يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ورم الابتدائي وMEF عزل الخلايا لدراسة الرئة الانبثاث

15.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52609

⸱

مايو 20, 2015

 ,  , 
1Biochemistry and Molecular Biology, Louisiana State University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الهدف من هذا البروتوكول هو دراسة تكوين أورام الثدي. باستخدام هذه التقنية ، تتم إزالة أورام الثدي في الفئران وتحضير الخلايا الأولية من الأورام. يتم تضمين بروتوكول استخراج الرئة لدراسة ورم خبيث في الرئة. علاوة على ذلك ، يتم تضمين بروتوكول آخر لتحليل الخلايا الليفية الجنينية للفأر من جنين الفأر.

الملخص

في تكوين أورام الثدي ، تشكل المرحلة النقيلية من المرض أكبر تهديد للفرد المصاب. تمتلك خلايا الثدي الطبيعية ذات الأنماط الجينية المتغيرة الآن القدرة على غزو الأنسجة الأخرى والبقاء على قيد الحياة. في هذا البروتوكول ، تتم إزالة أورام الثدي في الفئران وتحضير الخلايا الأولية من الأورام. ثم تكون الخلايا المعزولة من هذا الإجراء متاحة لتجارب التنميط الجيني. من أجل ورم خبيث ناجح ، يجب أن تكون هذه الخلايا قادرة على التدخين ، والبقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية ، والانتشار إلى الأعضاء البعيدة ، والبقاء على قيد الحياة في نظام الأعضاء الجديد هذا. الرئتان هما الهدف النموذجي للورم الخبيث لسرطان الثدي. تم اكتشاف مجموعة من الجينات التي تتوسط انتقائية ورم خبيث في الرئة. نصف هنا طريقة لدراسة ورم خبيث في الرئة من نموذج فأر معدل وراثيا. علاوة على ذلك ، يتم تضمين بروتوكول آخر لتحليل الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) من جنين الفأر. توفر خلايا MEF من نفس النوع الحيواني دليلا على التعبير الجيني للخلايا غير السرطانية. هذه التقنيات مفيدة معا في دراسة تكوين أورام الثدي في الفئران ، وآليات الإشارات المرتبطة بها ومسارات التشوهات في الأجنة.

المقدمة

ورم خبيث هو الخطوة الأخيرة في تطور سرطان الثدي 1. يتضمن سلسلة من الخطوات التي يتم فيها إطلاق الخلايا الخبيثة من الورم الأساسي ونشرها إلى أعضاء أخرى 2. يجب أن تكون الخلايا قادرة على التدعيم داخل الأوعية الدموية ، والبقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية ، والانتشار إلى الأعضاء البعيدة ، والبقاء على قيد الحياة في نظام الأعضاء الجديد 3. يتم التحكم في كل خطوة في تكوين الأورام بإحكام بواسطة الخلايا من خلال التغيرات الجينية واللاجينية المختلفة 4. لدراسة آليات تكوين أورام سرطان الثدي ، تم استخدام أنظمة نماذج الفئران نظرا لعمرها القصير وصغر حجمها ووقت تكاثرها السريع. بعض المزايا الرئيسية لاستخدام نماذج الفئران في أبحاث السرطان هي أوجه التشابه الجزيئية والفسيولوجية التي تشترك فيها مع البشر 5.

تم استخدام خطوط الخلايا الفئرانية والبشرية على نطاق واسع في أبحاث سرطان الثدي. على الرغم من أنه يمكننا الحصول على بعض المعلومات حول خطوات ورم خبيث باستخدام هذه الخلايا ، إلا أن النماذج الحيوانية التي تم التلاعب بها وراثيا باستخدام مثبطات الورم / الجينات المسرطنة ستعطي المزيد من المعلومات حول تطور الورم وورم خبيث بدءا من المرحلة الجنينية. وبالتالي ، باستخدام نماذج الفئران هذه ، يمكننا الحصول على التنظيم الجيني والتنموي لنمو الورم. علاوة على ذلك ، تلعب البيئة المكروية للورم أيضا دورا مهما في التعبير الجيني للخلايا السرطانية وقد يكون من الصعب تقليد نفس السيناريو من خلال الدراسات التي تستخدم خطوط الخلايا الراسخة. يمكن أيضا استخدام أورام الثدي البشرية الأولية لدراسة تكوين أورام الثدي في الفئران. العيب الرئيسي لاستخدام أورام الثدي المعزولة هو أن هذا الورم المزروع حديثا لا يحتوي على الأوعية الدموية والأنسجة اللمفاوية للفأر. في حين أن أنظمة نموذج الفأر الجيني لدراسة تكوين أورام الثدي ستسمح لنا بمراقبة خطوات ورم خبيث ، وتحليل البيئة المكروية للورم ، والوصول إلى الجسم بأكمله 5.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو دراسة تكوين أورام الثدي في الفئران. من المعروف أن سرطانات الثدي تنتقل عادة إلى الدماغ والرئة والعظام. يسمح هذا البروتوكول بعزل الخلايا السرطانية الثديية الأولية ، وكذلك دراسة ورم خبيث لسرطان الثدي في الرئة. علاوة على ذلك ، يتم تضمين بروتوكول آخر لتحليل الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) من جنين الفأر. هذه التقنيات معا مفيدة في دراسة تكوين أورام الثدي في الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت جميع التجارب الماوس وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها مؤسسات الرعاية الحيوانية واللجان الاستخدام (IACUC) من مدرسة LSU الطب. يجب تعقيمها جميع الصكوك قبل تشريح.

1. إعداد الخلايا الأولية من الفأر أورام الثدي

  1. استخدام نموذج الفأر الذي تم هندستها وراثيا مع ورم الفيروسات ماوس الثديية التورام الأوسط T-مستضد (الماوس MMTV-PyMT المعدلة وراثيا)، الذي وضع بشكل عفوي الأورام كما هو موضح سابقا 6.
  2. التضحية الفئران مع isoflurane (99.9٪) ورذاذ 75٪ من الإيثانول لضمان بيئة معقمة (الشكل 1A).
  3. فتح الجلد من منطقة فتحة مجرى البول في الرقبة مع مقص. دبوس الجلد أسفل للسماح سهولة الوصول إلى أجهزة (الشكل 1B).
  4. عزل الورم الثدي الثدي ويغسل مع الفوسفات العقيمة الباردة مخزنة المالحة (PBS) (7.4 درجة الحموضة) (الشكل 1C).
  5. نقل الورم إلىمعقمة لوحة الثقافة 10CM النسيج وختم عليها بشفرة حلاقة معقمة ومقص لحوالي 1 ملم 3 قطع. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات اللاحقة في معقم غطاء تدفق الصفحي.
  6. احتضان الأنسجة السرطانية المفروم مع كولاجيناز الذائبة في المصل وسائل الاعلام DMEM مجانا بتركيز نهائي من 1mg / مل على الكرسي الهزاز لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. الطرد المركزي تعليق نسيج الورم لمدة 3 دقائق في 200 ز س.
    ملاحظة: حضانة كولاجيناز أمر ضروري لتفارق الأنزيمية للأنسجة.
  7. تجاهل طاف ويغسل الراسب 3 مرات مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 ز س. بعد غسل النهائي، صب طاف.
  8. Resuspend والأنسجة مع 2 مل من التربسين EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حين الإيماء. الطرد المركزي تعليق لمدة 3 دقائق في 200 x ج وكرر يغسل.
  9. resuspend الكرية الأنسجة في متوسط ​​النمو الطبيعي (DMEM، و 10٪ FBS، 2X القلم / بكتيريا) على طبق من ذهب 10CM. تغييروسائل الإعلام كل يوم لمدة 3 أيام القادمة. يتم الحصول على الخلايا الثقافة حتى عدد الخلايا المطلوبة.
    ملاحظة: سيتم عزل ما يقرب من 1X10 7 خلايا من هذا الإجراء. نماذج تكون الأورام الثديية الماوس الأخرى، مثل MMTV-نوي، وإعطاء محصول أقل من خلايا بالمقارنة مع MMTV-PyMT. عند استخدام النماذج التي تنتج العائد أقل، فمن المفيد أن تبدأ مع أكبر ورم والثقافة الخلايا لفترة أطول.

2. الرئة ماوس استخراج لتصور الرئة الانبثاث

  1. قبل استخراج الرئة، وإزالة الكبد والحجاب الحاجز. طرد الأضلاع دون إزعاج الرئتين.
  2. مع زوج جيد من مقص، فتح الجزء العلوي من القصبة الهوائية والتي هي أقرب إلى حبل الوريد.
  3. باستخدام القسطرة، حقن عامل مثل 1 مل من Z-الإصلاح أو الهند الحبر من خلال القصبة الهوائية لملء الرئتين (الشكل 2A). تضمين Z-إصلاح الرئتين في البارافين.
  4. دي صمة عار على الرئتين حقن الحبر الهند في حل فيكيت ل(100 مل الكحول 70٪، و 10 مل من 10٪ من الفورمالين مخزنة، و 5 مل من حمض الخليك الجليدي) لمدة 5 دقائق. تحديد العقيدات ورم في مواقع الثانوية مع ≥ 0.5 مم في القطر، وتحديد العقيدات باسم الانبثاث.
    ملاحظة: نظرا لانسداد الشعب الهوائية والقصيبة من الورم، العقيدات الورم لا يمكن أن تمتص 15٪ الهند الحبر، وبالتالي أنسجة الرئة الطبيعية ستكون باللون الأسود، وسوف العقيدات ورم يكون في اللون الأبيض 7. وهذا سوف يسمح التصور العقيدات الورم الفردية (الشكل 2B).

3. إعداد الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS) من أجنة الفئران

  1. التضحية الفئران الحوامل مع isoflurane (99.9٪) ورذاذ 75٪ من الإيثانول لضمان بيئة معقمة.
  2. فتح الجلد من منطقة فتحة مجرى البول في الرقبة مع مقص وعزل الأجنة من الرحم.
  3. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الأجنة عند فتح الجلد.
  4. إزالة قرون الرحم وشطف لهم في الظريف البارديثير غضب PBS (7.4 درجة الحموضة).
  5. فصل الجنين من المشيمة بدقة بالغة والأجنة مكان في لوحة 10CM تحتوي على الجليد الباردة PBS (7.4 درجة الحموضة).
  6. إزالة الرأس والكبد والأمعاء من الجنين ووضع الجزء المتبقي في 12 جيدا لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4).
  7. نقل جثة الجنين إلى 12 لوحة جيدا تحتوي على التربسين EDTA آخر ومقطعة إلى قطع صغيرة (~ 1 مم 3) باستخدام شفرة حلاقة معقمة ومقص. احتضان المواد المفروم مع 5 مل من التربسين EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  8. تعطيل التربسين بإضافة 1 مل مصل بقري جنيني (FBS) للأجنة المفروم. الطرد المركزي تعليق على 200 سرعة x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة بعناية طاف، resuspend وبيليه مع 1 مل من المتوسط ​​الدافئة DMEM ونقل جميع المحتويات إلى طبق 10CM تحتوي على 10 مل من DMEM (مع 20٪ FBS و2X البنسلين / الستربتوميسين ).
  9. تغيير المتوسطة كل يوم لمدة يومين. ثقافة الخلايا حتى الخلية المطلوبةيتم تحقيق الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مرحلة تطور الورم الذي للتضحية الحيوان تعتمد على دراسة معينة ومبادئ توجيهية IACUC. في الشكل 1A، وهو القديم C57BL / 6 الماوس 100 يوم مع ورم الفيروسات ماوس الثديية التورام الأوسط T-مستضد (MMTV-PyMT) وضحى في ثلاثة أشهر. وافتتح الجلد من منطقة فتحة مجرى البول في الرقبة مع مقص والجلد وتمركزها للسماح سهولة الوصول إلى الأجهزة كما هو مبين في الشكل 1B. هذا يسمح سهولة الوصول إلى الورم التي تم الحصول عليها في الشكل 1C. وتصور الخلايا الأولية ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذا البروتوكول هو لعزل الخلايا الأولية من ورم الماوس الطازجة. لست] أعدت من هذه الطريقة مفيدة للبروتين، وتحليل الحمض النووي RNA. الخلايا السرطانية من الورم الثدي الرئيسي في كثير من الأحيان metastasize إلى الدماغ والرئة والعظام 1. وشملت هو تقنية لاستخراج الرئة للكشف عن ورم خبيث. وتلطيخ الرئة مع الحبر وصمة عار السماح لتصور العقيدات الورم كما رأينا في الشكل 2B. وتحديد الرئتين في حل Z-الإصلاح تسمح لنا لجعل أجزاء من الرئتين، وصمة عار مع الأجسام المضادة التي ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم الإفصاحات.

شكر وتقدير

نود أن نشكر المعاهد الوطنية للصحة و LACaTS ومؤسسة عيادة Ochsner على الدعم المالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMHyCloneSH30243.01Store at 4 & deg; C
0.05٪ Trypsin-EDTALife  تقنيات25300-062Store at – 20 ° C
كولاجيناز النوع الرابعSigma-AldrichC5138مخزن في – 20 & deg; C
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506Store at – 20 ° C
Pen StrepLife  تقنيات15140-122Store at 4 & deg; C
مصل الأبقار الجنينية (FBS)الجوزاء المنتجات الحيوية100-106مخزن في – 80 ° متجر C
Z-fixANATECH# 174في متجر RT
India InkYasutomoفي RT
AERRANE (Isoflurane)متجر BaxterNDC 10019-773-60في متجر RT
EthanolEMDAX0441-3في RT

المراجع

  1. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).
  2. Poste, G., Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis. Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).
  3. Wan, L. Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic. Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).
  4. Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).
  5. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).
  6. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
  7. Wexler, H. Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases. J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).
  8. Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells. Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).
  9. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  10. Watts, A. M., Kennedy, R. C. Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging. Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).
  11. Rosenberg, S. A., et al. Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2. J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).
  12. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Re. 8 (4), 212(2006).
  13. Veer, L., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

MEF psin EDTA
ورم الابتدائي وMEF عزل الخلايا لدراسة الرئة الانبثاث
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.