مقالة منهجية

متساوي التضخيم (LAMP) فحوصات بوساطة حلقة للكشف عن أنواع محددة من

27.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52552

⸱

فبراير 20, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Pathogen Biology, Royal Veterinary College, London, 2BIOPHARM, Research Institute of Biopharmacy and Veterinary Drugs

في هذه المقالة

ملخص

لا يزال تشخيص عدوى إيميريا في الدجاج متطلبا. عادة ما تكون الأساليب التي تقودها مورفولوجيا الطفيليات وأمراض المضيف غير حاسمة ، في حين أثبتت الأساليب الجزيئية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل أنها تتطلب التكلفة والخبرة. الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء تضخيم متساوي الحرارة بوساطة حلقة (LAMP) كتشخيص جزيئي مباشر للعدوى الإيمرية.

الملخص

طفيليات أنواع Eimeria ، والأوليات التي تسبب مرض الكوكسيديا المعوي ، تشكل تهديدا خطيرا لإنتاج ورفاهية الدجاج. في حالة عدم وجود سيطرة فعالة ، يمكن أن يكون الكوكسيديا السريري مدمرا. تعد مقاومة الأدوية الوقائية الكيميائية المستخدمة بشكل متكرر للسيطرة على إيميريا شائعة والعدوى شبه السريرية منتشرة على نطاق واسع ، مما يؤثر على نسب تحويل العلف والقابلية لمسببات الأمراض الأخرى مثل المطثية perfringens. على الرغم من توافر الأدوات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، لا يزال تشخيص عدوى إيميريا يعتمد بشكل شبه كامل على الأساليب التقليدية مثل تسجيل الآفات ومورفولوجيا البويضات ، ولكن أيا منهما ليس مباشرا. تشمل قيود الأدوات الجزيئية الحالية متطلبات المعدات المتخصصة وصعوبات الوصول إلى الحمض النووي كنموذج. ردا على ذلك ، تم تطوير بروتوكول بسيط لتحضير الحمض النووي الميداني ولوحة من فحوصات التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة الخاصة بالأنواع (LAMP) ل Eimeria السبعة التي تم التعرف عليها لإصابة الدجاج. نقدم الآن بروتوكولا مفصلا يصف تحضير الحمض النووي الجيني من أنسجة الأمعاء التي تم جمعها بعد الوفاة ، متبوعا بإعداد وقراءة فحوصات LAMP يمكن استخدام LAMP الخاص بأنواع Eimeria لرصد حدوث الطفيليات ، وتقييم فعالية استراتيجية المزرعة المضادة للكوكسيديات ، وتشخيص العدوى شبه السريرية أو المرض السريري ذي القيمة الخاصة عندما يكون الترصد الخبير غير متاح.

المقدمة

إنتاج الدجاج العالمي زاد عشرة أضعاف على مدى السنوات ال 50 الماضية مع العالم النامي تستضيف ما يقرب من أربعة أضعاف التوسع الذي شهدته بلدان العالم المتقدم (www.faostat.org) . كما نمت أهمية إنتاج الدجاج للأمن الغذائي العالمي كذلك فعلت الملف الشخصى مسببات الأمراض التي يمكن أن تسبب مرض خطير في الدجاج. واحد مثال هي الأنواع الأيمرية، الطفيليات في كل مكان والتي يمكن أن تسبب المرض المعوي الكوكسيديا 1. أينما وتربى الدجاج من المرجح أن تكون مشتركة 2-4 واحد أو أكثر من الأنواع الأيمرية. في العالم المتقدم يتم التحكم الأيمرية المقام الأول عن طريق الوقاية الكيميائية، وتوظيف برامج المكوك أو دوران للحد من تأثير المقاومة 5. وتستخدم اللقاحات الحية أيضا في أنظمة حيث القيمة الطيور كافية لتبرير التكلفة (على سبيل المثال، تربية الماشية، والطبقات وبعض الفراريج 5). ونتيجة لدورة الفتشوبLT هذه التدابير غالبا ما تسيطر الكوكسيديا السريري بشكل جيد، على الرغم من العدوى دون السريرية هو شائع 5. في التطعيم العالم النامي أمر نادر وتطبيق المخدرات في كثير من الأحيان أبلغ أقل أيضا. ونتيجة لذلك الكوكسيديا الفرعي السريرية والسريرية هو أكثر شيوعا ويمارس تأثير اقتصادي كبير 3.

وقد اعتمد تشخيص العدوى eimerian تقليديا على الآفة وسجل بعد الوفاة، على الرغم من أن الكتاب من سجل النظام الأكثر استخداما على نطاق واسع وعلق أنه بالنسبة لبعض الأنواع "يبدو المشكوك فيه ما إذا كان ينبغي حاول هذا الإجراء في أي ولكن باعتدال شديدة العدوى" (6). ويمكن جمع أدلة التكميلي من خلال الكشف المجهري للمقاومة للبيئة مرحلة البيوض المتكيسة دورة الحياة في عينات البراز أو القمامة، على الرغم من تداخل التشكل يمكن أن نخلط جميع ولكن الخبير 6،7. بدائل الجزيئية باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، amplificatio عشوائيوقد ن من متعدد الأشكال DNA PCR (RAPD-PCR) والتكنولوجيات PCR الكمي متاح لمدة تصل إلى 20 سنوات 8-10، ولكن حتى الآن فشلوا لتصبح شعبية. حساب النسبي ومتطلبات معدات المختبرات المتخصصة أو معالجة حدت امتصاص، وعلى الرغم من الطبيعة في كثير من الأحيان غير موضوعية وتطلبا من الناحية الفنية من pathology- كبار السن والنهج القائم على الفحص المجهري 10،11. وهذه القيود يمكن أن يكون مبالغا فيه في كثير من المناطق الأكثر فقرا من العالم مثل جنوب شرق آسيا، حيث قد يكون تأثير الكوكسيديا على الفقر أكبر نسبيا 12. وردا على ذلك هناك طلب واضح عن الجديد واضحة وحساسة، ولكن فعالة من حيث التكلفة، فحوصات تشخيصية الأيمرية أنواع محددة.

متحاور التضخيم (LAMP) بوساطة حلقة هو وسيلة سهلة لإعداد DNA تقنية يحركها البلمرة التي هي قادرة على تضخيم كميات كبيرة من الحمض النووي. الأهم من ذلك، يستخدم LAMP على polymera بتوقيت جرينتش DNAحد ذاته بدلا من البلمرة DNA طق التي يشيع استخدامها في PCR، مما يسهل تضخيم DNA عند درجة حرارة ثابتة واحدة دون الحاجة لركوب الدراجات الحرارية 13،14. LAMP يمكن أن تكون قابلة للتطبيق حتى في المختبر الأكثر بدائية أو في الميدان. ومن خلال تميزها المقاومة النسبية للعديد من مثبطات PCR، وحساسية عالية وخصوصية، تم وضع المقايسات LAMP لمجموعة واسعة من مسببات الأمراض بما في ذلك فيروس داء الغومبورو، المطثية الحاطمة والكريبتوسبوريديوم 15-17. وردا على الطلب على التشخيص الأيمرية فعالة من حيث التكلفة أنواع محددة جديدة وقد وضعت لجنة من المقايسات LAMP محددة لكل من سبعة أنواع الأيمرية التي تصيب الدجاج 18. وتشمل التطبيقات لفحوصات جديدة للرصد الطفيل واقعة ذات قيمة خاصة نظرا لارتباط الأنواع مثل الأيمرية ماكسيما أو الأيمرية الفاتكة مع المؤسسة العامة الاقتصادي الضعيفrformance 3،4. وتشمل التطبيقات الأخرى تقييم فعالية الاستراتيجية المزرعة anticoccidial، تشخيص العدوى دون السريري أو المرض السريري وتقييم المخاطر التي يشكلها الأيمرية إلى مزرعة.

البروتوكول

1. قالب التحضير

ملاحظة: أي قالب الحمض النووي الجيني يشتبه في احتوائها على DNA المستمدة من واحدة من سبعة أنواع الأيمرية التي تصيب الدجاج ويمكن استخدام قالب لتحديد الأنواع الأيمرية القائم على LAMP. عينات الأنسجة المعوية لتحليل تشخيصي المجال ينبغي جمع خلال روتينية بعد الوفاة كما هو موضح هنا.

  1. اختيار القسم (أو الأقسام) من الأمعاء لفحصها. انظر الجدول رقم 1 لدليل لاختيار الموقع العينة والأنواع الأيمرية الأكثر احتمالا أن يكون حاضرا 18 والشكل 1 لمجموعة أنواع محددة من التوزيع وموقع من مواقع أخذ العينات.
    ملاحظة: هذا هو ذات أهمية رئيسية منذ الأيمرية هي أبرزها الموقع المضيف معين. كل الأنواع التي تصيب الدجاج تم تعريفه من قبل المنطقة المعوية أنه يستهدف 19. قد تكون أثرت على قرار من خبرة سابقة في المزرعة، والفائدة في واحد أو موإعادة الأنواع الأيمرية محددة أو المؤشرات التشخيصية الأخرى 6.
  2. المكوس 5 سم أو أطوال أطول من قسم الأمعاء (ق) المختارة لاختبار الأيمرية باستخدام مقص العقيمة أو مشرط. اختياريا، وتخزين العينات لتحليلها لاحقا في تثبيتي مثل على سبيل المثال في RNAlater 18 أو 95٪ من الإيثانول.
    ملاحظة: إذا تخزينها في الإيثانول العينة يجب غسلها جيدا في العقيمة تريس ethylenediaminetetraacetic حمض (TE) العازلة قبل الاستخدام.
  3. قطع العينة مفتوحة طوليا، وإزالة محتويات الأكثر المعوية (إذا كان موجودا) وكشط الخلايا من الطبقة المخاطية مجانا باستخدام إما حافة معقمة شريحة ميكروسكوب زجاجية أو شفرة مقص الإيثانول / اللهب تعقيمها. اختياريا لعينة المجمعة تشمل الخلايا من كل أربعة من المواقع الأنواع محددة في الامعاء في أنبوب واحد.
  4. وضع مواد كشط في العقيمة 1.5 مل المسمار أعلى أنبوب microcentrifuge تحتوي على 100 ميكرولتر العقيمة العازلة TE بما في ذلك 10٪ (ث / ت) Chelex 100 الراتنج.
  5. يهز كل عينة بقوة لمدة 1 دقيقة. تأكد من أن رأس المسمار مغلق بإحكام ثم احتضان في حمام الماء المغلي لمدة 10 دقيقة.
  6. بعد الغليان تسمح لكل عينة لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة.
  7. الطرد المركزي كل عينة باستخدام microcentrifuge في سرعة قصوى (على سبيل المثال، ~ 10،000 x ج) لمدة 1 دقيقة.
  8. جمع 2 ميكرولتر من طاف مما أدى إلى أن يكون القالب في كل فحص LAMP التي يتعين الاضطلاع بها. اختياريا، تجمع أكثر من موقع الأمعاء في أنبوب واحد لتوفير الفحص في مواقع متعددة.

2. الأيمرية LAMP التمهيدي إعداد (ما قبل الفحص)

  1. إعداد الأسهم التمهيدي الأيمرية LAMP كافية ل100 المقايسات:
    1. إعادة تشكيل كل lyophilised الأيمرية LAMP التمهيدي بإضافة الماء الصف الجزيئية إلى تركيز 100 ميكرومتر (كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة). إذا لم يكن محددا، وحساب حجم الصف الجزيئية المياه اللازمة النقيبز الأوزان البدنية والجزيئية من كل التمهيدي.
    2. ماصة 60 ميكرولتر الصف الجزيئية المياه إلى 0.5 مل الوجه العلوي أنبوب microcentrifuge منفصلة لكل نوع الأيمرية أن يعاير.
    3. إضافة الاشعال FIP، BIP، F3، B3، LF وLB محددة إلى الهدف الأنواع الأيمرية إلى الماء باستخدام كميات هو مبين في الجدول رقم 2، وخلق سلسلة من يمزج التمهيدي سبعة أنواع محددة.
    4. لفترة وجيزة دوامة مزيج الحل التمهيدي، ثم نبض microfuge وتجميد حتى المطلوبة.
  2. إعداد mastermix رد فعل LAMP لكل الأنواع الأيمرية أن يعاير. مضاعفة كميات هو مبين في الجدول 3 من قبل عدد من العينات وإضافة ثلاثة إلى مراقبة إيجابية، والسيطرة السلبية وpipetting لالغيار. ماصة إلى 0.5 أو 1.5 مل الوجه العلوي أنبوب microcentrifuge.

3. الأيمرية LAMP الفحص

  1. ماصة 23 ميكرولتر الأيمرية أنواع محددة بتوقيت جرينتش DNA بوليميريز / LAMP mastermix إلى 0.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  2. إضافة قالب DNA 2 ميكرولتر (المعد في القسم 1)، مما يجعل حجم رد الفعل النهائي من 25 ميكرولتر.
  3. إضافة الحمض النووي الجيني 2 ميكرولتر الأيمرية أنواع محددة لرد فعل واحد (مراقبة إيجابية). إضافة 2 ميكرولتر المياه الصف الجزيئية إلى رد فعل (المراقبة السلبية).
    ملاحظة: إذا كان الحمض النووي الجيني أنواع محددة لا يتوفر على LAMP إيجابي السابق أو منتج PCR القياسية يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك.
  4. احتضان في حمام مائي أو كتلة الحرارة عند 62 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اختياريا، دي-تفعيل البلمرة بتوقيت جرينتش DNA عن طريق التسخين إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة إذا كان رد الفعل لن تكون قراءة الفور.

4. LAMP الفحص للقراءة خارج

  1. وفي ختام حضانة تقييم اللون من كل رد فعل من جانب العين تحت ضوء داخلي. نتائج سلبية تظهر الوردي إلى البنفسجي في اللون، وتظهر نتائج إيجابية السماء الزرقاء 20.
  2. اختياريا، تأكيد نتيجة الفحص LAMP في laboratأوري عن طريق خلط 5 ميكرولتر ناتج التفاعل LAMP مع 1 ميكرولتر عازلة هلام DNA تحميل لالاغاروز الكهربائي هلام باستخدام 2٪ هلام الاغاروز في 1 × تريس / البورات / EDTA (TBE) العازلة، ملطخة مسبقا باستخدام صمة عار الحمض النووي (5 ميكرولتر في 50 مل الاغاروز). إضافة 5 ميكرولتر من 1KB الجزيئي سلم DNA حجم حارة 1 من هلام للسماح حساب حجم شظية.

النتائج

التحقق من صحة الفحص

أثناء التحقق من الصحة تم اختبار كل الأيمرية أنواع محددة LAMP الفحص باستخدام لوحة عينات DNA نقية تمثل جميع سبعة أنواع الأيمرية التي تصيب الدجاج، وكذلك الحمض النووي الجيني الدجاج كعنصر تحكم المضيف. وقد استخدم الاغاروز الكهربائي للهلام لحل كل فحص وأظهرت خصوصية الأنواع المطلقة مع أي مضيف عبر التفاعل 18. وبعد ذلك، أعدت عشرة أضعاف مسلسل سلسلة التخفيف باستخدام النقى الرهيفة الأيمرية كشف الحمض النووي الجيني حدا حساسية الفحص من بين واحد وعشر نسخ الجينوم 18. تم تحديد أي حد العلوي مع النتائج الإيجابية التي تحققت وبما يصل إلى أعلى تركيز (100،000 نسخة الجينوم) 18.

التطبيق مع العينات الميدانية

العينات التي تم جمعها للاختبار الأيمرية من المرجح أن تكون مستمدة من الدجاج عثر عليه ميتا، أعدمت نتيجة لصOOR الصحية أو أعدمت للمراقبة الصحية الخافرة، مما يدل على أن من المرجح حجم العينة من بين واحد وثلاثة عندما جزءا من روتين. اختبار ثلاثة طيور التي تم جمعها من مزرعة الدجاج اللاحم الولايات المتحدة كجزء من برنامج المراقبة أسفرت عن ثلاث مجموعات من عينات الأمعاء. تستهدف تطبيق أنواع محددة المقايسات LAMP، إعطاء الأولوية لمواقع المعوية المفضلة لكل نوع الأيمرية (الجدول 1)، يسمح التعرف البصري للعدوى eimerian في جميع الطيور اختبارها باستخدام hydroxynaphthol الأزرق كمؤشر (الشكل 2A). لون يتحقق مع رد فعل سلبي LAMP عند استخدام hydroxynaphthol الأزرق يمكن أن تتراوح من البنفسجي إلى الوردي، ولكن هو دائما متميزة من اللون الأزرق من قبل نتيجة الإيجابية التي تحققت. تأكيد الاغاروز الكهربائي للهلام قدمت نتائج مماثلة (الشكل 2B). خلال التطبيق الميداني قد يختار المستخدم لتطبيق كامل الشاشة ضد جميع الأنواع السبعة، أو تستهدف فقط تلك الأنواع ذات الأولوية كماأهمية أو المعروف أن تعميم في المزرعة أو المنطقة المحيطة بها.

فشل النهج القائمة على PCR لأصبح راسخا باعتباره التشخيص لحدوث الأيمرية يشدد على الحاجة إلى البساطة في أي اختبار جديد. في حين LAMP يقدم إعداد بساطة ومعالجة من PCR، واشتراط اختبار المواقع المعوية متعددة لكل الطيور لا يزال غير مشجع. إنتاج عينة DNA المجمعة واحدة لكل الطيور، ومن ثم يمكن اختبار مع واحد أو أكثر من المقايسات LAMP، ومن المرجح أن يكون أكثر جاذبية. تجهيز العينات المجمعة واحد لكل الطيور، وتمثل المواد التي تم جمعها من كل موقع من المواقع المعوية محددة وصفها في الجدول 1 والمجمعة قبل إعداد DNA، للاختبار مع جميع المقايسات LAMP سبعة شريطة نفس النتيجة كما هو الحال عندما تم معالجتها كل موقع على حدة الأمعاء (الشكل 2 مقارنة مع الشكل 3).

figure-results-1
الشكل 1. مواقع أخذ العينات المعوية للكشف LAMP من الطفيليات التي تصيب الأنواع الأيمرية الدجاج. ومن أبرز المناطق المعوية مستهدفة من قبل كل الأنواع الأيمرية من قبل خطوط ملونة، مع المواقع المفضلة لأخذ العينات المشار إليها بواسطة رقم بين خطوط سوداء منقطة (E. acervulina: أصفر / 1، E. برونيتي: الوردي / 2، E. ماكسيما: أزرق / 3، E. هين: البرتقال / 4، E. الفاتكة: أحمر / 5، E. مبتسر: الأخضر / 6 و E. الرهيفة: الرمادي / 7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. LAMP تشخيص العدوى eimerian جيئة وذهابام ثلاث الدجاج اللاحم التجارية. ردود الفعل LAMP حلها باستخدام (A) hydroxynaphthol الزرقاء، حيث كان رد فعل السماء الزرقاء إيجابي وكان البنفسجي إلى رد فعل سلبي الوردي، و (ب) الاغاروز الكهربائي للهلام. المواقع المعوية عينات كما عرضت في الجدول 1 لكل أنواع الطفيليات. A = E. acervulina، B = E. برونيتي، ما = E. ماكسيما، مي = E. هين، N = E. الفاتكة، P = E. مبتسر وT = E. الرهيفة. حارة 1 يرد سلم GeneRuler 1KB DNA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. LAMP تشخيص العدوى eimerian باستخدام العينات المجمعة من ثلاث الدجاج اللاحم تجارية منفصلة. REAC LAMPحل ستعقد باستخدام الأزرق hydroxynaphthol، حيث كان رد فعل السماء الزرقاء إيجابي وكان البنفسجي إلى رد فعل سلبي الوردي. A = E. acervulina، B = E. برونيتي، ما = E. ماكسيما، مي = E. هين، N = E. الفاتكة، P = E. مبتسر وT = E. الرهيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

موقع نموذج فحص الأنواع الأيمرية (على الأرجح)
العفج (D) E. acervulina، E. مبتسر
الصائم / الدقاق * (J / I) E. ماكسيما، E. الفاتكة
Caeca (C) E. الفاتكة، E. الرهيفة
محطة الدقاق (TI) E. برونيتي، E. هين
عينة المجمعة (P) E. acervulina، E. برونيتي، E. ماكسيما، E. هين، E. الفاتكة، E. مبتسر، E. الرهيفة

الجدول 1. المعوية منطقة معينة مختارة من المقايسات الأنواع مرشح الأيمرية. إن اختيار المنطقة لأخذ عينات يختلف عن كل نوع من الأنواع الأيمرية كما هو موضح في الشكل (1). وتشمل العينات المجمعة المواد التي تم جمعها من جميع مواقع محددة الأربعة التي تم بعد ذلك جنبا إلى جنب من أجل إعداد DNA.

التمهيدي * تركيز الأسهم (ميكرومتر) الحجم (ميكرولتر)
ماء - 60
إلى الأمام التمهيدي الداخلية (FIP) 100 40
متخلف الحزب الثوري المؤسسي الداخليةمير (BIP) 100 40
إلى الأمام الخارجي التمهيدي (F3) 100 10
متخلف التمهيدي الخارجي (B3) 100 10
حلقة الأمام (LF) 100 20
حلقة الخلف (LB) 100 20
مجموع 200

الجدول 2. إعداد الخلطة الجاهزة LAMP التمهيدي. المكونات والنسب المطلوبة لإعداد الخلطة الجاهزة التمهيدي لLAMP. كميات المعروضة هي 100 ردود الفعل LAMP. * الهويات التمهيدي كما هو مبين في المواد وBarkway وآخرون (2011) 18.

الأسهم اضرب ن رد الفعل النهائي اضرب ن حجم في رد الفعل (ميكرولتر)
أحواض دبي الجافة العالمية - - 10.1
عازلة ThermoPol 10 × 1 × 2.5
MgSO 4 100 ملي 2 مم 0.5
مزيج التمهيدي * الجدول 2 2.5
dNTPs 25 ملي 400 أوقية 0.4
البيتين 5 M 1 M 5
Hydroxynaphthol الأزرق 3 مم 120 ميكرومتر 1
BST DNA بوليميريز 8،000 U / مل 8 U 1
مجموع 23

الجدول 3. إعداد LAMmastermix رد فعل P. * الأيمرية أنواع محددة.

المناقشة

تقدم فحوصات LAMP الخاصة بأنواع Eimeria الموضحة في هذه الورقة مجموعة أدوات تشخيصية جديدة لدعم المكافحة الفعالة للكوكسيديا ومرض الكوكسيديا. يمكن أن تشمل نتائج عدوى الايمرية خسارة اقتصادية جسيمة بالإضافة إلى تعريض رفاهية الطيور للخطر بشكل خطير وزيادة التعرض للاستعمار من قبل مسببات الأمراض الحيوانية المنشأ21. يمكن أن توفر فرص مراقبة القطعان بحثا عن وجود بعض أنواع Eimeria أو جميعها إنذارا مبكرا بانهيار فعالية مكافحة مضادات الكوكسيد. تشمل المزايا الرئيسية ل LAMP خصوصية الهدف القوية ، الناتجة عن الحاجة إلى ستة أهداف مختلفة لتسلسل الحمض النووي ، بالإضافة إلى الحساسية العالية ، المعززة بإدراج بادئات الحلقة13 ، على الرغم من أن الطبيعة النوعية وليست الكمية ل LAMP يمكن اعتبارها قيدا. لا يمكن حاليا التمييز بين هروب الطفيليات منخفضة المستوى من الوقاية الكيميائية الروتينية أو تكرار اللقاح الحي من التكاثر الإيمري غير الخاضع للرادع. ومع ذلك ، فإن السهولة التقنية للبروتوكول والقراءة النهائية تقدم تحسنا كبيرا مقارنة بالمناهج المتخصصة الحالية والذاتية في كثير من الأحيان التي تقودها علم الأمراضوالتشكل 6،7. يمكن إكمال كل فحص بتكلفة ~ 0.75 جنيه إسترليني لكل عينة ، بغض النظر عن نفقات إعداد العمالة والمعدات. وبالتالي ، فإن فحوصات LAMP هي أيضا أكثر فعالية من حيث التكلفة من التشخيصات الجزيئية الأخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لأنها تتطلب حضانة متساوية الحرارة دون الحاجة إلى معدات متخصصة.

لسنوات عديدة ، أدى الوصول إلى الحمض النووي الجيني Eimeria كقالب إلى الحد من تطوير وتطبيق تشخيصات المجال الجزيئي. الكيسة هي المرحلة الأكثر سهولة في دورة الحياة العيمرية ، لكن استخراج الحمض النووي الروتيني يتطلب مرافق مختبرية22. تتطلب مراحل دورة حياة الأمعاء الأخرى الأكثر ثباتا تنقية قبل تحضير الحمض النووي لمنع تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل وما يترتب على ذلك من فقدان الحساسية23،24. إن القدرة على استخراج الحمض النووي الايميري بجودة مناسبة ل LAMP باستخدام معدات ليست أكثر تخصصا من جهاز الطرد المركزي الدقيق والحمام المائي ، مع استكمال امتصاص المثبط باستخدام راتنج الشيلكس ، تعزز الآن الاستخدام الأوسع للبيولوجيا الجزيئية في التشخيص العيمري. ومن المثير للاهتمام أن الكشف المبلغ عنه عن الحمض النووي Eimeria الكمي القابل للقياس بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنسجة الأمعاء بعد 20 يوما من بدء عدوى الطفيليات ، بعد 11 يوما من آخر ناتج بويضة يمكن اكتشافه ، يثير اقتراحا بأنه يمكن استخدام LAMP للكشف عن التعرض للطفيليات التي تم حلها بالإضافة إلى العدوى المستمرة ، حتى بعد حل أي آفات مرئية25.

ويمكن أن تعزز التكلفة المنخفضة نسبيا والمتطلبات التقنية المنخفضة لتشخيص LAMP Eimeria تطبيقها في العالم النامي حيث قد لا تكون النهج الأخرى الأكثر رسوخا متاحة أو مناسبة. لكي يكون هذا قابلا للتطبيق ، يجب أن يكون كل اختبار قادرا على اكتشاف جميع السلالات التي قد تكون متداولة داخل كل منطقة. في حين أن فهم التنوع الجيني السائد بين أنواع Eimeria محدود26 ، فإن استخدام التسلسلات المستهدفة التي تم التحقق من صحتها مسبقا للاستخدام في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع سلالات من إفريقيا وآسيا وأوروبا وأمريكا الجنوبية يوفر بعض الأدلة على الحفظ ، مما يدعم فائدة فحوصات LAMP هذه حول العالم10.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم العمل المنجز في هذه الدراسة جزئيا من قبل الكلية الملكية البيطرية من خلال صندوق مشاريع أبحاث الطلاب ، بالإضافة إلى مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية ووزارة التنمية الدولية (المنحة رقم BB / H009337/2). تم تعيين PPB_00795 مرجعي لهذه المخطوطة من قبل RVC.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RNAlaterAmbionAM7024
الإيثانولVWR Chemicals20821.321تحذير ، شديد الاشتعال
100 × Tris-EDTA (TE) مركز عازلةSigma-AldrichT9285
Chelex 100 راتنجBio-Rad142-1253
مائي من الدرجة الجزيئيةInvitrogen10977035
E. acervulina F3سيجما ألدريتشVC00021* CCTAACATTTCGCTTCACGGAC
E. acervulina B3سيجما ألدريتشVC00021* ATGAGCAAGTGGAACACCTTG
E. acervulina FIPسيجما ألدريتشVC00021* AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGAGCATGGCTTACCT
E. acervulina BIPSigma-AldrichVC00021* GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG
E. acervulina LBسيجما ألدريتشVC00021* TAAGGTTACACCCGTGGAGG
E. acervulina LFسيجما ألدريتشVC00021* GCCATGCACAAAGCGACTT
E. brunetti F3Sigma-AldrichVC00021* GGCCATCAAGTTCCATGAGC
E. brunetti B3Sigma-AldrichVC00021* TCAACCTCCTGAGTGTGGTT
E. brunetti FIPSigma-AldrichVC00021* GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGACCGTCTT
E. brunetti BIPSigma-AldrichVC00021* TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCCCTC
E. brunetti LBSigma-AldrichVC00021* GAAACGCTCGAACATGGC
E. brunetti LFSigma-AldrichVC00021* CTTCTCCACACACCCAGAGGT
E. maxima F3Sigma-AldrichVC00021* ACTACGGAAAAGTGCTAGCT
E. maxima B3Sigma-AldrichVC00021* CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG
E. maxima FIPSigma-AldrichVC00021* GAGTCACTGCTGATGTACCAAAa
AG-GAACTATGCCGCTCCCCTG
E. maxima BIPSigma-AldrichVC00021* AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA
E. maxima LBSigma-AldrichVC00021* CAAGCCTACGCGGACATC
E. maxima LFSigma-AldrichVC00021* TTATGCAGCTGGGTCAACG
E. mitis F3Sigma-AldrichVC00021* ACGATAGCCAAGACACGTAAGG
E. mitis B3Sigma-AldrichVC00021* CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA
E. mitis FIPSigma-AldrichVC00021* CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT
AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT
E. mitis BIPSigma-AldrichVC00021* GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA
GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGAGG
E. mitis LBSigma-AldrichVC00021* TCCATGCATCCCCTTGTT
E. mitis LFSigma-AldrichVC00021* CGTGGGCACAGATTGATTC
E. necatrix F3Sigma-AldrichVC00021* TGGCTTTCCCGCGTACC
E. necatrix B3سيجما ألدريتشVC00021* CGGCCCAACACAAAGACTG
E. necatrix FIPسيجما ألدريتشVC00021* CGCTTGAGTTTTTTAAGCTATGCA
CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA
E. necatrix BIPSigma-AldrichVC00021* CGCCATGCCATTCAATGAACG- * GAGGCATACCGGCGTTGTC
E. necatrix LBSigma-AldrichVC00021* GTCTGTAACTTGGGGACGTTGT
E. necatrix LFسيجما ألدريتشVC00021* GAACAGCCGGAGCCTCTC
E. praecox F3سيجما ألدريتشVC00021* GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT
E. praecox B3سيجما ألدريتشVC00021* GCGCACGAATCTGAATCACAC
E. praecox FIPسيجما ألدريتشVC00021* ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT
A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG
E. PRAECOX BIPSigma-AldrichVC00021* GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT
E. praecox LBSigma-AldrichVC00021* GAATAGCATTGCCAGGTGG
E. praecox LFSigma-AldrichVC00021* GTCCACTGTCATTAATTATTGC
TGC
E. tenella F3Sigma-AldrichVC00021* GCTTGTGAAGGTCAGCGTG
E. tenella B3Sigma-AldrichVC00021* GCTGAGTCCATACGTACTTCCT
E. tenella FIPSigma-AldrichVC00021* GCCACTGCTATGGAAAGTCAC
AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT
E. tenella BIPSigma-AldrichVC00021* GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA
GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT
E. tenella LBSigma-AldrichVC00021* CGCATGTGCAGTTGAAGACA
E. tenella LFSigma-AldrichVC00021* CCAAATGTATCTGCTAGTTATA
TTAACAAG
10 × ThermoPol تفاعل عازلةنيو إنجلاند BiolabsB9004S
MgSO4< / sub>Sigma-AldrichM7506
dNTPsPromegaU1330
محلول البيتين (5 م)Sigma-AldrichB0300
Bst polymeraseNew England BiolabsM0275S
هيدروكسي نافثول أزرقسيجما ألدريتش33936مذاب في ماء من الدرجة الجزيئية.
UltraPure agaroseInvitrogen16500-500
10 × Tris / Borate / EDTA (TBE) BufferInvitrogenAM9863
صبغة تحميل الحمض النووي الأزرق / البرتقالي (x6)PromegaG1881
GeneRuler 1Kb سلم الحمض النوويThermo ScientificSM0313
SafeView صبغة الحمضNBS BiologicalsNBS-SV
النووي

المراجع

  1. Chapman, H. D., et al. A selective review of advances in coccidiosis research. Adv Parasitol. 83, 93-171 (2013).
  2. Shirley, M. W., Smith, A. L., Tomley, F. M. The biology of avian Eimeria with an emphasis on their control by vaccination. Adv Parasitol. 60, 285-330 (2005).
  3. Fornace, K. M., et al. Occurrence of Eimeria species parasites on small-scale commercial chicken farms in Africa and indication of economic profitability. PLoS ONE. 8 (12), e84254(2013).
  4. Schwarz, R. S., Jenkins, M. C., Klopp, S., Miska, K. B. Genomic analysis of Eimeria spp. populations in relation to performance levels of broiler chicken farms in Arkansas and North Carolina. J Parasitol. 95 (4), 871-880 (2009).
  5. Peek, H. W., Landman, W. J. Coccidiosis in poultry: anticoccidial products, vaccines and other prevention strategies. Vet Q. 31 (3), 143-161 (2011).
  6. Johnson, J., Reid, W. M. Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens. Exp Parasitol. 28 (1), 30-36 (1970).
  7. Haug, A., Gjevre, A. G., Skjerve, E., Kaldhusdal, M. A survey of the economic impact of subclinical Eimeria infections in broiler chickens in Norway. Avian Pathol. 37 (3), 333-341 (2008).
  8. Procunier, J., Fernando, M., Barta, J. Species and strain differentiation of Eimeria spp. of the domestic fowl using DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers. Parasitology Research. 79 (2), 98-102 (1993).
  9. Schnitzler, B. E., Thebo, P. L., Mattsson, J. G., Tomley, F. M., Shirley, M. W. Development of a diagnostic PCR assay for the detection and discrimination of four pathogenic Eimeria species of the chicken. Avian Pathol. 27 (5), 490-497 (1998).
  10. Vrba, V., Blake, D. P., Poplstein, M. Quantitative real-time PCR assays for detection and quantification of all seven Eimeria species that infect the chicken. Vet Parasitol. 174 (3-4), 183-190 (2010).
  11. Morris, G. M., Gasser, R. B. Biotechnological advances in the diagnosis of avian coccidiosis and the analysis of genetic variation in Eimeria. Biotechnol Adv. 24 (6), 590-603 (2006).
  12. Perry, B., Randolph, T., McDermott, J., Sones, K., Thornton, P. Investing in animal health research to alleviate poverty. , ILRI (International Livestock Research Institute). Nairobi, Kenya. (2002).
  13. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers). Mol Cell Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  14. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), E63(2000).
  15. Kaneko, I., et al. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples by using molecular methods. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7526-7532 (2011).
  16. Karanis, P., et al. Development and preliminary evaluation of a loop-mediated isothermal amplification procedure for sensitive detection of cryptosporidium oocysts in fecal and water samples. Appl Environ Microbiol. 73 (17), 5660-5662 (2007).
  17. Xue, C., et al. Rapid detection of Infectious bursal disease virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. J Vet Diagn Invest. 21 (6), 841-843 (2009).
  18. Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. BMC Vet Res. 7 (1), 67(2011).
  19. Long, P., Joyner, L., Millard, B., Norton, C. A guide to laboratory techniques used in the study and diagnosis of avian coccidiosis. Folia Veterinaria Latina. 6 (3), 201-217 (1976).
  20. Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. BioTechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
  21. Arakawa, A., Baba, E., Fukata, T. Eimeria tenella infection enhances Salmonella typhimurium infection in chickens. Poult Sci. 60 (10), 2203-2209 (1981).
  22. Blake, D. P., Smith, A. L., Shirley, M. W. Amplified fragment length polymorphism analyses of Eimeria spp.: an improved process for genetic studies of recombinant parasites. Parasitol Res. 90 (6), 473-475 (2003).
  23. Lund, M., Nordentoft, S., Pedersen, K., Madsen, M. Detection of Campylobacter spp. in chicken fecal samples by real-time PCR. J Clin Microbiol. 42 (11), 5125-5132 (2004).
  24. Raj, G. D., et al. Real-time PCR-based quantification of Eimeria genomes: a method to outweigh underestimation of genome numbers due to PCR inhibition. Avian Pathol. 42 (4), 304-308 (2013).
  25. Blake, D. P., Hesketh, P., Archer, A., Shirley, M. W., Smith, A. L. Eimeria maxima: the influence of host genotype on parasite reproduction as revealed by quantitative real-time PCR. Int J Parasitol. 36 (1), 97-105 (2006).
  26. Beck, H. P., et al. Molecular approaches to diversity of populations of apicomplexan parasites. Int J Parasitol. 39 (2), 175-189 (2009).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Eimeria DNA

مقالات ذات صلة