يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الجيل الفعال للhiPSC العصبية النسب مراسلون Knockin معينة باستخدام كريسبر / Cas9 وCas9 مزدوجة نظام Nickase

10.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52539

⸱

مايو 28, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3The Senator Lloyd & B. A. Bentsen Center for Stroke Research, Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, The University of Texas Health Science Center at Houston, 4Summer Research Program, Office of Educational Programs, The University of Texas Health Science Center at Houston, 5Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical University, 6Department of Oncology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 7Biology Department, University of West Georgia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

أدت أدوات تحرير الجينوم مثل نظام CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas (المرتبطة ب CRISPR) إلى تحسين كفاءة استهداف الجينات بشكل كبير في الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لإنشاء مراسل hiPSC خاص بالنسب باستخدام إعادة التركيب المتماثل بمساعدة نظام CRISPR / Cas.

الملخص

استهداف الجين هو مقاربة نقدية لوصف وظائف الجينات في البحوث الطبية الحيوية الحديثة. ومع ذلك، فإن فعالية استهداف الجينات في الخلايا البشرية المنخفضة، مما يمنع جيل من خطوط الخلايا البشرية بمعدل المطلوب. وقد شهدت خلال العامين الماضيين تطورا سريعا على تحسين كفاءة التلاعب الجيني بواسطة أدوات تحرير الجينوم مثل كريسبر (المجمعة بانتظام Interspaced قصيرة المتناوب يكرر) / كاس (المرتبط كريسبر) النظام. تصف هذه المخطوطة بروتوكول لتوليد محدد الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) للصحفيين النسب باستخدام النظام كريسبر / كاس بمساعدة إعادة التركيب مثلي. إجراءات الحصول على المكونات اللازمة لصنع خطوط مراسل النسب العصبية باستخدام كريسبر / نظام CAS، مع التركيز على بناء استهداف ناقلات والرنا دليل واحد، ويرد. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لإنشاء منصة وتصحيح طفرة في hiPSCs.

المقدمة

أحدث

نظام CRISPR (التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام) / Cas (المرتبطة بكريسبر) ، جنبا إلى جنب مع أدوات تحرير الجينوم الأخرى ، ثورة في التلاعب بالجينوم البشري في السنواتالأخيرة 1-7. المكونات الرئيسية في نظام CRISPR / Cas9 هي RNA أحادي التوجيه (sgRNA) و Cas9. Cas9 هو نوكلياز داخلي من النوع الثاني من الحمض النووي الموجه بالحمض النووي الريبي. يحتوي على مجالين من مجالات النوكلياز ، HNH و RuvC ، وهما مسؤولان عن عمل فواصل مزدوجة الشريطة من الحمض النووي (DSBs) في منطقة جينومية معينة بجوار شكل متجاور للفاصل الأولي (PAM) 7-10. يحتوي sgRNA على وظيفة مشتركة لتلك الخاصة ب crRNA و tracrRNA ، وهما جزيئان من جزيئات الحمض النووي الريبي المناعية التكيفية التي تم تحديدهما في البكتيريا (مثل Streptococcus pyogenes) والعتائق لمحاربة غزو الحمض النووي للمصادر الخارجية9-11. عند تصميمه بشكل مناسب وإدخاله بشكل مشترك إلى خلايا الثدييات ، يتعرف sgRNA على تسلسل PAM ، وأزواج القواعد مع الخيط التكميلي للحمض النووي المستهدف ، ويوجه وينقل Cas9 للانشقاق في كلا خيوط الحمض النووي مباشرة في المنبع من PAM7. بعد ذلك ، سيحدث إعادة التركيب الموجه المتماثل (HDR ، في وجود ناقل استهداف) أو الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) لإصلاح DSBs. يمكن دمج الجينات المعدلة وراثيا مثل cDNA أو أشرطة المراسل أو الشظايا المقاومة للمضادات الحيوية ، وصنع خطوط معدلة وراثيا أو ضربة.

على الرغم من أن نظام CRISPR / Cas9 عالي الكفاءة ومحددا نسبيا ، فقد تم الإبلاغ عن أنشطة غير مرغوب فيها خارج الهدف12-15. لتقليل الأحداث خارج الهدف ، تم أيضا تصميم Cas9 nickases (Cas9n)9،10،14،16،17. Cas9n (Cas9 D10A أو Cas9 H840A) هو إنزيم Cas9 مع طفرات في أحد مجالي النوكلياز ، والذي يثير فقط شق في خيط واحد من الحمض النووي. لتحقيق الانقسام في كلا الخيوط ، تم تصميم اثنين من sgRNAs لتوجيه زوج من النيكاسات ، والتي تقطع بشكل منفصل في المواقع القريبة من خيوط الحمض النووي المختلفة. تتطلب استراتيجية "التقطيع المزدوج" تصميما أكثر صرامة من منصة Cas9 التقليدية ، وتوفر كفاءة عالية وخصوصية عالية لتجارب تحرير الجينات.

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لتوليد مبلغ الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحث البشري (hiPSC) باستخدام إعادة التركيب المتماثل بمساعدة نظام CRISPR / Cas. يتم وصف خطوات الحصول على المكونات اللازمة لإنشاء خطوط مراسل النسب العصبية باستخدام تحرير الجينوم بوساطة نظام CRISPR / Cas ، مع التركيز على بناء نواقل الاستهداف و sgRNAs. تم تكرار هذا البروتوكول بنجاح في العديد من خطوط hiPSC بما في ذلك تلك المشتقة من الأفراد الأصحاء ومن المرضى الذين يعانون من أمراض الجهاز العصبي المركزي. تشمل الجينات المستهدفة في مختبرنا OLIG2 و HB9 (MNX1) و NEUROG2 و SOX1 و ALDH1L1 و SOD1. تتراوح كفاءة الاستهداف من إعادة التركيب المتماثل بوساطة نظام CRISPR / Cas في hiPSCs من 20-40٪ ، وهو ما يتوافق مع التقارير السابقة1،18،19. بالمقارنة مع الكفاءة النموذجية البالغة 1-2٪ في تجارب استهداف الجينات التقليدية ، تم تحسين كفاءة الاستهداف بشكل كبير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التصميم وبناء المتجهات لتوجيه المتجهات

  1. بمجرد تحديد علامة النسب الخاصة ، حدد موقع التسلسل الجيني للجين وصمم أذرع التماثل وفقا لذلك. طول ذراع التماثل 5 '~ 1 كيلو بايت وذراع التماثل 3' هو ~ 1.5 كيلو بايت (الشكل 1).
  2. ضع علامة على كاسيت المراسل بالتتابع في اتجاه مجرى التسلسل الجيني مباشرة قبل كودون التوقف ، عن طريق الاستنساخ الفرعي ، بحيث لا يتم تغيير التعبير الداخلي أو تعطيله. اربط المراسل ، أو كاسيت (أشرطة المراسل) المزدوجة ، بتسلسلات الببتيد 2A ذاتية الشق (F2A أو E2A أو T2A) 20،21 ، أو موقع إدخال الريبوسوم الداخلي (IRES).
    ملاحظة: قد يشمل المراسلون بروتينات الفلورسنت مثل GFP أو tdTomato أو tagRFP أو YFP أو لوسيفيراز أو كاسيت مقاومة المضادات الحيوية ، وهي مزيج من البروتين الفلوري وكاسيت مقاومة المضادات الحيوية. يظهر مثال في الشكل 1 لإنشاء ناقل استهداف لجين ALDH1L1 البشري ، الموسومة بواسطة EGFP وكاسيت مقاومة النيومايسين.
  3. أضف شريط تحديد إيجابي في اتجاه مجرى النهر للمراسل. الاختيار الإيجابي هو كاسيت مقاوم للمضادات الحيوية التي سيتم استئصالها من iPSCs المستهدفة بعد اختيار المستنسخة الإيجابية وعزلها.
  4. قم بتضمين كاسيت تحديد سلبي خارج ذراع التماثل 3 بوصات. أشرطة الاختيار السلبية الشائعة هي ثيميدين كيناز ، المعارف التقليدية ، وسم الدفتيريا A (DTA) 22.
  5. احصل على استنساخ BAC بشري يحتوي على تسلسل علامة النسب وتحقق من الاستنساخ عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم ببناء متجه الاستهداف في pKD46 الذي يحتوي على DH5α باستخدام إعادة التركيب لسحب موقع الاستهداف 23. تطبيق بوابة متعددة المواقع ، استراتيجيات البوابة الذهبية23،24 عند الضرورة.
< p class = "jove_title" >2. تصميم وبناء المتجهات ل sgRNAs لنظام CRISPR / Cas9.

  1. حدد علامة النسب المحددة التي سيتم استهدافها لجعل المراسل. انسخ تسلسل (كدنا) من قاعدة بيانات NCBI. انتقل إلى بحث BLAT البشري للحصول على محاذاة الحمض النووي الجيني.
  2. انقر فوق علامة التبويب "المتصفح" لعرض تجميع الجين. ضمن علامة التبويب "عرض" ، انقر فوق "DNA" للحصول على تسلسل الحمض النووي الجيني الكامل بتنسيق FASTA.
  3. حدد موقع كودون التوقف داخل تسلسل الحمض النووي ، حيث سيتم تمييز تسلسل 2A وشريط المراسل.
  4. ابحث عن الشكل المجاور للفاصل الأولي (PAM ، أي NGG) داخل النمس (~ 100 نقطة أساس منطقة المحيطة) لكودون التوقف. امسح كلا الخيوط لتحديد تسلسل NGG المناسب. ضع في اعتبارك خصوصية التسلسلات الأولية لتجنب الأحداث المحتملة خارج الهدف. استخدم أدوات مفتوحة المصدر مثل BLAST و CasOT (انظر الخطوة 5 للحصول على التفاصيل).
  5. انسخ تسلسل القواعد ال 20 على الفور في المنبع من NGG والصقه في أداة تصميم الويب ZiFit لتصميم oligos مع الأجزاء المتدلية المتوافقة مع متجه تعبير gRNA البشري (مع مروج U6) MLM3636.
  6. قم بتوليف كل من oligos الأمامي والعكسي 7.
  7. لعمل sgRNA مزدوج الشريطة ، قم بتغيير طبيعة كل من oligos عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتبرد تدريجيا إلى RT. لتفاعل 50 ميكرولتر ، أضف 22.5 ميكرولتر من oligos الأمامي والعكسي (تركيز المخزون 0.1 ملليمتر) على التوالي ، و 5 ميكرولتر من مخزن التلدين (100 ملي مولار Tris-HCl ، 10 ملي EDTA ، 1.5 م كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 8.0).
  8. امزج وقم بربط oligos التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.7 باستخدام متجه تعبير gRNA البشري المهضوم BsmBI (مع محفز U6) MLM3636. لتفاعل 20 ميكرولتر ، أضف 1 ميكرولتر من oligos من الخطوة 2.7 ، و 100 نانوغرام من MLM3636 ، و 1 ميكرولتر (400 U) من T4 ligase. احتضان في RT O / N.
  9. قم بتحويل الخلايا المختصة DH5α باستخدام منتج الربط عن طريق الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، قم بزراعة البكتيريا في لوح LB agar Ampicillin (100 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية O / N. اختر 3 ~ 5 مستعمرات للبلازميد المصغر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تسلسل الحمض النووي البلازميد للتأكيد باستخدام البائعين التجاريين. Maxiprep البلازميد الصحيح وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  10. قم بتقييم sgRNA بواسطة مقايسة نوكلياز داخلي T7 1 (T7E1) (انظر الخطوة 4 للحصول على التفاصيل). سيتم التعبير عن hiPSC الشفاف مع البلازميد و sgRNA تحت محفز U6 المدمج في العمود الفقري MLM3636 (انظر الخطوة 6 للحصول على التفاصيل).
فئة

3. تصميم وبناء Cas9n Double Nickase sgRNA

  1. احصل على نيكاز مزدوج Cas9n D10A vector pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A).
  2. صمم زوجا من oligos الأمامية والعكسية لكل موضع استهداف. انسخ تسلسل القواعد ال 20 على الفور في المنبع من NGG كما هو موضح في الخطوة 2 والصقه في أداة تصميم الويب ZiFit
  3. للحصول على oligos ذات الأجزاء المتدلية المتوافقة مع pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) ، قم بإزالة القاعدة الأولى والأخيرة لكل من oligos الأمامية والخلفية التي تظهر بواسطة أداة تصميم ZiFit.
  4. توليف oligos للأمام والخلف7. قم بتسمية هذه oligos ك f (n) -F ، f (n) -R ل PAMs على جانب واحد من الموقع المستهدف ، r (n) -F ، r (n) -R ل PAMs على الجانب الآخر من الموقع المستهدف. من بين هؤلاء ، n هو الرقم لتعيين PAMs مختلفة ، ويمثل الأحرف الصغيرة f و r موقع PAMs إما عند المعنى (f) أو antisense (r) ، ويمثل F و R oligos الأمامية والخلفية.
    1. اختبر أزواج متعددة (على سبيل المثال ، r5 و f2) باستخدام مقايسة T7E1 (مفصلة في الخطوة 4) لتحديد الزوج المحسن من sgRNAs لاستخدامه في Cas9n.
  5. لعمل sgRNA مزدوج الشريطة ، قم بتغيير طبيعة كل من oligos عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتبرد تدريجيا إلى RT. لتفاعل 50 ميكرولتر ، أضف 22.5 ميكرولتر من قلة الصوديوم الأمامية والعكسية (تركيز المخزون 0.1 ملليمتر) على التوالي ، و 5 ميكرولتر من محلول التلدين (100 ملي مولار Tris-HCl ، 10 ملي EDTA ، 1.5 م كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 8.0).
  6. امزج وقم بربط oligos التي تم الحصول عليها من الخطوة 3.5 باستخدام pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) المهضوم BbsI. لتفاعل 20 ميكرولتر ، أضف 1 ميكرولتر من sgRNA من الخطوة 3.5 ، 100 نانوغرام من Cas9n (D10A) ، 1 ميكرولتر (400 U) من T4 ligase. احتضان في RT O / N.
  7. قم بتحويل الخلايا المختصة DH5α باستخدام منتج الربط عن طريق الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، قم بزراعة البكتيريا في لوح LB agar Ampicillin (100 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية O / N. اختر 3 ~ 5 مستعمرات للبلازميد المصغر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تسلسل الحمض النووي البلازميد للتأكيد باستخدام البائعين التجاريين. Maxiprep البلازميد الصحيح وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  8. تقييم sgRNA بواسطة مقايسة T7E1 (انظر الخطوة 4 للحصول على التفاصيل). سيتم التعبير عن hiPSC الشفاف مع البلازميد و sgRNA تحت محفز U6 المدمج في العمود الفقري Cas9n (D10A) (انظر الخطوة 6 للحصول على التفاصيل).
< p class = "jove_title" >4. تقييم sgRNAs بواسطة مقايسة T7 Endonuclease1 (T7E1)

  1. بالنسبة للوحة واحدة مكونة من 24 بئرا ، اللوحة 2 × 105 خلايا 293 قدما لكل بئر قبل يوم واحد (اليوم -1).
  2. في يوم التعدي (اليوم 0) ، شارك في نقل خلايا 293FT مع بلازميد sgRNA وناقل تعبير Cas9. أضف 0.5 ميكروغرام من ناقل sgRNA ، و 0.5 ميكروغرام من متجه تعبير Cas9 JDS246 (Cas9-003) ، و 1.5 ميكرولتر من ليبوفيكتامين 2000.
    1. للتحكم السلبي ، أضف 0.5 ميكروغرام من متجه تعبير GFP (على سبيل المثال ، GFP المدفوع بمحفز CMV في العمود الفقري pcDNA3) بدلا من نواقل sgRNA.
  3. بعد 72 ساعة (اليوم 3) ، قم بحصاد الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج السريع للحمض النووي وتجربته بقوة.
  4. يحتضن الخليط على حرارة 68 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم 95 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. هذا هو النموذج لتجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحقة.
  5. صمم كلا من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأمامي والخلفي لتضخيم التسلسل الذي يحيط ب PAM. عادة ما يكون طول منتج PCR المستهدف حوالي 400-500 نقطة أساس. توليف oligos7.
  6. للحصول على تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل 50 ميكرولتر ، أضف 1 ميكرولتر من القالب من الخطوة 4.5 ، و 0.5 ميكرولتر من هركولاز II ، و 0.5 ميكرولتر من DMSO ، و 10 ميكرولتر من 5x buffer ، و 0.5 ميكرولتر من مزيج dNTP ، و 1 ميكرولتر من مزيج التمهيدي الأمامي والعكسي.
  7. استخدم معلمات PCR التالية: 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، 35 دورة 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 59 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، مع تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق < / > ملاحظة: تنتج معلمات تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضحة هنا منتجات محددة للعديد من الجينات التي تم اختبارها. ومع ذلك ، فإن هذه الشروط تعتمد على الجينات التي يختارها المستخدم. غالبا ما تتطلب تفاعلات البوليميراز المتسلسل التي تستخدم الحمض النووي الجيني كقالب تحسينا لضمان عدم ظهور نطاقات إضافية. يمكن الخلط بين هذه الأشرطة الإضافية ومنتجات الانقسام بعد اختبار T7E1.
  8. قم بقياس تركيز الحمض النووي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مطياف عند A260.
  9. أضف 400 نانوغرام من منتجات PCR إلى 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم 2. أضف ddH2O إلى حجم التفاعل النهائي البالغ 19 ميكرولتر. احتضن في الماء المغلي لمدة 5 دقائق. دع التفاعل يجلس على المقعد ويبرد بشكل طبيعي حتى RT (45-60 دقيقة).
  10. أضف 1 ميكرولتر (10 وحدات / ميكرولتر) من T7E1 ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أوقف التفاعل بإضافة 2 ميكرولتر من 0.25 M EDTA ممزوجا بصبغة تحميل 6x DNA.
  11. قم بإذابة 2.5 جم من مسحوق الاغاروز إلى 100 مل من 1xTAE. ضعي الخليط في الميكروويف واسكبي الجل في علبة هلام. عندما يتشكل الجل ، قم بتحميل تفاعل 20 ميكرولتر بالكامل على هلام الاغاروز 2.5٪. قم بتشغيل الجل على حرارة 100-150 فولت لمدة 30 دقيقة.
  12. افحص الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 3). يقطع T7E1 في المواقع غير المتطابقة. بالنسبة ل sgRNAs التي تسببت في الانضمام النهائي غير المتماثل ، ستظهر منتجات PCR نطاقات ترحيل سريعة إضافية (أصغر في الحجم) مقارنة بالتحكم السلبي (الموضح في الخطوة 4.3).
  13. تقدير وتصنيف كفاءة قطع sgRNA ونسبة الإدخال والحذف (indel٪) من خلال مقارنة كثافة النطاق باستخدام برنامج Image J.
    1. لكل عينة تعمل على الجل ، قم بتعيين أشرطة الجل على أنها شريط غير مقطوع ، وشريط القطع 1 وشريط القطع 2.
    2. قم بقياس كثافة كل نطاق باستخدام ImageJ وفقا لكتيب البرنامج.
    3. احسب fcut باستخدام الصيغة التالية: fcut = (شريط القطع 1 + شريط القطع 2) / (الشريط غير المقطوع + الشريط المقطوع 1 + شريط القطع 2)
    4. احسب Indel٪ باستخدام الصيغة التالية: Indel = 1- √ (قطع 1-f).
< p class = "jove_title" >5. في التنبؤ بالسيليكو للمواقع المحتملة خارج الهدف

ملاحظة: يمكن التنبؤ بالمواقع المستهدفة المحتملة باستخدام أداة مفتوحة المصدر عبر الإنترنت تسمى CasOT17، وهو برنامج قائم على Perl.

  1. بالنسبة لنظام Windows ، قم بتنزيل برنامج CasOT وملفات قاعدة بيانات الجينوم البشري على القرص الصلب المحلي.
  2. قم بإعداد الملف المستهدف ل sgRNA المصمم بتنسيق FASTA.
  3. افتح الملف المسمى "casot". تظهر نافذة أوامر. اتركه كما هو في الوقت الحالي.
  4. افتح الملف المسمى "opt-generator" لإنشاء سلسلة خيارات. الصق مسار واسم الملف الهدف في مربع حوار الخيار "-t" أو "-target".
  5. الصق مسار ملف تسلسل الجينوم في مربع حوار خيار "-g" أو "-genome".
  6. قيم الإدخال –s أو –seed (القيمة الافتراضية هي 2) و –n أو -nonseed (القيمة الافتراضية هي 255). يتم إنشاء سلسلة الخيارات وستظهر في المربع الموجود أعلى الصفحة.
  7. انسخ سلسلة الخيارات والصقها في نافذة أوامر CasOT الموضحة في الخطوة 5.3.
    ملاحظة: قد يستغرق تشغيل برنامج CasOT من 30 إلى 90 دقيقة اعتمادا على الخيارات والكمبيوتر المستخدم. بمجرد الانتهاء ، سيتم إنشاء مجلد باسم "--". سيتم تضمين ملفين في المجلد ، ملف ".stat" يصف الإحصائيات وملف .csv (قيم مفصولة بفواصل) يحتوي على نتائج البحث التفصيلية.
  8. افتح ملف .csv باستخدام برنامج جداول بيانات. يتم توفير المعلومات التالية في الملف لكل موقع خارج الهدف: موقع الكروموسومات والجينوم ، وتسلسل الموقع ، ونوع عدم التطابق (مم) ، والعدد الإجمالي للقواعد غير المتطابقة ، ومعلومات exon المتعلقة بالموقع خارج الهدف.
  9. صمم بادئات PCR للمواقع التي تحتوي على <2 مم إما في التسلسل البذري أو غير البذور.
  10. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لاستنساخ hiPSC الإيجابي المحدد باستخدام الشروط التالية: 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، 35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 59 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، مع تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق < ب / > ملاحظة: تنتج معلمات تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضحة هنا منتجات محددة للعديد من الجينات التي تم اختبارها في مختبرنا. ومع ذلك ، فإن هذه الشروط تعتمد على الجينات التي يختارها المستخدم. غالبا ما تتطلب تفاعلات البوليميراز المتسلسل التي تستخدم الحمض النووي الجيني كقالب تحسينا لضمان عدم ظهور نطاقات إضافية.
  11. تسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ومواءمة نتائج التسلسل مع التسلسلات المتوقعة والبحث عن الطفرات. إذا كانت الطفرات موجودة ، تحديد الأحداث غير المستهدفة.
< p class = "jove_title" >6. التثقيب الكهربائي لمركبات hiPSCs لصنع مراسلي النسب العصبية

  1. استزراع hiPSCs في وسط TeSR-E8 على أطباق Geltrex المطلية. قم بتغيير الوسط إلى MEF-CM (وسط مكيف للأرومات الليفية الجنينية للفأر) متوسط قبل يومين من التثقيب الكهربائي. احتضان 2 مل من Accutase لمدة 5 دقائق واجمع الخلايا.
  2. قم بالكهرباء hiPSCs مع ناقل الاستهداف الخطي ، وناقل التعبير Cas9-003 ، وناقل sgRNA باستخدام الشروط التالية: 1 × 107 hiPSCs ، ونقل مشترك 2.5 ميكروغرام من sgRNA ، و 2.5 ميكروغرام من Cas9 و 50 ميكروغرام من ناقل الاستهداف. لاستراتيجية النيكاز المزدوجة ، أضف 50 ميكروغرام من متجه الاستهداف ، و 2.5 ميكروغرام من كل sgRNA (مع Cas9n يعبر عنه المتجه).
  3. حدد المستنسخة عن طريق التحديدات الإيجابية والسلبية كما هو موضح24،25.
  4. تحديد المستنسخة الإيجابية عن طريق تحليل اللطخة الجنوبية أو PCR الجيني بعيد المدى24،25.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم بناء نواقل الاستهداف التي تحتوي على جميع المكونات اللازمة، بما في ذلك أذرع التماثل، وكاسيت المراسل، وكاسيتات الاختيار الإيجابي والسلبي (الشكل 1). وبناءً على الموقع الجينومي الداخلي، يتم تصميم عدة (من 2 إلى 3) sgRNAs (في حال استخدام نظام Cas9) أو أزواج من sgRNA (في حال استخدام استراتيجية Cas9n double nickase) وبناؤها في ناقل التعبير البشري human-gRNA-expression vector MLM3636 أو الهياكل pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) (الشكل 2). وقبل ترصيص الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد استهداف الجينات أداة أساسية في توصيف وظائف الجينات. ومع ذلك ، فإن الكفاءة المنخفضة نسبيا تتطلب عملا كثيف العمالة ويستغرق وقتا طويلا. في الآونة الأخيرة ، أدى التطوير على أدوات تحرير الجينوم مثل نظام CRISPR (التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام العنقودية) / Cas (المرتبطة بكريسبر) إلى تحسين كفاءة الاستهداف بشكل كبير. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لتوليد مراسل الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC) المستحث على النسب باستخدام إعادة التركيب المتماثل بمساعدة نظام CRISPR / Cas. تم وصف خطوات الحصول على المكونات الضرورية لصنع خطوط مراسل النس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل قسم جراحة الأعصاب ، ومؤسسة ميموريال هيرمان ، وصندوق ستامان أوجيلفي ، ومركز بنتسن للسكتة الدماغية في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في هيوستن ، ومؤسسة Mission Connect TIRR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
pStart-KAddgene20346
pWS-TK6 Addgene20350
pKD3 Addgene45604
pKD46مركز المخزون الوراثي القولوني ، CGSC7634
تسلسل PGK-neo-bpA   ؛Addgene13442
استنساخ BAC البشري للجينات المستهدفة https://bacpac.chori.org
JDS246 (Cas9-003) ، المكورات العقدية المقيحة المحسنة لكودون الثدييات Cas9-3X FlagAddgene43861
MLM3636 ، Human-gRNA-ExpressionVector مع مروج U6   ؛Addgene43860
pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A)تصميم Addgene42335
sgRNA ، ZiFithttp://zifit.partners.org/ZiFiT/
Off أداة التنبؤ بالهدف CasOThttp://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php
Perlhttp://www.perl.org/get.html
NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAThttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start
sgRNA Primer synthesisSigma
One shot Top10 Electrocomp E. Coli Competence CellsLife TechnologiesC4040-50
AccuPrime Pfx SupperMixLife Technologies12344-040
إنزيمات التقييدNEB و Life Technologies
Zymoclean Gel DNA Recovery KitZymo ResearechD4007
المخزن المؤقت للاستخراج السريع للحمض النووي  EpicenterQE0905T
Herculase II Fusion DNA PolymerasesAgilent Technologies600675
Digest Buffer 2New England Biolab
6X DNA LoadingDye Thermo ScientificR0611
TeSR-E8 Kit for hESC / hiPSC MaintenanceStem CellsTechnologies 05940
UltraPure Agarose  لايف تكنولوجيز16500-100
50xTAEلايف تكنولوجيزB49
أساسي 8 متوسط تقنيات الحياةA1517001
Dulbecco s محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون الكالسيوم والمغنيسيوم   ؛لايف تكنولوجيزA12856-01
D-MEM/F12 مع Glutamax 10565018Life Technologies
D-MEM مع Glutamax   ؛Life Technologies10566040
Fetal Bovine Serum-ES المؤهلة للخلية لايف تكنولوجيز10439
مصل الضربة القاضية البديلة  لايف تكنولوجيز10828010
2-mercaptoethanol 1000X & nbsp ؛لايف تكنولوجيز21985023
الأحماض الأمينية غير الأساسية  لايفتكنولوجيز 11140050
Stempro Accutase  لايفتكنولوجيز A1110501
Dispase لايف تكنولوجيز17105-041
0.25٪ محلول التربسين- EDTA لايفتكنولوجيز 25200-056
Geltrex لايف تكنولوجيز     12760-013
مثبط الصخور Y-27632Millipore    كاشف SCM075
SMC4  BD354357
مقاومة للنيومايسين MEF MilliporePMEF-NL
Hygromycin المقاوم MEF   ؛MilliporePMEF-HL
G418 (Geneticin) LifeTechnologies11811
Hygromycin B & nbsp ؛Life Technologies10687010
FIAU (Fialuridine, 1-2-Deoxy-2-fluoro-ß-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil  مورافيك للكيماويات الحيوية والكيماويات المشعة    M251
Electroporator: Gene Pulser Xcell  Bio-Rad
0.4 سم كوفيت التثقيب الكهربائي  Bio-Rad165-2088
DIG-High Prime لوضع العلامات على الحمض النووي والكشف عنه مجموعة بدء التشغيل II روش11585614910
حل التهجين التهجين VWR82021-478
طقم تركيب مسبار PCR DIG  Roche11636090910
DIG مجموعة الغسيل Roche11585762001
Anti-Digoxigenin (DIG-AP) Roche11093274910
CSPD chemileanescence system Roche11755633001
DIG مجموعة الغسيل والكتلة العازلة  Roche11585762001
50X TAE buffer لايف تكنولوجيز24710030
المخزن المؤقت للنشاف (25 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.4,  0.15 M كلوريد الصوديوم,  0.1٪ Tween20)
Hoefer Ultraviolet Crosslinker فيشر ساینتفيك03-500-308
سبيرميدين  فيشرAC13274-0010
تريس حمض الهيدروكلوريك 2M (درجة الحموضة 7.5)VWR    200064-506
دينفيل الفيلم الحيوي الأزرق العلمي 8x10 فيشرnc9550782
علامة الوزن الجزيئي للحمض النووي II (علامة DIG) Roche11218590910
Amersham Blotting Membrane Hybond-N +  ؛Roche95038-400
صينية تجفيف زجاج Pyrex فيشر15-242A
كيمبرلي كلارك مناشف ورقية قابلة للطي  فيشر06-666-32B
ورق واتمان 3 مم (26X41)فيشر    05-713-336
كيس التهجين Roche11666649001
أنابيب التهجين فيشر13-247-300
فرن التهجين المشواة Shake 'n' Stack فيشرHBMSOV14110

المراجع

  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
  2. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  3. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
  4. Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. , (2013).
  5. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013).
  6. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  7. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., Jinek, M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 513, 569-573 (2014).
  8. Deltcheva, E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471, 602-607 (2011).
  9. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2579-E2586 (2012).
  10. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  11. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471(2013).
  12. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31, 822-826 (2013).
  13. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31, 827-832 (2013).
  14. Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 31, 833-838 (2013).
  15. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nature Biotechnology. 31, 839-843 (2013).
  16. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11, 399-402 (2014).
  17. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
  18. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9, 1956-1968 (2014).
  19. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
  20. Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nature Biotechnology. 22, 589-594 (2004).
  21. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
  22. Yagi, T., et al. A novel negative selection for homologous recombinants using diphtheria toxin A fragment gene. Analytical Biochemistry. 214, 77-86 (1993).
  23. Wu, S., Ying, G., Wu, Q., Capecchi, M. R. A protocol for constructing gene targeting vectors: generating knockout mice for the cadherin family and beyond. Nature Protocols. 3, 1056-1076 (2008).
  24. Xue, H., et al. A targeted neuroglial reporter line generated by homologous recombination in human embryonic stem cells. Stem Cells. 27, 1836-1846 (2009).
  25. Liu, Y., Jiang, P., Deng, W. OLIG gene targeting in human pluripotent stem cells for motor neuron and oligodendrocyte differentiation. Nature Protocols. 6, 640-655 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

T7
الجيل الفعال للhiPSC العصبية النسب مراسلون Knockin معينة باستخدام كريسبر / Cas9 وCas9 مزدوجة نظام Nickase
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.