يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل ومسمار سفن الهندسة الأنسجة في نموذج الفأر

11.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52565

⸱

مارس 18, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Division, King's College London BHF Centre

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكول لتوليد الأنسجة المهندسة ترقيع الأوعية التي هي وظيفية للتطعيم في الفئران عن طريق بذر المزدوج الناجم جزئيا الخلايا الجذعية المحفزة (PiPSC) - المشتقة خلايا العضلات الملساء وPiPSC - الخلايا البطانية مشتقة على decellularized سفينة سقالة مفاعل حيوي.

الملخص

يعد بناء قنوات الأوعية الدموية استراتيجية أساسية للإصلاح الجراحي للأوعية التالفة والمصابة الناتجة عن أمراض القلب والأوعية الدموية. يقدم البروتوكول الحالي استراتيجية فعالة وقابلة للتكرار يمكن من خلالها إنشاء ترقيع الأوعية الدموية المصممة للأنسجة الوظيفية باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة جزئيا (PiPSC) من الخلايا الليفية البشرية. لقد صممنا مفاعلا حيويا لسقالة الأوعية الدموية منزوعة الخلايا ، والذي يحاكي عن كثب بنية بروتين المصفوفة وتدفق الدم الموجود داخل وعاء أصلي ، لبذر الخلايا البطانية PiPSC أو خلايا العضلات الملساء قبل التطعيم في الفئران. ثبت أن هذا النهج مفيد لأن الفئران التي تعاني من نقص المناعة المطعمة بالطعوم المشتقة من PiPSC قدمت مع زيادة ملحوظة في معدل البقاء على قيد الحياة بعد 3 أسابيع من الجراحة. يمثل هذا البروتوكول أداة قيمة للطب التجديدي وهندسة الأنسجة والعلاج الخلوي المحتمل للمريض في المستقبل القريب.

المقدمة

بناء قنوات الأوعية الدموية هي استراتيجية أساسية للإصلاح الجراحي للتلف وإصابة الأوعية الناتجة عن أمراض القلب والأوعية الدموية. حتى الآن، والمواد الكسب غير المشروع المستخدمة في الجراحة وتشمل حيويا البوليمرات الاصطناعية (تترافلوروإيثيلين [تفلون]، وسعت تترافلوروإيثيلين [EPTFE، غور تكس] أو البولي ايثلين [الداكرون])، المغايرة، الأنسجة ذاتي (التامور أو الوريد الصافن) وxenografts 1. في حين الطعوم الاصطناعية (على سبيل المثال، غور تكس والداكرون) هي الأكثر شيوعا، وهذه المواد المحتمل أن يسبب العديد من المضاعفات على المدى القصير والمدى الطويل التي تشمل تضيق، ترسب الكالسيوم وخثرات الانصمام والالتهابات. على الرغم من أن المرضى الذين يعانون من الطعوم البيولوجية الحالية مع تراجع أحداث خثرات صمية، فإنها لا تزال تواجه القيود مثل فشل الكسب غير المشروع الثانوي والمتانة تقصير بسبب تدهور تكلس 2. لذلك، على الرغم من التحسينات الكبيرة في تي الجراحيةلا تزال مثقلة echniques على مر السنين، والباحثين والأطباء مع ضرورة تحديد قناة مثالية لأمراض الأوعية الدموية. وفي الآونة الأخيرة، وقد ولدت مجال أبحاث هندسة الأنسجة الوعائية مفهوم التي تدرج بها الخلايا في السقالات القابلة للتحلل، وذلك بهدف خلق بيئة بيوميمتيك التي تجسد سفينة الوظيفية لنجاح تطعيم 1. في الأساس، فإن نجاح يبني الأوعية الدموية يعتمد على ثلاثة عناصر أساسية. الخلايا التي تتكون من سقالة، أي طبقة داخلية خلية البطانية وطبقة الخلايا العضلية الملساء، سقالة تحتوي على المصفوفة خارج الخلية المناسبة لتوفير الخصائص الميكانيكية مماثلة لالأوعية الدموية الأصلي، والإشارات الجزيئية / الخلوي ما هو مطلوب لبدء / تنظيم إصلاح.

طويلة المدى المباح الكسب غير المشروع والتنمية المستدامة للأنسجة الجدد تعتمد اعتمادا كبيرا على بذر خلية فعالة السقالات، عشرereby تقديم قرار نوع من الخلايا ذات أهمية حاسمة. وتظهر عدة تقارير استخدام البطانية ناضجة وخلايا العضلات الملساء من مصادر مختلفة لتطوير قنوات صغيرة قطرها 3-6. وعلى الرغم من واعدة، وعدم وجود السفن ذاتي كافية للحصول تبقى البطانية ناضجة وخلايا العضلات الملساء عبئا كبيرا. وفي الآونة الأخيرة، تم استغلال الخلايا الجذعية من مصادر مختلفة لتطبيقات هندسة الأنسجة الوعائية. خلايا وحيدات النوى في الواقع، ومجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الجذعية بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية 7، الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) 8،9، PiPSC 10،11، والمستمدة نخاع العظم 12، الخلايا الجذعية الوسيطة 13، الخلايا الاصلية البطانية وجدار الوعاء الدموي الكبار -derived الخلايا الجذعية مستضد 1 (SCA-1) + الخلايا الجذعية / السلف كلها قد أثبتت 14،15 لتكون قادرة على التمايز إلى خلايا إما البطانية وظيفية أو العضلات الملساء ردا على وسائل الاعلام محددة وشروط الثقافة. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة تجديد الذات غير محدودة من الخلايا الجذعية جعلها المرشحين الأفضل على عكس البطانية ناضجة وخلايا العضلات الملساء التي يمكن أن يقسم إلا لعدد محدود من المرات قبل ان يخضع لاعتقال النمو والشيخوخة.

اختيار المواد سقالة لتوليد الأنسجة ناجحة سفينة هندسيا للتطعيم يعتمد على عدة عوامل مثل توافق مع الحياة، خصائص النشاط الحيوي، ومعدل التحلل البيولوجي. في الأساس، والمواد المستخدمة في إنشاء السقالات لترقيع يجب أن تكون قابلة للتحلل ولن جبل المتلقي لزوم لها الاستجابات المناعية. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تشمل المسامية مناسبة والمجهرية لمرفق الخلية والبقاء على قيد الحياة لاحق. حتى الآن، والمواد الأكثر شيوعا لالسقالات في هندسة الأنسجة الوعائية وتشمل البوليمرات من حمض polyglycolic، عديد حمض اللبنيك، وبولي ε-caprolactone 16. وفي الآونة الأخيرة، المواد البيولوجية decellularized لهاكما تم تطبيقه مع بعض النجاح. وقد أظهرت العديد من المختبرات التي البذر السفن الخنازير البشرية decellularized، والكلاب أو مع خلايا ذاتي قدمت الكسب غير المشروع البيولوجي التي قاومت تخثر وباطنة تضخم 17-19. وتشمل الاستراتيجيات الأخرى في هندسة الأنسجة الوعائية خارج الخلية ترقيع الأوعية الدموية القائمة على البروتينات المصفوفة على سبيل المثال، بذر الخلايا في الليفين هلام 13 وأوراق خلية توليد دون دعم سقالة 20 و 21.

يوضح البروتوكول الحالي تمايز PiPSC الإنسان في البطانية الوظيفية وخلايا العضلات الملساء، وتوليد مفاعل حيوي يتكون من سقالة سفينة decellularized لإيواء خلايا الأوعية الدموية PiPSC المشتقة وظيفية، وترقيع الأوعية الأنسجة المهندسة إلى نقص المناعة الشديد مجتمعة (SCID ) الفئران. PiPSC تشكل نوع من الخلايا الأمثل لاستخدامها لهندسة الأنسجة الطعوم السفينة لأن هذه الخلايا لا تشكل الأورام في الفئران أو رفع الأخلاقي وردود ألو-المناعية. وعلاوة على ذلك، لقد أظهرنا أن استراتيجية لتوليد بالنقاط، البطانية الخلايا ونقطة على نحو سلس خلايا العضلات هي فعالة وقابلة للتكرار 10،11. بعد ذلك، قمنا بتصميم سفينة decellularized لزرع البذور من خلايا الأوعية الدموية PiPSC المشتقة من لتقليد بشكل وثيق البروتينات المصفوفة موجود داخل سفينة الأم، وبالتالي تعزيز التطعيم وبقاء فعالية. وعلاوة على ذلك، فإن decellularization من السفن قبل PiPSC البذر يمنع وقوع الاستجابات الالتهابية التي شنت من قبل أنواع الخلايا المناعية مثل الضامة. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول لا تمثل سوى منهجية لتوليد واعدة قنوات الأوعية الدموية للترجمة إلى البشر، ولكنها توفر أيضا وسيلة قيمة لدراسة وفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في تجديد الأنسجة الوعائية من خلال نماذج الماوس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أداء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكولات وافقت عليها اللجنة المؤسسية لاستخدام ورعاية الحيوانات المختبرية.

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام

  1. جعل وسائل الإعلام ثقافة لخط الخلية الليفية البشري CCL-153: F-12K متوسطة، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 100 U / البنسلين مل والستربتومايسين.
  2. جعل إعادة برمجة وسائل الإعلام لتوليد PiPSC: النسر خروج المغلوب Dulbecco لتعديل متوسطة (DMEM) تحتوي على 20٪ استبدال خروج المغلوب المصل، 0.1 ملم β المركابتويثانول، 0.1 ملي الدنيا الأساسية المتوسطة (MEM) الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 10 نانوغرام / عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية مل 2 (bFGF-2) و 100 U / البنسلين مل والستربتومايسين. إضافة bFGF-2 حديثا في كل مرة قبل استخدام وسائل الإعلام.
  3. جعل التمايز وسائل الإعلام (DM) للحث على خلية العضلات الملساء (SMC) التمايز: α-MEM وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FBS عامل نمو، 0.1 ملم β المركابتويثانول، و 100 U / مل البنسلين والستربتومايسين و 25 نانوغرام / مل صفائح الدم المشتقة(PDGF-ββ).
  4. جعل غشائي التمايز وسائل الإعلام (EC-DM) للحث الخلايا البطانية (EC) التمايز: نمو بطانة الإعلام-2 (EGM-2) وسائل الإعلام التي تحتوي على 50 نانوغرام / مل الأوعية الدموية غشائي عامل النمو (VEGF)، و 100 U / البنسلين مل والستربتومايسين.

2. إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان إلى الناجمة جزئيا الخلايا الجذعية المحفزة (PiPSC)

  1. ثقافة خط الخلية الليفية البشري CCL-153 على 0.04٪ من محلول الجيلاتين قوارير المغلفة في مستنبت.
  2. خلايا مرور كل 3 أيام في نسبة 1: 6. استخدام الخلايا قبل مرور 9 لالكفاءة المثلى من الجيل PiPSC. الخلايا جاهزة للترنسفكأيشن عند بلوغه 80-90٪ confluency.
  3. خطي متعدد المقارين pCAG2LMKOSimO البلازميد التي تحتوي على 4 عوامل إعادة برمجة-octamer ملزمة النسخ عامل 4 (OCT4)، SOX2، عامل Kruppel شبيهة 4 (KLF4) وC-MYC (pCAG-OSKM). هضم 5 ميكروغرام البلازميد مع 5 وحدات من PvuI انزيم التقييد لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية. طهرالبلازميد مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  4. بالنقل 2 × 10 6 الخلايا الليفية الإنسان مع 4 ميكروغرام من خطي pCAG-OSKM البلازميد التي كتبها Electroporation للمع مجموعة الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (NHDF) nucleofection وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. بلطف البذور الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل على ما قبل 0.04٪ الجيلاتين المغلفة T25 قارورة تحتوي على 5 مل من قبل تحسنت إعادة برمجة وسائل الإعلام.
  5. بعد 24 ساعة، وتغيير المتوسطة مع المكملات الغذائية من 25 ميكروغرام / مل النيوميسين لتحديد السكان نقية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.
  6. تغيير المتوسطة كل يوم حتى يوم 4.
    ملاحظة: الخلايا الليفية الإنسان أن تصبح PiPSC بعد 4 أيام من إعادة برمجة.

3. تمايز PiPSC إلى غشائي وخلايا العضلات الملساء

  1. PiPSC البذور على أطباق المغلفة قبل الكولاجين IV تحتوي DM لمدة 4 أيام للحث على التمايز إلى SMCS. تغيير المتوسطة كل يوم حتى يوم 4.
  2. PiPSC البذور على الكولاجين IV-المغلفة قبل أطباق جontaining البطانية-DM لمدة 6 أيام للحث على التمايز في الخلايا البطانية. تغيير المتوسطة كل يوم حتى يوم 6.

4. Decellularized الأبهر الكسب غير المشروع التحضير

ملاحظة: ينبغي لجميع الحلول والمعدات يكون معقم.

  1. التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم وإصلاح الماوس في موقف ضعيف تحت المجهر تشريح.
  2. قطع طريق القص وحول القفص الصدري لفتح التجويف الصدري. إزالة القلب والرئتين والمريء لفضح الشريان الأورطي. بلطف إزالة الدهون شبه الشريان الأورطي بالملقط.
  3. قطع الشريان الأورطي من نهاية الأمامي مع مقص وعقد بلطف نهاية بالملقط حادة. فصل الشريان الأورطي من العمود الفقري وراء من قبل تشريح حادة. إغلاق بعناية جميع الشرايين المتفرعة من الشريان الأورطي عن طريق ربط مع electrocoagulator القطبين وقطع من النهاية البعيدة للربط مع مقص.
  4. استخدام حقنة 5 مل لطرد لمعة الشريان الأورطي مع 3 ملتر من محلول ملحي يحتوي على 100 U الهيبارين لمنع تشكيل جلطات الدم.
  5. قطع نهاية الخلفي من الشريان الأورطي قبل أن فروع في الكلى. الحفاظ على سلامة الشريان الأورطي من المهم جدا خلال الإجراء بأكمله.
  6. مسح التجويف الشريان الأورطي مع 5 مل من 0.075٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) محلول مخفف في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  7. نقع الأبهر الصدري في 0.075٪ SDS الحل في 10 سم طبق بتري. وضع طبق بتري على شاكر المداري لمدة 2 ساعة على 150 دورة في الدقيقة في RT.
  8. مسح التجويف الشريان الأورطي مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  9. نقع الشريان الأورطي في برنامج تلفزيوني في 10 سم طبق بتري. وضع طبق بتري على شاكر المداري لمدة 2 ساعة على 150 دورة في الدقيقة في RT. تحديث PBS كل 20 دقيقة.
  10. مسح التجويف الشريان الأورطي مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  11. الحفاظ decellularized الكسب غير المشروع الشريان الأورطي في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى واحد.

5. المزدوج البذر من PiPSC وتكييف مفاعل حيوي

ملاحظة: جميع حليجب أن تكون الصورة والمعدات المعقمة. أداء جميع العمليات في نسيج الثقافة هود.

  1. تجميع الدوائر تدفق مفاعل حيوي كما هو موضح في الشكل رقم 1. قم بتوصيل غرفة الحضانة، خزان سائل الإعلام، مضخة تحوي غرفة والامتثال الأنابيب. حجم الحد الأدنى من المتوسط ​​اللازمة للتداول هو 40 مل.
  2. الشرط المسبق السفينة decellularized مع الثقافة المتوسطة عن طريق نقع الشريان الأورطي في DM المتوسطة في 10 سم طبق بتري. وضع طبق بتري على شاكر المداري لمدة 1 ساعة على 50 دورة في الدقيقة في RT.
  3. تضاف 1 سم طول أنابيب نايلون (OD 0.9 ملم، ID 0.75 مم) في كلا طرفي السفينة decellularized تحت المجهر. ربط السفينة وأنابيب مع 8-0 خيوط الحرير.
  4. تجميع الكسب غير المشروع الشريان الأورطي decellularized في غرفة الحضانة من خلال ربط أنابيب نايلون مع مدخل ومخرج الموانئ (1/32 "أنابيب) من جدار الغرفة. الحفاظ على غرفة الحضانة مع 5mls من المتوسط ​​في كل مرة.
  5. يعرض للتريبسين PiPSC بإضافة قبل حرارةالتربسين لتغطية الطبق الثقافة وصخرة بلطف الطبق 10 مرات. تجاهل التربسين وترك الطبق في الحاضنة لمدة 2-3 دقيقة. إضافة قبل تحسنت مستنبت في طبق وتخلط المتوسطة مع الخلايا.
  6. عد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. الطرد المركزي اثنين aliquots من تعليق خلية تحتوي على 5 × 10 5 خلايا لكل لمدة 5 دقائق في 300 × ز. نضح طاف تماما.
  7. بعد الشفط طاف تماما، و resuspend 1 بيليه من نقطة الكريات الخلايا في 50 ميكرولتر من DM. حقن هذا تعليق خلية في التجويف سفينة decellularized.
  8. ثم، و resuspend الآخرين بيليه الخلية نقطة في 100 ميكرولتر من Matrigel. ماصة بعناية الخليط على الشريان الأورطي الكسب غير المشروع decellularized.
  9. الانتظار لمدة 10 - 15 دقيقة حتى يتحول الخليط إلى دولة مثل هلام وبشكل متساو يلتف حول السطح الخارجي السفينة. ملء غرفة الحضانة مع DM.
  10. وضع مفاعل حيوي كله وضع في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. تدوير يدويا الكسب غير المشروع decellularized 90 درجة حول المحور الطولي كل نصف ساعة في ساعة 2 الأولى.
  11. حافظ على ثقافة ثابتة لمدة 12 ساعة لتمكين التصاق الخلية.
  12. تقديم DM من خلال التجويف بواسطة مضخة تحوي للحث على نحو سلس تمايز الخلايا العضلية. بدء معدل التدفق الأولي في 5 مل / دقيقة وزيادة تدريجية إلى 20 مل / دقيقة أكثر من 24 ساعة.
  13. الحفاظ على معدل التدفق المتوسط ​​المتداولة في 20 مل / دقيقة لمدة 24 ساعة.
  14. وقف تدفق المتوسط ​​ونقل مفاعل حيوي يحدد من الحاضنة.
  15. إعادة البذور لمعة من الكسب غير المشروع مع PiPSC. يعرض للتريبسين، عد وأجهزة الطرد المركزي 1 × 10 6 PiPSC كما في الخطوات 5،5-5،6. resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من EGM-2 المتوسط ​​تحتوي على 50 نانوغرام / مل VEGF. حقن الخليط خلية في التجويف من الكسب غير المشروع.
  16. تغيير المتوسطة في غرفة الحضانة والدورة الدموية كله لEGM-2 المتوسط ​​تحتوي على 50 نانوغرام / مل VEGF للحث على تمايز البطانية.
  17. نقل مفاعل حيوي وضع العودة إلى thالبريد الحاضنة. تدوير يدويا الكسب غير المشروع 90 درجة كل 30 دقيقة في ساعة 2 الأولى ومن ثم الحفاظ على ثقافة ثابتة لمدة 12 ساعة.
  18. بدء تعميم تدفق من 5 مل / دقيقة وزيادة تدريجية إلى 35 مل / دقيقة. الحفاظ على معدل التدفق في 35 مل / دقيقة لمدة 5 أيام. تغيير تعميم وغرفة متوسطة كل يوم.
  19. حصاد الكسب غير المشروع هندسيا لمزيد من التطعيم إلى الماوس.

6. مسمار مزدوج المصنف PiPSC الكسب غير المشروع في الفئران

  1. استخدام NOD.CB17-Prkdc SCID / NcrCrl ذكور الفئران كمتلقين سفينة الكسب غير المشروع. تأكد دائما أن الفئران هي حوالي 10 أسابيع من العمر، تزن حوالي 25 - 35 جم، وتكون في حالة صحية جيدة.
  2. تخدير الماوس المتلقي عن طريق إعطاء مزيج من Hypnorm (25 ملغ / كلغ) وHypnovel (25 ملغ / كلغ) البريتونى. تطبيق الفازلين مرهم للعين على العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير. تأكيد التخدير كفاءة من خلال ضمان أن الفئران لها استرخاء العضلات والتنفس بشكل مطرد.
    1. إصلاح الماوس في موقف ضعيف مع عنقه حلق ومددت. إدارة سلفات الأتروبين (1.7 ملغ / كلغ) في تركيبة مع أدوية التخدير للتأكد من أن الجهاز التنفسي الماوس لا يزال واضحا.
  3. إعداد شق خط الوسط من الفك السفلي لعظمة القص من الفأرة. تحت المجهر تشريح مع 5- إلى 10 أضعاف التضخيم، ورفع الغدد اللعابية اليمنى أفقيا وإزالة العضلات ترقوي خشائي الصحيحة لفضح الصحيح الشريان السباتي المشترك.
  4. بلطف إزالة الأنسجة المرفقة لتعبئة الصحيح الشريان السباتي المشترك من نهاية البعيدة نحو نهاية القريبة. Ligate الجزء الأوسط من الشريان السباتي المشترك مرتين مع خياطة الحرير 8-0 وتشريح بين علاقات البلدين.
  5. تمر عبر صفعة مصنوعة من autoclavable أنبوب النايلون في نهاية كل سفينة وإصلاح كل طرف مع المشابك microhemostat.
  6. إزالة خياطة ربطة عنق واحدة على نهاية وتطبيق قطرة من الهيبارين (100 U / مل). بعدها مباشرة، عكس النهاية البعيدة من الالشريان الإلكترونية لتغطي الجسم كله صفعة وإصلاح السفينة المقلوبة مع خياطة 8-0 الحرير لالكفة.
    1. كرر نفس الإجراء إلى الجزء الآخر من الشريان. الشريان مطاردة مع محلول ملحي لإزالة جلطات الدم.
  7. زرع الكسب غير المشروع سفينة decellularized بين طرفي من الشريان السباتي عن طريق تحريك نهايات سفينة decellularized من خلال الأصفاد الشريان وتحديد ذلك مع 8-0 خيوط الحرير. إزالة المشابك الأوعية الدموية من أي تنتهي قبل تقييم نبض من الكسب غير المشروع.
  8. ضع الغدة اللعابية الحق في العودة إلى موقعها الأصلي. إغلاق الجلد على موقع الجراحية مع خياطة متقطعة باستخدام خياطة 6-0 polyglactin.
  9. مراقبة العلامات الحيوية باستمرار من الماوس بعد الانتهاء من إجراءات، حتى يستأنف الوعي. التضحية الفئران المتلقي عن طريق عنق الرحم التفكك والأوعية الحصاد الطعوم إما 24 ساعة أو 3 أسابيع في وقت لاحق لمزيد من التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأكد الجيل الناجح لPiPSC 4 أيام بعد nucleofecting الخلايا الليفية الإنسان مع البلازميد pCAG2LMKOSimO خطي تحمل 4 عوامل النسخ، OCT4، SOX2، KLF4 وج-MYC (OSKM). PiPSC عرض النمط الظاهري واضح بشكل ملحوظ بالمقارنة مع الخلايا الليفية (الشكل 2A)، وأعرب عن عوامل إعادة برمجة 4 في مرنا (الشكل 2B) والبروتين (الشكل 2C) مستويات 10. فعالية الكسب غير المشروع الأوعية الدموية مقرها PiPSC-تعتمد بشكل كبير على قدرة PiPSC على التمايز إلى كل م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويشير البروتوكول الحالي لوسريعة استراتيجية سليمة وبسيطة وفعالة وقابلة للتكرار الذي يمكن توليد الأنسجة المهندسة السفن الوظيفية باستخدام PiPSC من الخلايا الليفية الإنسان. هذه التقنية تمثل أداة قيمة للطب التجديدي، هندسة الأنسجة والعلاج بالخلايا يحتمل المريض محددة في المستقبل القريب. وتشمل الخطوات الحاسمة لضمان فعالية بروتوكول إعداد PiPSC، وإعداد ترقيع الشريان الأبهر معقمة وdecellularized بالكامل، بذر ناجحة والتفريق بين PiPSC في السقالات والحفاظ على عقم ترقيع الشريان الأبهر في مفاعل ح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية متضاربة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة القلب البريطانية ومؤسسة أوك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الخلايا الليفية البشرية CCL-153ATCCCCL-153الليفية الجنينية البشرية قبل الولادة
ATCC F-12K المتوسطة (تعديل Kaighn لوسط Ham's F-12)ATCC30-2004
مصل الأبقار الجنينيATCC30-2020
وسط بالضربة القاضية DMEM محسن للخلايا الجذعية الجنينيةالحياة (Gibco)12660-012
تقنيات الحياة البديلة للمصل بالضربة القاضية(Invitrogen)10828-028
Human Basic FGF-2 Miltenyi Biotech130-093-837
تقنيات alpha-MEM متوسطةالعمر (Invitrogen)32571093
Human PDGFR & D System120-HD-001
محلول الجيلاتين 2٪SigmaG1393
Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2 ، OCT4 ، KLF4 ، C-MYC)Addgene20866
  ؛ إنزيم تقييد PvuIنيو إنجلاند بيولابسRO150S
SureClean PlusBiolineBIO-37047
Nucelofection Kit (مجموعة NHDF)LONZAVPD-1001
NeomycinSIGMAG418
KL 1500 LCD LCD ، إضاءة للفحص المجهري الاستريوSCHOTTKL 1500 LCDإضاءة الضوء البارد للفحص
المجهري المجسمنيكون زووم ستيرومجكوب SMZ800نيكونSMZ800
ملح الصوديوم الهيبارينسيجماH3393
10٪ SDS محلول الأسهم كاشف البيولوجيا الجزيئيةسيفيرن للتكنولوجيا الحيويةCAS 151-21-3
فوسفات دولبيكو المخزن الملحيسيجماD8537
ماتريجل (10 مجم / مل)BDA6661
شاكر IKA Vibrax مع منصة الاهتزاز VX 7   ؛جيبسون بولتون ، جانكي وأمبير KunkelS32-102
Masterflex L / S محرك المضخة الرقميةCole-ParmerWZ-07523-80
Masterflex L / S 6 قنوات ، 6 أسطوانات خرطوشة رأس مضخةCole-ParmerEW-07519-15
Masterflex L / S خراطيش كبيرة لرأس المضخةCole-ParmerEW-07519-75
أنابيب مضخة السيليكون المعالجة بالبلاتين Masterflex ، L / S 14 ، 25 قدماCole-Parmer   ؛WZ-96410-14يمر الأنابيب من خلال المضخة التمعجية
0.5 مم معرف ، 0.8 مم OD أنابيب سيليكونSILEXN / Aتربط الأنابيب غرفة الحضانة وخزان الوسائط وغرفة الامتثال   ؛
تركيب المخفض 0.5 إلى 1.6 ، محول البولي بروبيلين الطبيعيIbidi10829يتصل فوق نوعين من الأنابيب
1/32 "أنابيب ، معرف 0.01" (250 & micro ؛ م) المواد: PEEKLabSmithT-132-010Pالأنابيب من خلال جدار غرفة الحضانة الذي يربط الكسب غير المشروع بالأنابيب الخارجية
تركيبات قطعة واحدة   ؛LabSmithT-132-100إصلاح الأنابيب المذكورة أعلاه من خلال جدار غرفة الحضانة
أنابيب النايلون (OD 0.9mm ، معرف 0.75mm)   ؛سميث الطبيةN / Aفي طرفي NOD لكسب طعم الشريان الأورطي
. CB17-Prkdcscid/NcrCrl فأرتشارلز
الخيوط الجراحية، 8-0  الحريرETHICONW819
HypnormVetapharmVm21757/4000مسكن الجذام العصبي للاستخدام في الفئران
Hypnovel (Midazolam)روش59467-70-8تحريض التخدير
تشريح المجهركارل زايسStemi 2000
أنابيب النايلونPortex LTD800/200/100/2000.65 مم في القطر و 1 مم في الطول ؛ لجعل صفعة الشريان
التخثير الكهربائيMartin & nbsp ؛SN 54.131فروع الشرايين على
ملقط الإرقاء الجزئي ثنائي القطبالشريان الأورطي Martin80-91-12-04تثبيت نهايات الأوعية
الدموية موسع الأوعيةالدموية S & TJFX-7
موسع السفينةS & TJFL-3dZ
موسع السفينةS & TD-5aZ
Mini applier مقاطع AESCULAPFE572K
Micro hemostats خيوطجراحية AESCULAPFE720K
، 6-0 VICRYLETHICONV489
الخلايا تقنيات يتم إدخال أنابيب ريفر ربط

المراجع

  1. Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
  2. Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
  3. Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
  4. Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. Tissue engineering of blood vessel. J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).
  5. Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
  6. Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
  7. Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118(2014).
  8. Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
  9. Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
  10. Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
  11. Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
  12. Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
  13. Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
  14. Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
  15. Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
  16. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
  17. Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).
  18. Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
  19. Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
  20. Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
  21. Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
  22. Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
  23. Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
  24. Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
  25. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
  26. McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
  27. Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات جزئياًطعوم أبهر منزوعة الخلايادائرة تدفق المفاعل الحيويتقنية الاستزراع المزدوجإجراء تطعيم الفئرانتمايز العضلات الملساء البطانيةعلاج أمراض القلب والأوعية الدمويةنهج الطب التجديدينموذج فأر ناقص المناعة
جيل ومسمار سفن الهندسة الأنسجة في نموذج الفأر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.