مقالة منهجية

تحليل الالتهام الذاتي في

8.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52577

⸱

فبراير 1, 2015

1LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF), Senckenberg Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

طريقة مريحة وقوية لدراسة الالتهام الذاتي في Penicillium chrysogenum باستخدام وسادات الجوع (مخاليط من الاغاروز وماء الصنبور في شريحة مجهرية تحتوي على تجويف مركزي) يتم تقديمها هنا.

الملخص

برزت دراسة أنظمة مراقبة الجودة الخلوية كمجال ديناميكي للغاية وملائم للبحث المعاصر. لقد أصبح من الواضح أن الخلايا تمتلك عدة خطوط دفاع ضد الأضرار التي تلحق بالجزيئات ذات الصلة بيولوجيا مثل الأحماض النووية والدهون والبروتينات. بالإضافة إلى ديناميكيات العضيات (الاندماج / الانشطار / الحركة / الوراثة) ونشاط البروتياز الذي يتم التحكم فيه بإحكام ، فإن تدهور العضيات الفائضة أو التالفة أو المعرضة للخطر عن طريق الالتهام الذاتي ("الأكل الذاتي" الخلوي) قد حظي باهتمام كبير من المجتمع العلمي. تنظيم الالتهام الذاتي معقد للغاية ويعتمد على العوامل الوراثية والبيئية ، والتي لم يتم توضيح الكثير منها حتى الآن. هنا يتم تقديم طريقة جديدة تسمح بدراسة مريحة للالتهام الذاتي في الفطريات الخيطية Penicillium chrysogenum. يعتمد على نمو الفطريات على ما يسمى ب "منصات الجوع" لتحفيز الالتهام الذاتي بطريقة قابلة للتكرار. يتم فحص العينات مباشرة عن طريق الفحص المجهري وتقييمها لتحريض / تقدم الالتهام الذاتي. لا يقتصر البروتوكول المقدم هنا على الاستخدام مع P. chrysogenum ويمكن تكييفه بسهولة للاستخدام في الفطريات الخيطية الأخرى.

المقدمة

الفطريات الخيطية هي أنظمة نموذجية ممتازة لدراسة العمليات التنموية. أنها توفر العديد من الفوائد التجريبية مثل الزراعة الرخيصة والأعداد الكبيرة من النسل وإمكانية الوصول الجيني. النقطة الأخيرة ذات أهمية خاصة لبناء المحولات التي تسمح بالتحقيق في أهمية الجينات غير المميزة حتى الآن للآليات الخلوية المختلفة. لعبت الفطريات الخيطية دورا أساسيا في توضيح العديد من عناصر وآليات مسارات مراقبة الجودة الخلوية مثل نشاط البروتياز لتدهور البروتينات الشاذة ، وديناميكيات الميتوكوندريا للحفاظ على سلامة الميتوكوندريا والالتهام الذاتي لإزالة مكونات الخلايا الفائضة و / أو المختلة وللحفاظ على بقاء الخلية في أوقات الجوع1،2،3.

هناك العديد من التقنيات التجريبية المتاحة لدراسة الالتهام الذاتي في الفطريات الخيطية 2: (أنا) التحقيق في الفجوات إذا كانت تحتوي على أجسام ذاتية كثيفة عندما يتم تثبيط البروتياز عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال 4 ، (ثانيا) تصور البلعمة الذاتية عن طريق مراقبة بؤر GFP-Atg8 عبر المجهر الفلوري 5،6 و (ثالثا) الكشف عن الهياكل الذاتية المحمضة باستخدام صبغة الفلورسنت monodansyl cadaverine 7.

هنا ، يتم تقديم طريقة جديدة لزراعة Penicillium chrysogenum لدراسات الالتهام الذاتي. العنصر الرئيسي هو "وسادة الجوع" التي تتكون ببساطة من 1٪ من الاغاروز المذاب في ماء الصنبور المعقم. يمكن إضافة مركبات إضافية (على سبيل المثال ، الضغوطات ، والزبالون ، ومعدلات الالتهام الذاتي) إلى الوسادة طالما أنها لا تعرض التألق التلقائي. توجد الوسادة في شرائح مجهرية تحتوي على تجويف مركزي ضحل. يتم تلقيح هذه الوسادة إما بتعليق بوغ أو بشظايا فطريات صغيرة. ينصح بهذا الأخير إذا فشلت سلالة الاهتمام في التكاثر بكفاءة (على سبيل المثال ، Δatg1 سلالات 8). يتم وضع الشرائح في غرف مبللة (يمكن إنشاؤها بسهولة باستخدام صناديق أطراف الماصة الفارغة) لمنع جفاف العينة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة. P. chrysogenum قادر على النمو لبضعة أيام في ظل هذه الظروف. يمكن ملاحظة الالتهام الذاتي مجهريا عن طريق تضخم الفراغ وهو علامة إيجابية للالتهام الذاتي الفطري. في هذه المساهمة ، P. الأحجار الكريمة يتم استخدام سلالة الكريسوجين (ويسكونسن 54-1255) التي تشكل بروتين فلوري أخضر يستهدف البيروكسيسومات من خلال تسلسل "SKL" الطرفي C 9. لذلك من الممكن مراقبة تدهور البيروكسيسومات. من الممكن أيضا تسمية مقصورات أخرى من الخلية (مثل الميتوكوندريا) باستخدام إشارات التوطين المناسبة وتحليل تدهورها. على الرغم من أن البيانات من P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) معروضة هنا ، فمن الممكن بالتأكيد استخدام طريقة "وسادة الجوع" أيضا للفطريات الخيطية الأخرى (على سبيل المثال ، Neurospora crassa و Sordaria macrospora و أنواع Aspergillus وما إلى ذلك).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير P. chrysogenum لتجارب الجوع

  1. إذا تم الاحتفاظ بالسلالة ذات الأهمية P. chrysogenum على الأرز ("الأرز الأخضر") ، ضع 2-3 حبات أرز مغطاة بالفطريات الأبواغية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. املأه ب 500 ميكرولتر YGG (10 جم / لتر KCl ، 20 جم / لتر جلوكوز ، 10 جم / لتر قاعدة نيتروجين خميرة ، 5 جم / لتر K2HPO4 ، 20 جم / لتر مستخلص الخميرة).
      قم
    1. بدوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية حتى تتمكن الجراثيم من الانفصال عن الأرز بكفاءة.
    2. احتضان الأنبوب لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال ، بين 20 و 25 درجة مئوية).
    3. قم بإعداد 1/50 مخفف من معلق البوغ هذا في ماء الصنبور المعقم ، واخلطه جيدا.
  2. إذا تم الاحتفاظ بسلالة P. chrysogenum ذات الأهمية على صفيحة أجار (على سبيل المثال ، صفيحة أجار YGG) ، فقم بنقل قطع صغيرة من الفطريات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 400 ميكرولتر من ماء الصنبور المعقم وحوالي 100 مجم من الخرز الزجاجي باستخدام عود أسنان معقم أو طرف ماصة.
    1. دوامة الأنبوب لمدة 2 دقيقة حتى تصبح الفطريات مجزأة. استخدم محتويات الأنبوب على الفور.
< p class = "jove_title" >2. الخطوات التحضيرية لزراعة P. chrysogenum على منصات الجوع

  1. قم بتشغيل لوحة التسخين واضبطها على 60 درجة مئوية تقريبا.
  2. قم بإذابة 2 غرام من الاغاروز في 100 مل من ماء الصنبور عن طريق طهي المحلول في فرن الميكروويف. احرص على أن يكون هذا الحل واضحا تماما بعد التسخين. إذا لم يكن كذلك ، اطهيه مرة أخرى حتى يذوب الاغاروز تماما. دع محلول الاغاروز يبرد إلى حوالي 60 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  3. املأ 1.5 مل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (2-4 ، حسب عدد العينات) ب 400 ميكرولتر من ماء الصنبور المعقم لكل منها (بدون إضافة مركبات إضافية) أو 400 × ميكرولتر (إضافة x ميكرولتر من المحلول المركب في الخطوة 2.5) وضعها على لوح التسخين لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يسخن الماء بالداخل.
  4. ضع شرائح المجهر التي تحتوي على تجويف مركزي على لوحة التسخين لمدة 1 دقيقة على الأقل.
  5. أضف 400 ميكرولتر 2٪ agarose إلى المحلول في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل والدوامة لفترة وجيزة. بعد هذه الخطوة إذا رغبت في ذلك ، أضف مركبات إضافية (أي 1 ميكرومتر رابامايسين). إذا تم ذلك ، فقم بالدوامة لفترة وجيزة بعد ماصة كل مادة إضافية إلى الأنبوب. ضع الأنابيب مرة أخرى على طاولة التسخين لمنع التصلب المبكر.
    ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 800 ميكرولتر.

3. تحضير شرائح المجهر التي تحتوي على وسادات تجويع

  1. ماصة 140 ميكرولتر من محلول الاغاروز في تجويف شريحة المجهر (التي لا تزال موجودة على لوحة التسخين). حاول تجنب صنع الفقاعات إن أمكن.
  2. ضع على الفور غطاء على محلول الاغاروز.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى سطح مستو.
  3. ضع شريحة المجهر على مقعد المختبر لمدة 4 دقائق تقريبا للسماح لوسادة الاغاروز بالتصلب.
  4. قم بإزالة الغطاء بعناية من وسادة الاغاروز عن طريق تحريكه بمساعدة الإبهام أو السبابة (ارتد قفازات لتجنب التلوث!).
  5. ضع شريحة المجهر مع الوسادة في غرفة مبللة لمنع الجفاف. التوصية: استخدم صندوق طرف فارغ لا يزال يحتوي على ملحق لتثبيت أطراف الماصة. أضف الماء المعقم إلى الصندوق حتى يتم تغطية القاع. ضع شرائح المجهر على الملحق وأغلق الصندوق.
< p class = "jove_title" >4. تلقيح ضمادات الجوع ب P. chrysogenum والحضانة

  1. ماصة 5 ميكرولتر من تخفيف الأبواغ 1/50 (إذا كانت المزارع نمت على الأرز) أو 5 ميكرولتر من المحلول غير المخفف الذي يحتوي على شظايا الفطريات (إذا نمت المزارع على صفيحة أجار) على وسط وسادة الجوع.
  2. أغلق الغرفة المبللة ولفها في كيس بلاستيكي (هذا بمثابة حماية إضافية ضد جفاف وسادات الجوع). احرص على عدم تحريك الصندوق كثيرا وإلا فسوف يتم إزعاج قطرات التلقيح.
  3. قم بتخزين الصندوق الملفوف في RT لمدة 20 ساعة على الأقل قبل تحليل العينات.
فئة

5. التحليل المجهري للعينات

  1. بعد 20 ساعة من الحضانة ، تكون العينات جاهزة للتحليل المجهري ؛ ضع شريحة المجهر على ورق مناديل جافة (يميل الجزء السفلي إلى أن يصبح رطبا).
  2. ماصة كمية صغيرة من الماء (حوالي 50 ميكرولتر) على وسادة الجوع. ضع غطاء على الوسادة واضغط على الماء الفائض. قم بإزالة الماء الفائض بالمناديل الورقية.
  3. ضع شريحة المجهر على طاولة المراقبة الخاصة بالمجهر الفلوري. للحصول على نظرة عامة على نمو الفطريات ، استخدم هدف 20X. استخدم أهداف 63X أو 100X لدراسة توطين GFP في الخيوطات. من أجل منع الجفاف التدريجي للعينة ، لا تحلل العينات لمدة تزيد عن 15 دقيقة قبل إعادتها إلى الغرفة الرطبة.
  4. كرر 5.3 على فترات منتظمة (على سبيل المثال ، بعد 40 ساعة و 60 ساعة من النمو).
    ملاحظة: يمكن إعادة العينة إلى الغرفة الرطبة. ليس من الضروري إزالة الغطاء لأنه لا يؤثر على نمو الفطريات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لإثبات فائدة البروتوكول المفصل أعلاه، تم تحليل تحلل البيروكسيسومات في سلالة P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL). في هذه السلالة، يتم عادةً استيراد GFP-SKL إلى البيروكسيسومات 9، مما يؤدي إلى ظهور أشكال كروية متعددة عند تحليل العينة بواسطة المجهر الفلوري. وإذا حدث الالتهام الذاتي، تتوسع الفجوات، حيث يندمج GFP-SKL في الفجوات عن طريق الالتهام الذاتي (الالتهام البيروكسيسومي/pexophagy). ونظراً لأن البروتين GFP مقاوم للتحلل بواسطة بروتياز الفجوة، فإنه يعمل على وسم هذه العضيات 10. وبناءً على ذلك، يم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تسمح الطريقة المعروضة هنا بدراسة مريحة وقابلة للتكرار للالتهام الذاتي في P. chrysogenum. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه لفحص فعالية المركبات المختلفة سواء كانت قادرة على تعديل استجابة الالتهام الذاتي لهذه الفطريات أم لا. توضح النتائج مع الرابامايسين أن تثبيط إشارات TOR يؤدي إلى تحريض واضح للالتهام الذاتي في P. chrysogenum والذي تم إثباته أيضا للكائنات الحية الأخرى 11.

من الممكن استخدام الفطريات المزروعة على منصات الجوع لتحليلها في مجاهر أكثر تطورا (على سبيل ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلف ليس لديه ما يفصح عنه.

شكر وتقدير

CQS تحصل على زمالة من LOEWE Excellence Cluster للأبحاث الفطرية التكاملية (IPF). يود المؤلف أن يشكر Ida J. van der Klei على P. chrysogenum سلالات المستخدمة في هذا العمل وأندرياس س. رايشرت على هدية الرابامايسين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شرائح مجهرية مع تجويف مركزيCarl Roth GmbH ، كارلسروه ، ألمانياH884.1يمكن استخدامها عدة مرات بعد التنظيف.
الخرز الزجاجيCarl Roth GmbH ، كارلسروه ، ألمانياA553.1القطر: 0.25 - 0.50 مم

المراجع

  1. Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
  2. Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. Autophagy in filamentous fungi. Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).
  3. Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
  4. Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. Podospora anserina target of rapamycin. Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).
  5. Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
  6. Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
  7. Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
  8. Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
  9. Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
  10. Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
  11. Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. mTOR regulation of autophagy. FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).
  12. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP Delta 80 G1

مقالات ذات صلة