس في هذه الوسيلة aliquoted على دفعتين من 250 ميكرولتر في -80 ° C.

3. Lentiviral تنبيغ من Organoids

اليوم 0:

  1. تقسيم كامل 0.95 سم 2 جيدا organoids يومين قبل تنبيغ في بئر جديد، وتهدف إلى الحصول على ما يقرب من 50 organoids صغير. تقسيم organoids وفقا لبروتوكول نشرت سابقا 1 (الشكل 3A، B).
  2. تكملة عضي مستنبت مع 10 ميكرومتر Chir99021 و 10 ملي نيكوتيناميد للحصول فرط الكيسي أقبية التكاثري (الشكل 3C).
    ملاحظة: سوف أقبية الكيسي تطوير أفضل عندما تزرع organoids تقسيم حديثا في وجود Chir99021.

يوم 2:

  1. organoids الحصاد قبل pipetting صعودا ونزولا على matrigel والمتوسطة، وبالتالي تعطيل الخليط مع ممص مكروى P1000. ضع الخليط في أنبوب 15 مل.
  2. تعطيل باستخدام مزيد من باستور الماصة التي قد انخفضت افتتاح البعيدة عن ذوبان. organoids أجهزة الطرد المركزي لتكوير لمدة 5 دقائق في 100 × ز.
    ملاحظة: تعتمد على حجم الطرد المركزي، واستخدام سرعة أجهزة الطرد المركزي مختلفة. فمن الضروري للعثور على سرعة الدقيقة التي تعطلت يتم فصل organoids من الخليط.
  3. إزالة طاف وإضافة 500 ميكرولتر من قبل تحسنت التربسين 1X (على غرار 0.25٪ التربسين). و resuspend organoids في التربسين واحتضان3 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
  4. تعطيل التربسين بإضافة 3.5 مل من خط الخلية مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين والجلوتامين). أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
  5. إزالة طاف لترك بيليه في حوالي 20 ميكرولتر من المتوسط. نقل organoids في هذا المبلغ صغير الأخير من المتوسط ​​في بئر على طبق من ذهب 48-الآبار.
  6. إضافة العالية عيار الفيروسة البطيئة في التنبيغ المتوسطة كما هو موضح في الخطوة 2.14، في resuspend وانتقل إلى الخطوة 3.10. عندما تواجه منخفضة التنبيغ فعالية، خطوة 3.9 ويمكن أن يضاف.
    ملاحظة: للحصول على التنبيغ كفاءة، وعادة إضافة قسامة واحدة من 250 ميكرولتر من ارتفاع عيار الفيروسة البطيئة للبئر واحدة من organoids. وهذا يمثل 50٪ من جميع الفيروسة البطيئة تحصد من إنتاج واحد كما هو موضح في الخطوة 2 من هذا البروتوكول.
  7. اختياريا: لتعزيز فعالية التنبيغ، نفذ spinoculation من خلال وضع لوحة تحتوي على الآبار organoids 48 في مرحلة ما قبل درجة حرارة الطرد المركزي على 326؛ C وتدوير في 600 x ج لمدة 1 ساعة.
  8. وضع خليط فيروس عضوي الشكل في الثقافة الحاضنة واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة للسماح التنبيغ.
  9. اختياريا: لتعزيز فعالية التنبيغ، واحتضان organoids لمدة 3 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة.
  10. إضافة 1 مل من عضوي الشكل مستنبت و resuspend خليط فيروس عضوي الشكل، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في microcentrifuge لمدة 5 دقائق في 850 x ج لتكوير organoids.
  11. إزالة طاف و resuspend بيليه في 20 ميكرولتر من matrigel الجليد الباردة. منذ المواد يتصلب عندما يصبح أكثر دفئا، واستخدام نصائح ماصة التي توترت بسبب pipetting صعودا وهبوطا الجليد PBS البارد لعدة مرات.
  12. وضع قطرة في منتصف بئر في لوحة 48 بئرا واحتضان في حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لترسيخ.
  13. بعد 15 دقيقة، إضافة بعناية 250 ميكرولتر من عضوي الشكل مستنبت تستكمل مع10 ملي نيكوتيناميد، 10 ميكرومتر Chir99021 و 10 ميكرومتر Y27632. سوف شظايا عضي تعطلت صغيرة تشكل في organoids الكيسي صغير خلال 24 ساعة.

يوم 5:

  1. تحديث المتوسطة وتكملة مع مضاد حيوي التحديد (لبوروميسين، استخدم 4 ميكروغرام / مل).

يوم 7:

  1. استبدال المتوسطة لمعيار مستنبت عضي، على أن تستكمل مع اختيار المضادات الحيوية.
    ملاحظة: سوف الناشيء تكون كاملة 2-3 أسابيع بعد Chir99021 الانسحاب. بعد الاختيار، قد نمت organoids دون اختيار المضادات الحيوية.

4. عضي إعداد RNA لالكمي RT-PCR أو ميكروأري

  1. لإعداد RNA، واستخدام عدة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. إزالة المتوسطة من organoids وإضافة 350 ميكرولتر من العازلة RLT، على أن تستكمل مع β المركابتويثانول مباشرة على قبة matrigel تحتوي على organoids. Resuspend والعتادالقاعدة في RLT من قبل pipetting باستخدام P1000 ممص مكروى.
  2. أداء مزيد من الإعدادية RNA وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  3. اختياريا: زيادة الغلة RNA عن طريق التضخيم باستخدام نظام الحفاوة بيكو WTA، والتي تتطلب مدخلات الأولي من 50 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  4. اختياريا: لمراقبة الجودة قبل RNA ميكروأري، تشغيل العينات على 2100 bioanalyzer باستخدام حقيقي النواة مجموع RNA نانو رقاقة، وتهدف لعدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) من 8.5 أو أكثر (الشكل 5) وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

5. معالجة Organoids لتضمين البارافين والمناعية

  1. قبل الشروع في عضي تضمين ما قبل الحارة كتلة الألومنيوم مع الثقوب لتركيب 12 ملم أنابيب زجاجية قطرها في حاضنة عند 70 درجة مئوية للحفاظ على البارافين السائل.
  2. خذ بئر واحد مع organoids كامل نما وإزالة المتوسطة، وترك organoids جزءا لا يتجزأ سليمة.
  3. إضافة 1 ملمن بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني مباشرة إلى جيدا وإصلاح في 4 درجات مئوية في أي مكان من 1 ساعة ليلة وضحاها.
  4. استبدال بارافورمالدهيد مع 1 مل من الجليد الباردة PBS.
    اختياريا: الحفاظ على organoids الثابتة في برنامج تلفزيوني يصل إلى 1 في الاسبوع عند 4 درجة مئوية بعد هذه الخطوة.
  5. و resuspend organoids الثابتة في 1 مل من برنامج تلفزيوني ومكان في زجاج القارورة.
  6. السماح organoids تنزل الى القاع لمدة 1 دقيقة، صب PBS واستبدالها مع 70٪ من الإيثانول التي يتم فيها حل بضع قطرات من محلول يوزين لتمكين التصور من organoids في جميع مراحل عملية التضمين.
  7. ترك organoids في 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة، وإزالة 70٪ من الإيثانول عن طريق الصب بعناية، والقدرة على تصور organoids قبل العين بسبب بسيط وردي اللون يوزين. استبدال تضمين حل مع 96٪ من الإيثانول.
  8. كرر الخطوة 5.7، في كل مرة يحل محل الحل تضمين مع واحد القادم. تمرير organoids من خلال الحلول التالية لاحقا: 70٪ من الإيثانول و 90٪ من الإيثانول و 96٪ من الإيثانول، و 100٪ الإيثانولنول، و 100٪ من الإيثانول، الزيلين والزيلين.
  9. صب غسل زيلين الماضي وتصب البارافين في أنبوب. وضع أنبوب على الفور في مرحلة ما قبل درجة حرارة كتلة الألومنيوم عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، واستبدال البارافين مع البارافين نظيفة الجديد.
  10. صب البارافين قبالة والماصة organoids في القالب كتلة البارافين باستخدام درجة حرارة ما قبل باستور الماصة مع فتحة كبيرة. الحفاظ باستور الماصة دافئة باستخدام موقد بنسن. وضع كافة organoids في قالب كتلة البارافين في طبقة صغيرة من البارافين السائل.
  11. قدر الإمكان، في محاولة للتلاعب كل organoids نحو وسط القالب كتلة البارافين باستخدام إبرة تشريح تحسنت. حافظ على تشريح إبرة دافئة باستخدام بنسن الموقد.
  12. عندما توطين organoids في قالب غير مرضية، والبرد القالب قليلا ليصلب طبقة البارافين.
  13. الانتهاء من كتلة بصب المزيد من البارافين على رأس وإضافة معيار النسيجي التضمين الكاسيت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنبيغ lentiviral عضوي الشكل

تقنية التنبيغ عضوي الشكل باستخدام الجزيئات lentiviral تعتمد على المعالجة الصحيحة للorganoids قبل وأثناء التنبيغ. كانت Organoids (الشكل 3A) مثقف وأنها تعطلت في أقبية واحدة (الشكل 3B). كما ذكرت سابقا، أصبحت هذه الأقبية واحدة، عندما مثقف في وجود المانع GSK3 Chir99021 أقبية الكيسي 9 (الشكل 3C). وفي وقت لاحق تم trypsiniz...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف بروتوكول الفيديو الحالي تنبيغ lentiviral من organoids من ظهارة الأمعاء الأولية وتحليل المصب من هذه organoids باستخدام تقنيات RNA الكمية والمناعية.

وغالبا ما يقوم التنبيغ Lentiviral في الخلايا الملتصقة أو العائمة في لوحات الثقافة. منذ هيكل ثلاثي الأبعاد من organoids يجعل من الصعب اختراق من قبل الجسيمات الفيروسية، ويتم استخدام عدد من الأساليب لزيادة الفعالية. المعالجة المسبقة لorganoids باستخدام Chir99021 يزيد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'>J. Heijmans مدعوم بمنح من مؤسسة السرطان الهولندية (KFW). يتم دعم G.R. van den Brink بتمويل من مجلس البحوث الأوروبي في إطار برنامج الإطار الإطاري السابع للمجموعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) / اتفاقية منحة مجلس البحوث الأوروبي رقم 241344 وبمنحة VIDI من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (GvdB).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
البولي إيثيلين إيمينPolysciences23966-2
DMEM متوسطLonzaBE12-614F
مصل ربلة الساق الجنينيةLonzaDE14-801F
البنسلين الستربتومايسينInvitrogen15140-122
الجلوتامينInvitrogen25030-024
matrigelBDBD 356231
متقدم DMEM-F12Gibco12634-010
N2Invitrogen17502-048
B27Invitrogen17504-044
N< em>-acetyl cysteineSigmaA9165-1G
ماوس EgfInvitrogenPMG8045
Hepes 1 MInvitrogen15630-056
جلوتاماكس 100xInvitrogen35050-038
Chir 99021Axon1386
Y27632 سيجماY0503-5MG
بوليبرينسيجما107689
نيكوتيناميدسيجماN0636
تريبسينلونزاBE02-007E
بورومايسينسيجماP 7255
مجموعة صغيرة من RneasyQiagen74106
&# 946 ؛ -mercaptoethanolMerck8،057،400،250
Ovation Pico WTANuGen3300-12
paraformaldehydeSigma252549-1L
قارورة زجاجية مخروطية 12   ؛ مم × 75   ؛ مم 5   ؛ ملVWRLSUKM12
Eosin YellowishVWR1،159،350،025
نظام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents. Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).
  3. Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
  4. Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).
  5. Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. Generation of BAC transgenic epithelial organoids. PLoS One. 8 (10), e76871(2013).
  6. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
  7. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).
  8. Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).
  9. Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).
  10. Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة