A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

Abstract

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Introduction

الكمي تضخيم الحمض النووي هو تقنية هامة للكشف عن البيئي، وتنتقل عن طريق الأغذية، ومسببات الأمراض التي تنقلها المياه فضلا عن التشخيص السريري. في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل الكمي رد فعل (QPCR) هو الأسلوب معيار الذهب للكشف عن حساسية ومحددة، وكمية من الأحماض النووية، على سبيل المثال، لHIV-1 اختبار الحمل الفيروسي، والكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية، والكشف عن العديد من الكائنات الحية الأخرى ^{1 – 3.} خلال الوقت الحقيقي QPCR، الاشعال تضخيم DNA الممرض في دورات، ويتم إنشاء إشارة الفلورسنت التي تتناسب مع كمية من الحمض النووي تضخيم في العينة في كل دورة. عينة تحتوي على تركيز غير معروف من DNA الممرض قد يكون كميا باستخدام منحنى القياسية التي تتعلق تركيز الحمض النووي الأولي من العينات القياسية والوقت الذي إشارة الفلورسنت تصل إلى عتبة معينة (أي عتبة دورة، أو C _T).

<p class="jove_content"> لأن الوقت الحقيقي QPCR يتطلب معدات باهظة الثمن وركوب الدراجات الحرارية وعدة ساعات لتلقي نتائج، وتقنيات التضخيم متساوي الحرارة البديلة، مثل recombinase البلمرة (RPA)، وقد وضعت ^4. توفر هذه المنصات عموما النتائج بشكل أسرع وتضخيم الأحماض النووية في الدنيا، ودرجة الحرارة واحدة، والتي يمكن إنجازها بأقل تكلفة، والمعدات أبسط. يتطلب الجيش الوطني الرواندي، والتي هي جاذبية خاصة لنقطة من الرعاية التطبيقات، وتضخيم DNA في دقائق، ودرجة حرارة منخفضة التضخيم (37 ° C)، ويبقى نشطا في وجود الشوائب ^5،6. وقد وضعت المقايسات الجيش الوطني الرواندي لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك تحليل المواد الغذائية، والكشف عن العوامل المسببة للأمراض وسرطان فحص المخدرات، وكشف عن وكلاء biothreat ^7-12. ومع ذلك، واستخدام الجيش الوطني الرواندي لتقدير الأحماض النووية كان محدودا ^13،14.

في الأعمال السابقة، كان SHOسفل ذلك الوقت الحقيقي الجيش الوطني الرواندي الكمي (qRPA) هو ممكن عمليا ^15. هنا، يتم توفير بروتوكول أكثر تفصيلا لاستخدام الوقت الحقيقي الكمي الجيش الوطني الرواندي لتحديد العينات المجهولة باستخدام منحنى قياسي، وهو الأسلوب الذي مماثلة لالكمي باستخدام QPCR. يصف هذا البروتوكول كيفية تنفيذ رد فعل الجيش الوطني الرواندي على cycler الحرارية للكشف عن HIV-1 الحمض النووي كدليل صحة مفهوم، وكذلك كيفية وضع مراقبة إيجابية الداخلية (IPC) لضمان أن النظام يعمل بشكل صحيح. هو مفصل أيضا جمع البيانات باستخدام cycler الحرارية أو المجهر وتحليل البيانات لبناء منحنى قياسي باستخدام بيانات التدريب. وأخيرا، أثبتت طريقة لقياس العينات المجهولة باستخدام منحنى القياسية مع سيناريو مخصص. هذه التقنية تمكن qRPA الكمي للعينات مع تركيزات معروفة ولها مزايا عديدة أكثر من الوقت الحقيقي التقليدي QPCR.

Protocol

1. برنامج cycler الحرارية لفي الوقت الحقيقي ردود الفعل qRPA

1. إنشاء بروتوكول جديد في برنامج cycler الحرارية.
   1. إدراج خطوة ما قبل الحضانة: 39 ° C لمدة 1 دقيقة.
   2. إضافة الخطوة الثانية: 39 درجة مئوية لمدة 20 ثانية تليها لوحة القراءة.
   3. وأخيرا، اضافة الى وجود "جو GO TO" أن يكرر الخطوة الثانية 59 مرات أكثر.
   4. حفظ البروتوكول.
2. إنشاء لوحة جديدة في "لوحة تحرير" علامة التبويب من البرنامج. تحديد الآبار على لوحة المقابلة لمواقع ردود فعل الجيش الوطني الرواندي (هنا والآبار استخدام A1، A4-A8، B1، وB4-B8).
   ملاحظة: ليس من المهم ما اذا كان يتم تحديد نوع عينة من الآبار (على سبيل المثال، "ستاندرد"، "المجلس الوطني الانتقالي")، كما يتم تحليل البيانات باستخدام برنامج نصي مخصص.
   1. للتجارب التي تحتوي على HIV-1 الحمض النووي فقط، حدد "HEX" fluorophore لجميع الآبار. للتجارب التي تحتوي على HIV-1 الحمض النووي والتعاون الإيجابي الداخليntrol، حدد كلا "HEX" وfluorophores "FAM" لجميع الآبار. حفظ اللوحة.

2. إعداد لتجارب HIV-1 qRPA

1. تجميع ردود فعل الجيش الوطني الرواندي في مساحة عمل ما قبل التضخيم المعينة التي تحتوي على ماصات المعينة، نصائح ماصة، vortexer، وميني الطرد المركزي، أما بالنسبة QPCR. كما الجيش الوطني الرواندي قد تضخيم نسخة واحدة من الحمض النووي بنسبة تصل إلى عشرة أوامر من حجم (لا تظهر البيانات)، والتعامل مع والتخلص من أنابيب المنتجات المحتوية على الحمض النووي بعد تضخيمها في منطقة ما بعد التضخيم المعينة.
   1. منع الاتصال بين جميع الكواشف قبل التضخيم ومنتجات ما بعد التضخيم. رش مساحات والمعدات مع التبييض 50٪ قبل التضخيم قبل وبعد كل التجارب. استخدام منشفة ورقية لمسح بعيدا التبييض الزائد.
2. شراء تسلسل التمهيدي إلى الأمام 5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA غا AAG G-3 "وعكس تسلسل التمهيدي 5'-CCC غا غا AAT TTT TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3 "من تخليق DNA التجارية. شراء تسلسل التحقيق 5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA / HEX] GC [THF] C [DT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3 "من مصادر تجارية. تخزين جميع الاشعال وتحقيقات في 4 درجات مئوية في aliquots في تركيز من 10 ميكرومتر قبل الاستخدام.
   ملاحظة: الفحص qRPA تضخيم فريدة من نوعها تسلسل HIV-1. لهذا الاختبار إثبات صحة مفهوم، استخدم البلازميد pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr صفها ساتون وآخرون. والذي يحتوي على تسلسل الهدف ^16. للتجارب qRPA، تم تخزين البلازميد في 4 درجات مئوية في مأخوذة تحتوي على 1، 10، 10 ^2، 10 ^3، و 10 ⁴ نسخ لكل ميكرولتر في العازلة التي تحتوي على 10 ملي تريس، 0.1 ملي EDTA في درجة الحموضة 8.0، و 1 نانوغرام / ميكرولتر الحمض النووي البشري الجيني الناقل (360486). هذا تركيز الحمض النووي الناقل ما يعادل تركيز الحمض النووي التي تم الحصول عليها من مجموعات استخراج الحمض النووي المصل التجارية المستخدمة لHIV-1 تشخيص ^17. هذه HIV-1واستخدمت التخفيفات كقوالب في التفاعلات qRPA لبناء منحنى القياسية.

3. تجميع لHIV-1 qRPA ستاندرد كيرف

1. قبل تجميع ردود الفعل qRPA، وإعداد مساحة العمل قبل التضخيم كما هو موضح في الخطوة 2.1.1. وضع كتلة البارد 96-جيدا في تخزين عند 4 درجات مئوية.
2. إعداد الكواشف لمدة 12 ردود الفعل:
   1. نقل خلات المغنيسيوم، المخزن المؤقت معالجة الجفاف، و 12 RPA الكريات رد فعل على مساحة العمل قبل التضخيم.
   2. ذوبان الجليد خلات المغنيسيوم والمخزن المؤقت الإماهة في درجة حرارة الغرفة.
   3. قسامة 32.5 ميكرولتر من خلات المغنيسيوم (2.5 ميكرولتر في رد الفعل) إلى أنبوب microcentrifuge.
   4. إعداد مزيج 13x الرئيسي. إضافة 383.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت الإماهة (29.5 ميكرولتر في رد الفعل) إلى أنبوب microcentrifuge منفصلة لمزيج الرئيسي. إضافة 41.6 ميكرولتر من المياه مجانا نوكلياز (3.2 ميكرولتر في رد الفعل) إلى مزيج الرئيسي. دوامة مزيج الرئيسي.
   5. إعادة aceta المغنيسيومعازلة الشركة المصرية للاتصالات والإماهة لتخزين في -20 ° C.
   6. نقل التمهيدي والتحقيق مأخوذة من الثلاجة إلى المنطقة قبل التضخيم، وتجنب التعرض للضوء الزائد لتقليل photobleaching من.
   7. إضافة 27.3 ميكرولتر كل من 10 ميكرومتر إلى الأمام والاشعال (2.1 ميكرولتر في التمهيدي في رد الفعل) إلى مزيج الرئيسي عكس.
   8. إضافة 7.8 ميكرولتر من 10 ميكرومتر المسمى HEX HIV-1 الحمض النووي التحقيق (0.6 ميكرولتر في رد الفعل) إلى مزيج الرئيسي.
   9. العودة الاشعال وتحقيق لتخزين.
3. مطابقة تخطيط لوحة المبينة في القسم 1.2، ضع 1 انزيم بيليه في كل من أنابيب أقصى اليسار و1 انزيم بيليه في كل من 5 أنابيب اليمين المتطرف من 2 منخفضة الارتفاع 8 جيدا PCR شرائط أنبوب.
4. إضافة بعناية 37.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل أنبوب يحتوي على انزيم بيليه، وذلك باستخدام ماصة جديدة لكل أنبوب واثارة بلطف مزيج الرئيسي وبيليه مع طرف حتى يذوب بيليه بالكامل. يحرك بلطف لمنع formati فقاعةعلى، وإزالة غيض بعناية لمنع أي خسارة للحجم رد الفعل.
5. بعد أن تم ممهى كل الكريات الانزيم مع مزيج الرئيسي، استرداد كتلة البارد 96-جيدا من 4 ° C التخزين. وضع شرائط أنبوب PCR في كتلة الباردة أن يبرد مزيج الرئيسي.
6. في حين أن مزيج الرئيسي والتبريد، تحميل برنامج cycler الحرارية مع بروتوكول وصفيحة وصفها في القسم 1.
7. قطع 2 شرائط من البلاستيك واضح الصغرى الختم لاصق لتكون أوسع قليلا من الأنابيب PCR، واسترداد 2 شقة PCR الأغطية أنبوب الشريط.
8. استرجاع 6 مأخوذة من قالب تخزين (التي تحتوي على 0، 1، 10 ^1، 10 ^2، 10 ^3، 10 أو ⁴ نسخ من البلازميد HIV-1 لكل ميكروليتر).
9. إضافة 10 ميكرولتر من كل قالب للأنابيب المخصصة لذلك تركيز القالب. استخدام ماصة جديدة لكل أنبوب، واثارة بلطف حل مع طرف لخلط مزيج الرئيسي والقالب. تأكد من إضافة القالب إلى الموقع الصحيح إلى match تخطيط لوحة المبينة في القسم 1.2.
10. ضمان أن PCR محول أنبوب الشريط لميكروسنتريفوج في المكان.
11. الاستغناء 2.5 ميكرولتر من خلات المغنيسيوم في كل غطاء الأنبوب الذي سيتم وضعها على أنبوب يحتوي على رد فعل qRPA.
12. وضع بلطف الأغطية على رأس أنابيب PCR بحيث أنها ليست مختومة بالكامل ويمكن إزالتها. فإن خلات المغنيسيوم التمسك الأغطية ويكون واضحة للعيان من فوق.
13. إدراج كل PCR أنبوب الشريط مع الأغطية في كل جانب من حامل أنبوب PCR. إغلاق غطاء minifuge تدور خلات المغنيسيوم من الأغطية والى رد فعل الجيش الوطني الرواندي، وبدء رد فعل الجيش الوطني الرواندي. أجهزة الطرد المركزي حتى يتم القضاء على كل فقاعات ويتم جمع كل السائل في الجزء السفلي من كل أنبوب (حوالي 10 ثانية).
14. بسرعة إزالة شرائط أنبوب PCR وإعادتها إلى كتلة البارد لوقف ردود الفعل qRPA.
15. إزالة بعناية الأغطية لمنع تشكيل الهباء الجوي وختم كل PCR أنبوب الشريط مع قطعقطعة من الواضح فيلم الصغرى الختم.
16. المشي بسرعة إلى cycler الحرارية وتحميل اثنين من شرائط أنبوب PCR في cycler الحرارية في المواقع مطابقة تخطيط لوحة (الآبار A1-B8). إغلاق الغطاء من cycler الحرارية، انقر فوق "بدء تشغيل"، وتعيين اسم ملف للتجربة.
    ملاحظة: على الرغم من أن الشركة المصنعة يوصي تهييج العينة بعد 5 دقائق من الحضانة، هذه الخطوة ليست ضرورية لهذا الاختبار خاص ويمكن حذفها.
17. بعد اكتمال المدى، حدد "إعدادات"، "تحديد خط الأساس"، "لا خط الأساس الطرح" لعرض البيانات مضان الخام. تصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات عن طريق اختيار "تصدير"، "تصدير جميع أوراق البيانات إلى Excel." ملف مع الإضافة "الكمي تضخيم نتائج" سيتم إنشاء التي تحتوي على البيانات مضان في الوقت الحقيقي الخام.

4. وضع الداخلي تحكم إيجابي

1. تحديد تسلسل الحمض النووي من الأنواع التي من غير المحتمل أن تكون موجودة في العينة المستهدفة. تسلسل يجب أن يكون أطول من amplicon المستهدفة بذلك يحبذ ذلك الجيل من تسلسل الهدف.
   ملاحظة: للحصول على هذا الاختبار، كريبتوسبوريديم بارفم، وهو الطفيلي في الأمعاء، وقد اختير ليكون بمثابة نموذج لجيل من تسلسل IPC لأن هذا الكائن الحي من غير المحتمل أن تكون موجودة في الدم وكان متاحا في المختبر من مشروع آخر. لإنشاء تسلسل IPC، واستخراج وتنقية الحمض النووي من C. بيض التوكسوبلازما parvum كما وصفها في أي مكان آخر ^(18).
2. شراء الأمام (5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA غا AAG G / ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3 ') وعكس (5'- CCC غا غا AAT TTT TTT TTG TAA TTT GTT TTT G / TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3 ') الاشعال من مصادر تجارية. وترد الاشعال IPC PCR المستخدمة في هذا الاختبار في الشكل (1) وتحتوي على منطقة واحدة التي هي مكملة لقالب IPC DNA (على سبيل المثال، C. parvum والأرجواني في الشكل 1) ومنطقة واحدة أن مجانية للكائن الحي الهدف (على سبيل المثال، HIV-1، الأزرق في الشكل 1).
3. أداء PCR باستخدام بادئات وIPC DNA القالب.
   1. تجميع 50 ميكرولتر ردود الفعل PCR باستخدام الكواشف عدة Phusion عالية الدقة البلمرة DNA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، باستثناء البلمرة. استخدام 2 ميكرولتر من قالب DNA وPhusion العازلة HF.
   2. إضافة البلمرة Phusion لكل رد فعل بعد بداية الساخن في 98 ° C، تليها 60 ثانية في 98 ° C، تليها 40 دورة من 15 ثانية في 98 ° C، 30 ثانية عند 62 درجة مئوية، و 30 ثانية في 72 ° C مع ملحق النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد ركوب الدراجات الحرارية، وعقد العينات عند 4 درجات مئوية.
   3. تحليل عينات من قبل الكهربائي للهلام على 2٪ تاي agarose هلام، ومن ثم استخراج وتنقية DNA باستخدام QIAquick كيت جل استخراج وفقا لبروتوكول ميكروسنتريفوج المتضمنةهذه المجموعة.
4. فحص المرشحين IPC لقدرتها على تضخيم باستخدام qRPA.
   1. إعداد ردود الفعل qRPA كما هو موضح في القسم 3، وذلك باستخدام HIV-1 الاشعال، تحقيقا المسمى FAM محددة إلى IPC (5'-AGG TAG TGA CAA غا ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [DT-BHQ1 ] GGT TTT GTA ATT GGA A -3)، وما مجموعه 0، 10، 10 ^2، 10 ^3، 10 ^4، 10 أو ⁵ نسخ من كل مرشح IPC في رد الفعل، واختبار جميع التركيزات في مكررة.
   2. اختيار المرشح IPC أن يضاعف معظم باستمرار ولديه أدنى حد من الكشف.
5. شارك في تضخيم HIV-1 وIPC لتحديد تركيز الأمثل للIPC DNA.
   1. وعلى غرار القسم 3، والجمع بين ما يلي في كل رد فعل 50 ميكرولتر: 29.5 ميكرولتر من العازلة الإماهة، 2.1 ميكرولتر من الجيش الوطني الرواندي من التمهيدي إلى الأمام [10 ميكرومتر]، 2.1 ميكرولتر من الجيش الوطني الرواندي التمهيدي [10 ميكرومتر] عكس، 0.6 ميكرولتر من HIV-1 HEX التحقيق -labeled [10 ميكرومتر]، 10 ميكرولترمن HIV-1 DNA بتركيزات متفاوتة، 2.5 ميكرولتر من خلات المغنيسيوم، و1 انزيم بيليه. بدلا من إضافة 3.2 ميكرولتر من المياه مجانا نوكلياز كما حدث في الخطوة 3.2.4، إضافة 0.6 ميكرولتر من التحقيق IPC FAM المسمى [10 ميكرومتر]، و 2.6 ميكرولتر من IPC DNA. استخدام تركيز IPC هذا هو الكشف عن الحد من (اللد) عندما يتم تنفيذ qRPA مع DNA IPC وحدها (اللد يعرف بأنه أقل تركيز حيث كمية توليد إشارة مضان أكبر من التي ولدت من قبل مضان المتولدة من العينات مع لا DNA الهدف).
   2. احتضان هذه العينات باستخدام بروتوكول موضح في القسم 1.1.
   3. إذا كان IPC لا تضخيم في كل عينة، والنظر في تكرار التجربة مع IPC أجل تركيز واحد من حجم أعلى. تركيز الأمثل للDNA IPC لفحص HIV-1 هو 10،000 نسخة / ميكرولتر. في حين أن العينات تعتبر صالحة إذا كان هناك أي IPC أو HIV-1 الحمض النووي التضخيم، من الناحية المثالية للIPC يسلك التضخيم كشفها لكل رد فعل.

5. بناء منحنى قياسي من تجارب متعددة

1. ضمان البيانات لتم تصدير كل تجربة لبرنامج جداول البيانات كما هو موضح في القسم 3.13.
2. فتح وتشغيل البرنامج النصي "JoVE_qRPA_standard_curve.m". تتم مطالبتك جميع المدخلات تلقائيا في إطار الأوامر. بعد يبدأ السيناريو، تتم مطالبة المستخدم تلقائيا إلى تعيين "عدد من ملفات البيانات" المستخدمة لبناء منحنى القياسية.
3. في إطار الأوامر، اكتب عدد الملفات التي ستستخدم لبناء المنحنى القياسي ودخول الصحافة.
4. اكتب في إطار الأوامر عدد العينات وعدد مكررات في كل ملف التدريب (الضغط على إدخال بعد كل إدخال).
   ملاحظة: في تخطيط لوحة المبينة في القسم 1.2، كانت هناك 6 عينات مع تركيزات مختلفة و 2 مكررات لكل عينة).
5. اكتب في إطار الأوامر أدنى DNوهناك تركيز تستخدم لبناء منحنى قياسي (في log10 نسخ) ودخول الصحافة (للتخطيط لوحة المبينة في القسم 1.2، وهو أدنى تركيز القالب هو '1' log10 نسخ).
6. اكتب في إطار الأوامر الفرق في التركيز بين كل مستوى (في log10 نسخ) ثم اضغط مفتاح الإدخال (للتخطيط لوحة المبينة في القسم 1.2، والفاصل الزمني التركيز هو '1' log10 نسخ).
7. بعد المطالبة، اكتب "عتبة المنحدر" في إطار الأوامر ثم اضغط ENTER.
8. في إطار الأوامر، اكتب "رقم (ض) الانحرافات المعيارية فوق الخلفية للعتبة إيجابية"، ثم اضغط مفتاح الإدخال. القيم النموذجية ل z مجموعة من 1 إلى 5.
9. تحديد ما إذا كانت البيانات تم جمعها باستخدام cycler الحرارية ('1')، * صور المجهر .tiff ('2')، أو * صور المجهر .JPG ('3') عن طريق كتابة رقم "1"، "2"، أو "3"، وصressing دخول.
10. اختيار لوضع عتبة IPC جديدة أو استخدام القيمة الافتراضية للعتبة عن طريق كتابة 'Y' أو 'ن' على التوالي، عند المطالبة.
11. بعد ذلك، حدد كل من ملفات جداول البيانات المستخدمة لبناء منحنى القياسية.
    ملاحظة: البرنامج النصي ثم تلقائيا استيراد البيانات HEX وFAM مضان. تحديد ما إذا كان كل رد فعل صالح (أي ما إذا كانت إشارات مضان تجاوز عتبات لHEX أو قنوات FAM)؛ تحديد معامل ص ² لالأسي، خطي، والنظام الثاني تناسب متعدد الحدود. مؤامرة "log10 نسخ مقابل عتبة دورة" لكل العينة المستخدمة لبناء منحنى القياسية. وإنشاء ملف جدول بيانات تحتوي على المتغيرات الأساسية لإعادة بناء المنحنى القياسي للتجارب التصديق دون مطالبة المستخدم إلى إعادة إدخال كل من معلمات الإدخال مرة أخرى.

6. الفحص التحقق من صحة والكمي للعينات غير محدد عن طريقالمنحنى القياسي

1. استخدام البرنامج النصي "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m" لتقدير دقة ودقة الفحص باستخدام عينات مع تركيزات معروفة أو استخدامه لقياس العينات بتركيزات غير معروفة.
   ملاحظة: لأن الأبحاث المنشورة سابقا أظهر أن نوبة الأسي حقق أفضل للتربيع r معامل ^18، هذا البرنامج النصي يستخدم لصالح الأسي ل منحنى القياسية. إذا كان المطلوب نوع مختلف من يصلح، والسيناريو يمكن تعديل وفقا لذلك.
   1. فتح وتشغيل البرنامج النصي "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m". بعد يبدأ السيناريو، تتم مطالبة المستخدم تلقائيا إدخال جميع المدخلات في إطار الأوامر.
   2. أدخل "1" للتحقق من صحة مقايسة باستخدام منحنى القياسية مع تركيزات عينة معروفة أو أدخل "2" لقياس عينات مجهولة.
   3. عند المطالبة، إما تحديد المنحنى القياسي حفظها أو بناء واحدة جديدة عن طريق إدخال عشرمعلومات البريد التي التمست تلقائيا في إطار الأوامر (نفس المعلومات المطلوبة لل"JoVE_qRPA_standard_curve.m" النصي من القسم 5).
   4. اكتب عدد من التجارب (أي ملفات جداول البيانات) لتحليل للمصادقة / الكمي.

7. التحضير لجمع البيانات باستخدام المجهر الإسفار وتشيب ساخنة

1. ضمان المجهر مضان لديه سخان مرحلة و1-قناة عالية الدقة الاستقرار تحكم في درجة الحرارة في المكان.
2. ضمان المجهر مضان لديه مكعب مرشح لإثارة وجمع مضان من كل fluorophore. إثارة وجمع مضان FAM ولدت خلال التضخيم IPC DNA من خلال مرشح GFP (الإثارة BP 470/40 نانومتر، والانبعاثات BP 520/50 نانومتر). إثارة وجمع مضان HEX ولدت خلال HIV-1 الحمض النووي التضخيم من خلال مرشح HEX (الإثارة BP 530/30 نانومتر، والانبعاثات BP 575/40 نانومتر).
3. استخدام المجهر برامج تحرير النصي لإنشاء خوارزمية الآلي لتكرار جمع البيانات على cycler الحرارية.
   1. أولا إدراج "إعدادات" خطوة لإغلاق مصراع. التالي إضافة "التعرض" خطوة لضبط التعرض إلى 60 ثانية. إدراج "عض" لتنفيذ تأخير 60 ثانية، والذي ينفذ فترة ما قبل الحضانة 1 دقيقة. إضافة "إعداد" خطوة لتغيير فريق عمل لمرشح GFP. إدراج آخر "التعرض" خطوة لضبط التعرض إلى 200 مللي ثانية. سيتم تعيين كافة التعرض باستخدام GFP أو مكعبات مرشح HEX إلى 200 مللي ثانية.
   2. بعد "التعرض" خطوة، إضافة إلى "عض" وتحديد الكاميرا التي سيتم التقاط الصورة. استخدام آخر "إعداد" خطوة لإغلاق مصراع و"حفظ الصورة" خطوة لحفظ الصورة إلى مجلد مؤقت المعرفة من قبل المستخدم.
   3. التبديل المقبل إلى المكعب مرشح HEX باستخدام آخر "إعداد" خطوة والعشرينEN إضافة "التعرض" على 200 ميللي ثانية، وهو "الانجذاب"، و "حفظ الصورة" خطوة.
   4. كرر هذه العملية 59 مرات مع تأخير الأولي و 20 ثانية بدلا من 60 (مصراع وثيق، وانتظر 20 ثانية، والتحول إلى مرشح GFP مكعب، تعيين التعرض إلى 200 ميللي ثانية، والمفاجئة، مصراع وثيق، وحفظ، والتحول إلى مرشح HEX مكعب، تعيين التعرض إلى 200 ميللي ثانية، والمفاجئة).
4. إنشاء الشريحة التي ستعقد ردود الفعل qRPA.
   1. للتجارب باستخدام المجهر، واستخدام ملف JoVE_qRPA_base.ai لقطع 40 × 15 ملم على قاعدة مستطيلة من ورقة من 1/8 "الاكريليك الاسود الكثيف باستخدام قاطع ليزر المقرر أن السلطة 100٪، وسرعة 10٪.
   2. استخدام ملف JoVE_qRPA_well.ai لخفض رد فعل جيدا تتألف من 10 × 10 مم مربع مع 5 مم قطع ثقب دائري من ورقة 1.5 مم الاكريليك واضحة سميكة.
   3. إرفاق ما يصل الى ثلاثة آبار لقاعدة واحدة باستخدام هلام superglue.
   4. بين عشية وضحاها الجاف.

8. جمع البيانات وAnalyجهاز الأمن والمخابرات باستخدام مجهر الإسفار

1. إعداد المجهر لجمع البيانات عن طريق تحميل التلقائي النصي جمع البيانات JoVE_AxioVision_Script.ziscript.
   1. ضبط سخان المرحلة إلى 48 ° C وسخن رقاقة رد فعل على سخان المسرح لحوالي 20 دقيقة. إعداد درجة حرارة 48 ° C يحافظ على درجة حرارة 39 ° C في رد فعل جيدا (لا تظهر البيانات).
   2. باستخدام الهدف NA 10X، 0.45، والتركيز على الجزء العلوي من الحافة الداخلية للتفاعل بشكل جيد مع مرشح GFP في المكان. وautofluorescent حواف الاكريليك بعد القطع بالليزر ويمكن تصور بسهولة. بعد التركيز، لا ضبط ارتفاع مرحلة المجهر حتى يتم جمع جميع البيانات.
2. تجميع مزيج الرئيسي qRPA في مساحة عمل ما قبل التضخيم المعينة كما هو موضح في الخطوة 4.5.1. لكل عينة، مزيج بيليه الانزيم، مزيج الرئيسي، وقالب DNA HIV-1 في أنبوب microcentrifuge. إضافة 2.5 ميكرولتر من خلات المغنيسيوم إلى reactio الأولن لفترة وجيزة الدوامة.
3. نقل بسرعة للأنبوب microcentrifuge تحتوي على عينة qRPA إلى مضان المجهر.
   1. ماصة بعناية 30 ميكرولتر من رد فعل الجيش الوطني الرواندي في رد فعل جيدا دون خلق فقاعات. ضع قطرة من PCR الصف الزيوت المعدنية على مدى رد فعل الجيش الوطني الرواندي لمنع التبخر.
   2. ضع البئر مباشرة تحت المجهر الهدف، مع الحرص على صورة فقط مركز البئر، وليس أي من السيارات الفلورسنت حواف الاكريليك. بعد يتم وضع جيد، تشغيل البرنامج النصي الآلي 7. السيناريو يولد صورة واحدة JPEG باستخدام فلتر مكعب FAM واحد JPEG الصورة باستخدام المكعب مرشح HEX كل 20 ثانية.
4. بعد الانتهاء من السيناريو، ونقل هذه الصور من مجلد التخزين المؤقت قبل تشغيل عينات إضافية.
   1. خلق 2 مجلدات: 1 لكل fluorophore (أي، "HEX" و "FAM '). تخزين كل المجلدات في نفس المجلد الأصل. في كل fluorophoreمجلد، إنشاء مجلد المسمى مع عدد نسخ الحمض النووي الموجودة في العينة (على سبيل المثال، 0، 10، الخ).
   2. نقل جميع الملفات مع البادئة "HEX" في المجلد الفرعي المقابل في المجلد "HEX". نقل جميع الملفات مع البادئة "GFP" في المجلد الفرعي المقابل في المجلد "FAM".
5. كرر أقسام 8،2-8،4 لردود الفعل qRPA مع 0، 10، 10 ^2، 10 ^3، 10 ^4، و 10 ⁵ HIV-1 نسخ الحمض النووي.
6. وبعد جمع البيانات لجميع العينات qRPA في تجربة، تحميل البرنامج النصي "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m." عند المطالبة من قبل البرنامج النصي، حدد المجلد الأصل الذي يحتوي على مجلدات fluorophore 2، والتي تحتوي بدورها على الصور لكل تركيز في المجلدات الفرعية.
   ملاحظة: البرنامج النصي إنشاء ملف جدول بيانات في الدليل الأصل في الذي سيتم حفظ البيانات HEX مضان في نام ورقة تلقائياسيتم حفظ إد "HEX، والبيانات FAM مضان في ورقة اسمه 'FAM". في كل ورقة، يتم سرد عدد دورة في العمود B، ويتم إعطاء البيانات مضان في الوقت الحقيقي لزيادة تركيزات القالب في الأعمدة C، D، الخ. كل مضان مسند الوقت الحقيقي هو متوسط ​​كثافة مضان من الصورة التي تم التقاطها في تلك المرحلة الزمنية.
7. استخدام وظيفة مؤامرة مبعثر الافتراضية في برنامج جداول البيانات لرسم الخلايا B2: H61 من 'HEX "وأوراق" FAM "لتصور في الوقت الحقيقي مضان وتوليد مؤامرات مماثلة لتلك في أرقام 2A، 2B، 3A، و3B.
   ملاحظة: جدول إنشاؤها في الخطوة 8.6 ويمكن أيضا أن تستخدم في البرامج النصية "JoVE_qRPA_standard_curve.m" و "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m".

Representative Results

Discussion

من أجل الحصول على بيانات القياس الكمي ذات معنى باستخدام الخوارزمية MATLAB، يجب على المستخدم تحديد قيم المدخلات المناسبة عند المطالبة. بعد بدء كل النصي في القسمين 5 و 6، والتمست كل المتغيرات الإدخال تلقائيا في إطار الأوامر ولدت مخرجات تلقائيا. في القسم 5.7 تتم مطالبة المستخدم لتحديد عتبة المنحدر. قيمة عتبة المنحدر تؤثر على مربع معامل الارتباط (ص ²⁾ من لياقتهم. عند استخدام البيانات مضان الخام المصدرة من cycler الحرارية، والقيم بين 2.0 و 5.0 تميل إلى تسفر عن ارتفاع معامل ص ^2. في القسم 5.8 يجب على المستخدم تعيين عدد من الانحرافات المعيارية فوق خلفية لضبط عتبة إيجابية. ليسجل العينة بأنها إيجابية أو سلبية، والنصي تلقائيا بتحديد _عينة الفرق Δ بين الحد الأقصى والحد الأدنى مضان لكل عينة باستخدام البيانات مضان الخام المصدرة من THERMAل cycler على. فإنه يقوم بحساب متوسط ​​الفرق Δ _{الخلفية} والانحراف المعياري σ _{الخلفية} للعينات السيطرة على جميع أي هدف. ويعتبر عينة إيجابية إذا _عينة Δ هي أكثر من ض × σ _{الخلفية} فوق Δ _{الخلفية.} في القسم 5.10 يقرر المستخدم ما إذا كان استخدام عتبة الافتراضية أو مجموعة من عتبة جديدة. إذا رغب المستخدم لضبط عتبة جديدة، وتحديد عتبة جديدة تجريبيا عن طريق إجراء التجارب 3 تحتوي كل منها على 12 ردود الفعل الجيش الوطني الرواندي دون أي HIV-1 DNA الحاضر. تعيين العتبة في متوسط ​​الزيادة في كثافة مضان من هذه التجارب زائد 3 الانحرافات المعيارية. بعد الانتهاء من القسم 6، والنصي JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m يعود تلقائيا تركيز الحمض النووي المقدرة لكل رد فعل qRPA (في log10 نسخ). إذا قرر البرنامج النصي الذي لا HIV-1 الحمض النووي كان موجودا في العينة، يتم سرد تركيز يقدر إما "نيسلبية لللفيروس نقص المناعة البشرية "أو" غير صالح "، اعتمادا على ما إذا كانت إشارة الفلورسنت لمراقبة إيجابية الداخلية تجاوزت عتبة (ض × σ _خلفية + Δ _{الخلفية).} إذا كان المستخدم التحقق من صحة منحنى القياسية مع تركيزات عينة معروفة، فإن السيناريو أيضا إرجاع جدول إضافي مماثلة لتلك التي من الجدول 1.

من أجل تطوير مقايسة الجيش الوطني الرواندي في الوقت الحقيقي التي توفر الكمي الدقيق، والاتساق التجريبية أمر بالغ الأهمية. على سبيل المثال، استخدام نفس التمهيدي والتحقيق مأخوذة لكل من المنحنى القياسي والتجارب التحقق من الصحة. أيضا تجنب تجميد أذاب دورات عن طريق تخزين التمهيدي والتحقيق aliquots في 4 ° C بين التجارب بدلا من -20 ° C. يتم تخزين مأخوذة القالب المستخدم للمنحنى والتحقق من صحة التجارب القياسية بنفس الطريقة. وتستخدم الجيش الوطني الرواندي الكريات الانزيم والكواشف من نفس الكثير وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. وأخيرا، BECAاستخدام الجيش الوطني الرواندي يفتقر إلى "دورات" حقيقية للسيطرة على وجه التحديد نسبة التضخيم، وتوحيد الخطوات المستخدم أمر لابد منه. عند تجميع ردود الفعل، يجب على المستخدم دائما اتباع نفس الخطوات في نفس الترتيب، وإنفاق ما يقرب من نفس مقدار الوقت في كل خطوة. يجب دائما أن تكون مختلطة ردود الفعل بلطف مع ماصة معلومات جديدة، ويجب دائما أن القضاء على الفقاعات. قبل التضخيم، ويجب أن تعقد ردود الفعل عند درجة حرارة ثابتة، ويجب أن تكون مستعدة دائما cycler الحرارية أو برامج المجهر قبل تحميل ردود فعل لتجنب أي التضخيم في درجات حرارة دون المستوى الأمثل التي يمكن أن تؤثر الكمي. أي تغيير في ظروف التفاعل الأولية قد يؤدي إلى التضارب في النتائج التجريبية.

عند استخدام المجهر لجمع البيانات، يجب أن يسيطر المتغيرات إضافية لتقليل التباين في كثافة مضان. يجب وضع كل ردود الفعل في نفس المنطقة على أكثر دفئا المرحلة، وmicroscoيجب أن تركز المؤسسة العامة على نفس المنطقة من البئر عن كل عينة. حتى إذا ما اتبعت هذه الممارسات، والبيانات التي تم جمعها على مضان المجهر قد تظهر التباين بسبب النقاط المضيئة المحلية التي تشكل بشكل طبيعي خلال ردود الفعل الجيش الوطني الرواندي، وتشكيل فقاعة داخل غرف رد فعل، أو photobleaching من الناتجة عن التعرض المتكرر للضوء الإثارة. تأثير هذه المتغيرات هو واضح في البيانات التي تم جمعها مضان على المجهر (أرقام 4A و 4B)، والتي تثبت تقلب خط الأساس، قمم، وأحواض. هذه الميزات هي غائبة عن البيانات التي تم جمعها مضان على cycler الحرارية (أرقام 3A و 3B). في نهاية المطاف، وجمع البيانات على المجهر هو لإثبات صحة المبدأ فقط، وسيتم تنفيذ الفحص النهائي على القارئ مضان الميدان قابلة للتشغيل مع هندسة أكثر دقة ومراقبة البرامج التي تقلل من هذه المتغيرات.

مهم آخرجانب من جوانب عملية التنمية الفحص qRPA هو الاتساق في معالجة البيانات. بروتوكول الموضحة في قسم طرق يستخدم البرامج النصية لمعالجة البيانات مضان الخام (المخزنة في ملف جدول بيانات) التي تم جمعها من cycler الحرارية أو المجهر. يجب تهيئة جميع التجارب المستخدمة لبناء منحنى معيار مماثل. عند استخدام cycler الحرارية لجمع البيانات، يجب أن تستخدم نفس تخطيط لوحة، ويجب ألا يتم تصدير البيانات من الآبار التي لا تحتوي على ردود فعل الجيش الوطني الرواندي. عند استخدام المجهر لجمع البيانات، وتنسيق البيانات يجب أن تطابق تنسيق البيانات المصدرة تلقائيا من cycler الحرارية. على سبيل المثال، يجب أن تكون البيانات لا المستهدفة التحكم في الخلايا C2: C61، والبيانات لزيادة تركيزات القالب يجب أن يكون في الخلايا D2: D61، E2: E61، وما إذا كان هناك مكررات متعددة من كل التركيز في التجربة، يجب أن يكون أمر سلسلة تخفيف 2 ^{الثانية} تكرار اليسار إلى اليمين من أي سيطرة الهدف (NTC) إلى أعلى تركيز والمحفوظة في الأعمدة مباشرة على يمين من ^شارع 1 تكرار سلسلة التخفيف. على سبيل المثال، في تخطيط لوحة المستخدمة في القسم 1.2 مع 2 يعيد لكل عينة، يجب أن يتم حفظ البيانات مضان لتكرار 1 من كل عينة في سلسلة التخفيف في الخلايا C2: البيانات H61 ومضان لتكرار 2 من كل عينة في يجب أن يتم حفظ سلسلة التخفيف في الخلايا I2: N61. لتخطيط لوحة المستخدمة في القسم 1.2، وهذا هو تنسيق عند تصدير البيانات من برنامج cycler الحرارية إلى جدول بيانات افتراضي.

بيانات تمثيلية المقدمة من التجارب HIV-1 qRPA تثبت إثبات صحة مفهوم الدعم الذي RPA يمكن أن تستخدم لتقدير تركيز الحمض النووي في عينات مجهولة. مفيدة سريريا HIV-1 اختبارات الحمل الفيروسي لديها مجموعة السريري من 4 على الأقل من حيث الحجم، ودقة 0.5 log10 نسخ، والكشف عن الحد من بين 200 نسخة على الأقل ^19،20. فحص الحمض النووي HIV-1 وصف يلبي هذه كرiteria و هو الأكثر دقة في تركيزات منخفضة، كما هو مبين في الجدول 1. لذلك، مع إدراج خطوة الناسخ العكسي، وتشير هذه النتائج إلى أن مقايسة HIV-1 RT-الجيش الوطني الرواندي قد لديها القدرة على قياس HIV-1 الحمل الفيروسي في العينات السريرية. عند وضع مقايسة qRPA، وتعديل المعلمات الخوارزمية قد ضبط الحساسية والخطية النطاق الديناميكي اعتمادا على الاحتياجات السريرية. الشكل يدل على أن تعديل 6 ض (معلمة الذي يحدد الحد الأدنى لعينات إيجابية) يمكن أن تؤثر على حساسية ودقة في المنخفضة والعالية تركيزات الهدف. وعلاوة على ذلك، قد يكون من الممكن زيادة دقة ودقة القياس الكمي التي يحتضنها ردود الفعل عند درجة حرارة أقل أو باستخدام أقل خلات المغنيسيوم، مما يقلل من نسبة التضخيم.

هذا دليل على مفهوم qRPA الفحص يمكن استخدامها لقياس تركيز العينات التي تحتوي على HIV-1 الحمض النووي. الفحص qRPA الموضحة في هذه أماهيشمل nuscript تعليمات مفصلة حول كيفية تجميع ردود فعل الجيش الوطني الرواندي في الوقت الحقيقي، وتطوير وفحص وIPC، ومعالجة البيانات مضان الخام لبناء منحنى القياسية التي يمكن استخدامها لقياس عينات مجهولة. مع تضمنت تعليمات مفصلة، ​​يمكن تكييفها هذا البروتوكول لقياس تركيز الحمض النووي في طائفة واسعة من العينات.

Materials

qRPA Assay
HIV-1 forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3’ 
HIV-1 reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3’ 
HIV-1 probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3’ 
IPC probe	BioSearch Technologies 	custom DNA oligos	5’-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3’
RPA exo reagents (pellets, rehydration buffer, magnesium acetate	TwistDx	TwistAmp exo
PCR tube strips	BioRad	TLS0801
PCR flat cap tube strips	BioRad	TCS0803
Micro-seal adhesive	BioRad	558/MJ 
HIV-1 target (pHIV-IRES- eYFPΔEnvΔVifΔVpr)			custom plasmid, see: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Characterization and detection of artificial replication-competent lentivirus of altered host range. Molecular Therapy 8, 118–129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).
Human male genomic DNA	Applied Biosystems	360486
96 well cold-block	Cole Parmer	EW-36700-48
Thermal cycler	BioRad	CFX96
MiniFuge	VWR	93000-196
Vortex	VWR	58816-121
Tris buffer 1.0 M, pH 8.0	EMD Millipore	648314
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Promega	V4321
Nuclease free water	Ambion	AM9937
IPC Development
Cryptosporidium parvum IPC template	Waterborne Inc	P102C	It is also possible to order a double stranded synthetic target from IDT if the user is unequipped to work with C. parvum (a BSL-2 infectious agent). PCR and RPA primers for C. parvum were designed using GenBank accession number AF115377.1
PCR long forward primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3’
PCR long reverse primer	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos	5’- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3’
Phusion High-Fidelty DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
TAE 10X buffer	EMD Millipore	574797
Agarose	Sigma Aldrich	A9539
Microscope Experiments
Upright fluorescence microscope	Zeiss	Zeiss Imager.J1
Stage heater	Bioscience Tools	TC-GSH
1-Channel Precision High Stability Temperature Controller	Bioscience Tools	TC-1100S
FAM/GFP filter cube	Zeiss	filter set 38 (000000-1031-346)	excitation BP 470/40 nm, emission BP 520/50 nm
HEX filter cube	Chroma	49014	excitation BP 530/30 nm, emission BP 575/40 nm
Laser cutter	Engraver's Network	VLS3.60
1/8" black acrylic	McMaster Carr	8505K113
1.5 mm clear acrylic	McMaster Carr	PD-72268940 
Super glue	Office Depot	Duro super glue 
PCR grade mineral oil	Sigma Aldrich	M8662-5VL
Data Analysis
Microsoft Excel	Microsoft
MATLAB	MATLAB
MATLAB script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m”	Included in SI
MATLAB script: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m”	Included in SI
Adobe Illustrator	Adobe
JoVE_qRPA_well.ai	Included in SI
JoVE_qRPA_base.ai	Included in SI
AxioVision software	Zeiss
JoVE_AxioVision_Script.ziscript	Included in SI