Method Article

بسيط Multiwell تصلب الفحص لدراسة الردود خلية تصلب التي تعتمد على أساس بولي أكريلاميد

DOI:

10.3791/52643

⸱

March 25th, 2015

 ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم وصف طريقة تتيح التحضير السريع والفعال وغير المكلف للمواد الهلامية بولي أكريلاميد في شكل لوحة متعددة الآبار. لا تتطلب الطريقة أي معدات متخصصة ويمكن اعتمادها بسهولة من قبل أي مختبر بحث. سيكون مفيدا بشكل خاص في الأبحاث التي تركز على فهم استجابات الخلايا المعتمدة على الصلابة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> حاليا ، يتم إجراء معظم أبحاث الخلايا في المختبر على البوليسترين لزراعة الأنسجة الصلبة (~ 1 GPa) ، بينما ترتبط معظم الخلايا في الجسم بمصفوفة مرنة وأكثر نعومة (0.1 - 100 كيلو باسكال). نظرا لأن عدم تطابق الصلابة هذا يؤثر بشكل كبير على استجابات الخلايا ، فهناك اهتمام قوي بتطوير مواد هيدروجيل تمتد على نطاق واسع من الصلابة لتكون بمثابة ركائز للخلايا. المواد الهلامية بولي أكريلاميد ، وهي غير مكلفة وتغطي نطاق صلابة جميع الأنسجة الرخوة في الجسم ، هي الهيدروجيل المفضل للعديد من المجموعات البحثية. ومع ذلك ، فإن تحضير جل بولي أكريلاميد طويل وممل ومناسب فقط للدفعات الصغيرة. هنا ، نصف الاختبار الذي من خلال استخدام فيلم بلاستيكي مرن دائم كدعم هيكلي للمواد الهلامية ، يتيح تحضير المواد الهلامية بولي أكريلاميد في شكل لوحة متعددة الآبار. هذه التقنية أسرع وأكثر كفاءة وأقل تكلفة من الطرق الحالية وتسمح بإعداد المواد الهلامية ذات الأحجام المخصصة غير المتوفرة بطريقة أخرى. نظرا لأنها لا تتطلب أي معدات متخصصة ، يمكن اعتماد هذه الطريقة بسهولة من قبل أي مختبر بحثي وستكون مفيدة بشكل خاص في الأبحاث التي تركز على فهم استجابات الخلايا المعتمدة على الصلابة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معظم الأنسجة في الجسم هي المواد اللزجة لينة مع معامل يونج (أ) تتراوح من 0.1 كيلو باسكال لالدماغ إلى 100 ​​كيلو باسكال لالغضاريف لينة، وبعد، ويجري أكثر في أبحاث الخلايا المختبر على البوليسترين زراعة الأنسجة (TCP) التي لديها معامل ~ 1 جيغا 1 عدم التطابق هذا صلابة يؤثر بشكل كبير على طريقة الخلايا تستجيب لبيئتها. وهناك مجموعة متزايدة من البحوث بالتالي مخصص لتوضيح تأثير الركيزة صلابة على مصير مختلف أنواع الخلايا، بما في ذلك 2،3 الخلايا الجذعية. 4 ونتيجة لذلك، تم وضع الهلاميات المائية متعددة للمساعدة في فهم خلية تعتمد على صلابة علم الأحياء بما في ذلك بولي أكريلاميد (PA) و5-7 البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، 8،9 ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS)، و 10 والجينات. 11 في حين أن الأدلة التي الركيزة صلابة لديها تأثير كبير على مصير الخلايا ينمو، ويتم إجراء معظم الدراسات على نطاق ضيق مع عدد صغير من الصورةamples. منهجية، ودراسات متعددة الأبعاد على تأثير الركيزة صلابة لمجموعة من أنواع الخلايا أو الظروف البيئية نادرة. 12

وقد تم تطوير العديد من التقنيات هيدروجيل عالية الإنتاجية الواعدة، بما في ذلك ميكروأرس تستند PEG، 13 ميكروفلويديك الأجهزة لإنتاج ميكروبيدات الاغاروز هيدروجيل، 14 أو الجزئي والنانو قضبان حيث التضمين صلابة من قبل قطر والارتفاع من microrods. 15 ولكن وتكنولوجيات إعداد مثل هذه ركائز هي متطورة والمتاحة لعدد محدود من المختبرات. الكثير من البحوث التي تنطوي على صلابة التضمين استجابات الخلايا يستخدم بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية التي ليست فقط غير مكلفة وبسيطة لتنفيذ، ولكن أيضا يحمل مجموعة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من معامل يونج، وهي 0.3 - 300 كيلو باسكال 16-22 ومع ذلك، الأساليب القائمة لافتعال PA المواد الهلامية للثقافة الخلية هي كثيفة العمالة وبالتالي الإعداديةعرب كورب في دفعات صغيرة. بعض الصعوبات المرتبطة إعداد المواد الهلامية السلطة الفلسطينية بمثابة ركائز الخلايا الجذعية من شرط أن المواد الهلامية يجب أن يكون مستعدا: 1) في غياب الأكسجين للسماح البلمرة كاملة، 2) مع سطح مستو وناعم للسماح خلية موحدة المرفقات ونشر، و3) الملصقة بشكل دائم إلى أسفل الطبق الثقافة الخلية لمنع العائمة.

وقد حاولت عدة مجموعات لإنتاج المواد الهلامية السلطة الفلسطينية لزراعة الخلايا على دفعات كبيرة. زملر وآخرون أوراق سميكة مستعدة من المواد الهلامية السلطة الفلسطينية التي كانت ثم "قطع" مع لكمة ثقب وضعها في لوحات 96-جيدا. 23 ومع ذلك، هذا الأسلوب يقتصر على المواد الهلامية أشد، أي> 1 كيلو باسكال في معامل يونج، ليونة المواد الهلامية هي "لزجة"، من الصعب قطع، وتلف بسهولة. MIH وآخرون بتطوير تقنية أكثر تطورا والذي يسمح المواد الهلامية ليتم بلمرة مباشرة في لوحة من الزجاج السفلي multiwell. 6 وقد تحقق ذلك عن طريق سكب الحلول هلام في لوحات من الزجاج السفلي بين functionalized وتشكيل المواد الهلامية التي كتبها "يقحم" لهم مع مجموعة ساترة مخصصة. و6 على الرغم من واعدة جدا، والآثار تفوق طفيف لا يزال لوحظ مع هذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب هذه التقنية مجموعة مصمم خصيصا لا يمكن الوصول إليها على الفور إلى العديد من المختبرات وكذلك من الزجاج السفلي مكلفة لوحات multiwell.

وتصف هذه الورقة طريقة بسيطة وغير مكلفة لتجميع المواد الهلامية للسلطة الفلسطينية في لوحة multiwell التي يمكن اعتمادها بسهولة من قبل أي مختبر. هنا، ويستخدم على الدعم من البلاستيك المرن الذي له وجهان - واحد مسعور، وهو طارد للالهلام السلطة الفلسطينية، واحد ماء، الذي يربط تساهميا هلام السلطة الفلسطينية على الترسيب. مرة واحدة يتم إيداع أوراق هلام السلطة الفلسطينية وبشكل دائم الملصقة على الدعم من البلاستيك المرن، فإنه يمكن التعامل مع المواد الهلامية من أي سمك أو تصلب وقطع لهم في أي شكل المطلوب. هذا approach تنتج ليس فقط مخصصة "coverslips" بلاستيكية بأحجام لا خلاف المتاحة تجاريا، ولكن أيضا يغني عن ضرورة إلى ما قبل علاج الواجهات الزجاجية، إما coverslips الزجاج أو الآبار من الزجاج السفلي مكلفة لوحات multiwell، مع حل السلطة الفلسطينية ملزم، وهو ومملة وخطوة تستغرق وقتا طويلا. وأخيرا، وصحائف والمواد الهلامية PA موحدة يمكن أن تكون على استعداد في دفعات كبيرة وتخزينها دي رطب لعدة أشهر.

وباختصار، فإن فحص المقدمة هنا هو تحسنا الطرق القائمة في عدة جوانب. أولا، عملية لوحة التجمع multiwell هي كفاءة، والتكلفة الإجمالية للمواد المطلوبة منخفضة. ثانيا، يتم إنتاج الهلاميات المائية في دفعات كبيرة في فيلم هلام متجانس واحد. وأخيرا، يطلب من المواد فقط التي هي متاحة تجاريا. وتتجلى فائدة الفحص من خلال استكشاف تأثير الركيزة صلابة على مورفولوجيا الخلايا ونشر المنطقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الحلول ومأخوذة هيدروجيل المصاحب

  1. إعداد الحل بولي أكريلاميد هلام السلائف.
    1. إعداد بولي أكريلاميد حل هلام السلائف عن طريق خلط مادة الأكريلاميد (A) (40٪ ث / ت، M ص 71.08 جم / مول)، وbisacrylamide crosslinker (B) (2٪ ث / ت، ص M 154.17 جم / مول)، واجتثاث الماء المؤين في نسب حجم المحددة في الجدول 1.
      ملاحظة: هذه الحلول يمكن إعداد في دفعات كبيرة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر.
      1. تنبيه: الأكريلاميد سامة عند استنشاق أو ابتلاع، ولا سيما عندما تكون في شكل مسحوق: وهكذا، ويفضل استخدام 40٪ ث / ت حل للحد من مخاطر سمية. التعامل فقط في حين يرتدي ملابس واقية، مثل القفازات، ونظارات واقية، ومعطف المختبر. متجر في، حاوية مغلقة بإحكام مقاومة للضوء في الثلاجة (<23 ° C، منطقة جيدة التهوية).
      2. تنبيه: مكرر الأكريلاميد السامة على استنشاق أو ابتلاع، بشكل خاص،عندما تكون في شكل مسحوق: وهكذا، ويفضل استخدام 2٪ ث / ت حل للحد من مخاطر سمية. التعامل فقط في حين يرتدي ملابس واقية، مثل القفازات، ونظارات واقية، ومعطف المختبر. متجر في، حاوية مغلقة بإحكام مقاومة للضوء في الثلاجة (<4 ° C، منطقة جيدة التهوية).
  2. إعداد واستخدام N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (سلفو-SANPAH، M ص 492.40 جم / مول) مأخوذة. تنبيه: سلفو-SANPAH يسبب تهيج العين الشديد؛ التعامل مع قفازات والعين السليمة أو حماية الوجه. تخزينها في -20 ° C عند استلام وقبل aliquoting.
    1. لتخزين سلفو-SANPAH: حل سلفو-SANPAH في dimethylsulfoxane (DMSO) في 50 ملغ / مل. قسامة الحل الأسهم إلى 50 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 20 ميكرولتر في الأنبوب. تجميد فلاش على الثلج الجاف أو في النيتروجين السائل (خطوة اختيارية لكنه فضل الحفاظ على أقصى قدر من الكفاءة crosslinker) وتخزينها في -80 ° C.
      ملاحظة: مأخوذة كاليفورنيان خزنها لعدة أشهر.
    2. لاستخدام سلفو-SANPAH: ذوبان الجليد في قسامة لفترة وجيزة وتمييع في 480 ميكرولتر من دي المتأينة المياه. استخدامها على الفور. سلفو-SANPAH hydrolyzes بسرعة في الماء: ولذا أخذ الحيطة والحذر على أداء جميع الخطوات المذكورة أعلاه بسرعة.
  3. إعداد فوق كبريتات الأمونيوم (M ص 228.18 جم / مول) مأخوذة.
    ملاحظة: فوق كبريتات الأمونيوم تسبب العين والجلد وتهيج في الجهاز التنفسي. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع. التعامل مع مسحوق فوق كبريتات الأمونيوم في غطاء الدخان الكيميائية. مسحوق تخزينها في مكان جاف وجيد التهوية. مرة واحدة aliquoted، يمكن استخدام محلول مخفف على مقاعد البدلاء العمل.
    1. حل بيرسلفات الأمونيوم في الماء منزوع الأيونات لتحقيق النهائي تركيز فوق كبريتات الأمونيوم 10٪ ث / ت. قسامة وتخزينها في -20 ° C. ذوبان الجليد مباشرة قبل الاستعمال.
  4. إعداد الكولاجين النوع الأول حل.
    1. إعداد 0.2 ملغ / مل حل الكولاجين عن طريق تمييع السهم حتىlution في الفوسفات 1X مخزنة المالحة (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.4. تخزين على الجليد لفترة وجيزة أو استخدام فور التخفيف.

2. هيدروجيل إعداد (راجع الشكل 1)

  1. إعداد الشرائح الزجاجية مسعور.
    1. ضع بضع قطرات من محلول مسعور على طبق من الزجاج واستخدام المناديل الورقية لنشر عبر السطح. السماح الهواء الجاف ويمسح بقطعة المناديل الورقية مرة أخرى على استقامة طلاء مسعور.
      ملاحظة: مخزن حل مسعور في خزانة قابلة للاشتعال في RT. ارتداء معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع. العمل في منطقة جيدة التهوية.
  2. إعداد دعم بلاستيكية مرنة.
    1. خفض الدعم بلاستيكية مرنة لتتناسب مع حجم لوحة من الزجاج مسعور المغلفة.
    2. بمناسبة الجانب مسعور من الدعم من البلاستيك المرن من الخدش طفيفة السطح مع أداة حادة مثل مشرط.
      ملاحظة: مرة واحدة في هلام - التي تكون شفافة تماما - يجف، فإن علامات خدش تساعد التمييز الذي يحتوي على مرونة الجانب دعم البلاستيك هلام.
      ملاحظة: الدعم من البلاستيك المرن لديه مسعور والجانب ماء. مرة واحدة المودعة، بولي أكريلاميد تلتزم بشكل دائم إلى الجانب ماء من الدعم من البلاستيك مما يسهل سهولة التعامل هيدروجيل لاحق.
  3. تحضير هلام (يتم إعطاء كميات سبيل المثال لمدة 5 مل حلول هلام السلائف).
    ملاحظة: سوف 5 مل تكون كافية لإنتاج المواد الهلامية ~ 40 عندما هلام سمك الأولي هو 0.5 ملم. يمكن أن تنتج عن المواد الهلامية إذا تم تخفيض سمك هلام.
    1. وضع 4972.5 ميكرولتر من حل السلائف بولكرلميد من المطلوب التركيز النهائي (الجدول 1) إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. وضع في غرفة التفريغ لمدة 30 دقيقة مع غطاء فتحه.
      ملاحظة: أعمال الأكسجين كما فخ الجذور الحرة وعندما تكون موجودة، فإنه يمنع البلمرة.
    2. إضافة 25 ميكرولتر من 10٪ ث / ت فوق كبريتات الأمونيوم (يرجى الرجوع إلى نقطة 1.3) لتحقيق نهائيالأمونيوم تركيز بيرسلفات من 0.05٪.
    3. إضافة 2.5 ميكرولتر من N، N، N '، tetramethylethylenediamine N'- (TEMED، M ص 116.24 جم / مول) في حل هلام نزع الغاز لتحقيق تركيز TEMED النهائي من 0.5٪.
      ملاحظة: مخزن TEMED في خزانة قابلة للاشتعال في RT. التعامل في غطاء الدخان الكيميائية عند ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. تبقي مغلقة بإحكام تحت غاز خامل، كما هو درجة عالية من الهواء والرطوبة الحساسة.
    4. مزيج الحل بلطف بواسطة pipetting صعودا وهبوطا 3-5 مرات. لا دوامة لتجنب انتشار الأوكسجين في حل هلام السلائف.
    5. ماصة الحل الهلام على الجانب ماء من الدعم من البلاستيك المرن وساندويتش مع مسعور المغلفة شريحة زجاجية. فصل الشرائح مع اثنين من الفواصل السيليكون من سمك المطلوب (على سبيل المثال، 0.5 ملم). ترك كمية صغيرة (~ 100 ميكرولتر) من الحل البوليمر السلائف في 50 مل أنبوب مخروطي لاستخدام كمؤشر على دبق.
      ملاحظة:ويمكن استخدام أي فاصل. على سبيل المثال، وهو شريط واحد من بارافيلم يعطي سماكة هلام تورم النهائي من 100-120 ميكرون.
    6. وضع لوحة زجاجية أخرى فوق مرونة البلاستيك دعم / هلام شطيرة للتأكد من سطح حتى هيدروجيل على البلمرة.
    7. السماح للهلام تتبلمر لمدة 45 دقيقة، على الرغم من أن أقل وقت يمكن أن تستخدم في المواد الهلامية من أعلى٪ بالوزن اذا شئت. للتأكد من أن الجل وبلمرة، ومراقبة الحل المتبقية في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إذا كان قد تبلور الحل المتبقية، فمن المرجح أن دبق على لوحة من الزجاج وقد بدأت كذلك. ومع ذلك، لاحظ أن افتتاح سابق لأوانه من العفن سيمنع البلمرة كاملة.
    8. مرة واحدة يتم تشكيل هلام، تقشر دعم البلاستيك المرن مع هلام بولي أكريلاميد المرفقة تساهميا على القمة، ووضع جل جنبا إلى الهواء الجاف.
      ملاحظة: يمكن أيضا الحراري أو التجفيف بالحرارة استخدامها لتسريع هذه الخطوة. جفت مرة واحدة على الدعم من البلاستيك المرن، يمكن أن يكون جل متجرد إلى أجل غير مسمى.
      1. بمناسبة أي بقع عارية من الدعم بلاستيكية مرنة، حيث المواد الهلامية بولي أكريلاميد لم تشكل بسبب الفقاعات. علامة في حين أن جل ما زال رطب حيث سيؤدي ذلك إلى مزيج بدعم البلاستيك المرن مرة واحدة هلام جاف.

3. Multiwell الجمعية اللوحة، طلاء الكولاجين، والتعقيم

  1. التجمع لوحة Multiwell.
    1. جفت مرة واحدة، وقطع المواد الهلامية السلطة الفلسطينية إلى الأشكال المطلوبة.
      1. لوحة 96-جيدا، واستخدام الثقيلة لكمة ثقب بقطر ~ 6 ملم. استخدام ورقة القاطع الثقيلة لخفض المواد الهلامية إلى أشكال مربعة أو مستطيلة. بدلا من ذلك، استخدم المقص.
    2. إعداد ما يقرب من 500 ميكرولتر من PDMS في لوحة 96-جيدا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لالغراء المواد الهلامية إلى الجزء السفلي من لوحة multiwell، ضع قطرات صغيرة (~ 5 ميكرولتر) من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) في وسط كل بئر. باستخدام ملقط، ضع polyacrylamid واحدهلام الإلكترونية في كل البلاستيك جيدا ومرنة دعم الجانب السلبي. للسماح PDMS لعلاج، وترك لوحة تجميعها عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات.
  2. الكولاجين طلاء المواد الهلامية بولي أكريلاميد.
    1. مع ماصة نقل، ضع كمية صغيرة (7-8 ميكرولتر) من سلفو-SANPAH (يرجى الرجوع إلى نقطة 1.2.2) في كل بئر ودوامة من جانب إلى آخر لمعطف سطح هلام بالتساوي. العمل على وجه السرعة منذ سلفو-SANPAH ليست مستقرة في الماء.
    2. وضع لوحة بشكل جيد في ظل كثافة عالية مصباح الأشعة فوق البنفسجية (كثافة = 37 ميغاواط، λ = 302-365 نانومتر) لمدة 5 دقائق. شطف المواد الهلامية مع برنامج تلفزيوني لإزالة الزائد سلفو-SANPAH.
    3. ماصة 50 ميكرولتر من 0.2 ملغ / مل الكولاجين النوع الأول حل (يرجى الرجوع إلى نقطة 1.4) في كل بئر. ترك لوحة تغطيتها على RT لمدة 2 ساعة على الأقل أو O / N عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لتسريع عملية الكولاجين الطلاء، وماصة نقل يمكن استخدامها لإضافة محلول الكولاجين. عادة، 1 - 2 ينبغي قطرات من محلول تكون كافية لإكماللاي تغطية سطح هلام.
    4. ترك لوحة جيدا في RT لمدة 2 ساعة على الأقل للسماح الكولاجين الترابط.
    5. شطف مع برنامج تلفزيوني لإزالة حل الكولاجين الزائد وتعقيم تحت الأشعة فوق البنفسجية (λ = 200 نانومتر) في الثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة لمدة 2 ساعة.
    6. نقع المواد الهلامية في المتوسط ​​كاملة (راجع القسم 4.1 لتكوين المتوسط) O / N لترطيب وتتوازن. استخدام للخلية البذر مباشرة أو تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى 2 أيام.

4. البذر الخلية على السلطة الفلسطينية تصلب الفحص

ملاحظة: على الرغم نموذجية للخطوط الخلايا الثديية مشتركة، يتم استخدام بروتوكول المبينة في هذا القسم تحديدا مع سرطان الثدي خط الخلية MDA-MB-231 (انظر الأرقام 4 و 5).

  1. جمع الخلايا من نسيج الثقافة قارورة عن التعرض إلى 5٪ التربسين / EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. استخدام ~ 80 ميكرولتر من التربسين / EDTA لكل سم 2 من منطقة قارورة الثقافة. على سبيل المثال، استخدام 2 مل من التربسين / EDTA FOرا T25 زراعة الخلايا القارورة. اعادة تعليق الخلايا التي تم جمعها في المتوسطة كاملة تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في تركيز الخلية النهائي المطلوب. مع الأخذ بعين الاعتبار خلية مضاعفة الوقت وكذلك طول الفترة الزمنية سيتم المصنف الخلايا على الفحص، واختيار التركيز المناسب خلية فرعية متموجة. ضمان المتوسطة أضاف يكفي لغمر تماما الهلاميات المائية.
    ملاحظة: منذ الهلاميات المائية تم قبل معايرتها في وسائل الإعلام (راجع الخطوة 3.2.6) 100 حجم ميكرولتر يجب أن تكون كافية. يجب أن أحجام المتوسطة المعتادة المستخدمة في لوحات multiwell تكون كافية منذ المواد الهلامية تم قبل معايرتها في وسائل الإعلام في الخطوة السابقة.
    ملاحظة: إن الفحص تكون مناسبة لأي نوع من الخلايا التي تعتمد على المرفق.
    1. عد عدد الخلايا تحت مجهر مقلوب باستخدام عدادة الكريات. تحميل 10 ميكرولتر من تعليق خلية في كل ميناء عدادة الكريات ومتوسط ​​عدد خلايا من لا يقل عن 8 أجزاء. للحصول علىتركيز الخلية النهائي، مضاعفة عدد خلايا بنسبة 10 4.
      ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج عدد خلايا عند عدد الخلايا في كل رباعي عدادة الكريات هو 20-50.
  2. ثقافة الخلايا على صلابة فحص PA في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. تغيير وسائل الاعلام كل 2 - 3 أيام. جمع الخلايا عند الحاجة عن طريق التعرض إلى 5٪ التربسين / EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. استخدام ~ 80 ميكرولتر من التربسين / EDTA لكل سم 2 من زراعة الأنسجة قارورة. خلال جميع الخطوات التلاعب خلية، ورعاية خاصة لا لتعطيل سطح هيدروجيل: نضح أو ماصة المتوسطة التي كتبها البقشيش قليلا لوحة multiwell جانبية ولمس طرف ماصة على الجدار الجانبي من كل بئر، خلافا للمس هيدروجيل.
    ملاحظة: باستثناء لرعاية خاصة لا تتلف سطح هيدروجيل خلال معيار التعامل زراعة الأنسجة، المصنفة الخلايا على فحص صلابة يمكن التلاعب بها بنفس الطريقة كما لو كانت المصنفة علىإلى لوحة multiwell العادية.

5. التصوير من خلايا المصنف على السلطة الفلسطينية تصلب الفحص

  1. خلايا صورة مباشرة على صلابة مقايسة السلطة الفلسطينية.
    ملاحظة: أي المجهر - مقلوب، الفلورسنت، أو متحد البؤر، ويمكن استخدامها لتصوير الخلية.
    ملاحظة: الدعم من البلاستيك المرن المستخدمة لبناء فحص صلابة شفافة تماما ولا autofluoresce أو تتداخل مع التصوير الخلية. ومع ذلك، على الرغم من أن الدعم من البلاستيك المرن في حد ذاته هو شفاف وقدرات التصوير سوف تكون محدودة بسبب المسافة عمل الهدف. الدعم البلاستيكية مرن يحتوي على سمك 0.23 مم والمسافة العمل نموذجية من هدف 10X هو ~ 4 مم، وخفض حاد لتكبير أعلى.
    1. لتصوير الخلايا الحية، موقف السلطة الفلسطينية تصلب فحص في حامل لوحة المجهر والصورة. إبقاء جلسات التصوير تحت 2 ساعة، أو استخدام المجهر مجهزة غرفة البيئية لأوقات التصوير أطول.
    2. عندما يعيش ايم خليةالشيخوخة ليست الهدف، وتحديد الخلايا في 4٪ محلول الفورمالديهايد تستكمل مع 0.1٪ المنظفات. نقع الخلايا في تثبيتي في RT مدة لا تقل عن 2 ساعة. شطف مع PBS مرتين. تجاهل تثبيتي النفايات في حاوية النفايات المعينة.
      ملاحظة: خلايا يمكن تصوير فورا أو تخزينها المغمورة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع. تنبيه: الفورمالديهايد سامة عند استنشاق والاتصال. التعامل مع القفازات في غطاء الدخان الكيميائية.
      ملاحظة: خلية بروتوكول تثبيت لابد من اختياره بناء على تلطيخ الخلايا والتعامل مع البروتوكولات اللاحقة، لأن بعض مثبتات تلف بعض البروتينات الخلية.
    3. للتصوير الفلورسنت، وصمة عار الخلايا مع المطلوب وصمة عار الخلايا مباشرة في لوحة multiwell الثابتة. الصورة فورا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم بولي أكريلاميد (PA) الهلاميات المائية على نطاق واسع لاختبار استجابات الخلايا التي تعتمد على صلابة. 17،24 بواسطة خلط تركيزات مختلفة من مادة الأكريلاميد (A) ومكرر الأكريلاميد (B) واحد يمكن أن تجعل المواد الهلامية السلطة الفلسطينية التي تغطي مجموعة وتصلب الأنسجة اللينة في معظم الجسم - 0.3 -.. 300 معامل كيلو باسكال يونغ 1 ومع ذلك، وإعداد المواد الهلامية بولي أكريلاميد هو مملة ومضيعة للوقت، وغالبا ما تحد من فائدتها في تطبيقات "عالية الإنتاجية" مثل لفحص سبي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المواد الهلامية بولي أكريلاميد، وضعت أصلا لالكهربي، 28 تستخدم الآن بشكل روتيني بمثابة ركائز ثقافة الخلية لدراسة آثار الركيزة صلابة على مورفولوجيا الخلايا، حركية، والاتصالات 3،24،29 بين خصائص الخلايا الأخرى. بولي أكريلاميد يسمح التلاعب الركيزة صلابة ليشمل صلابة من جميع الأنسجة الرخوة في الجسم (0،3 حتي 300 كيلو باسكال) 1 مع تغيير بسيط في تركيز البوليمر السلائف (الشكل 2، الجدول رقم 1، وانظر أيضا المراجع 17،25،26). إلى جانب ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من خلال أموال بدء التشغيل المقدمة للدكتورة سيلفيا زوستياك من قبل جامعة سانت لويس وكذلك من خلال منحة صندوق أبحاث الرئيس (PRF) الممنوحة للدكتورة سيلفيا زوستياك من جامعة سانت لويس. نشكر نافيد أحمد وكيفال شاه على المساعدة الفنية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments نوع Software الغازات

<قوي>الكواشف < / قوي>
40٪ أكريلاميدBio-Rad161-0140
2٪ ثنائي أكريلاميدBio-Rad161-0142
الأمونيوم بيرسولفاتBio-Rad161-07000
TEMEDSigma AldrichT9281
Sulfo-SANPAHThermo Scientific22589
الكولاجين 1 ، من ذيل الفئران ، 3.68 مجم / ملBD Biosciences354236
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) فيشرScientificBP231-100
محلول مسعور &# 8212 ؛ صد سيلانجي إي للرعاية الصحية للعلوم الحيوية17-1332-01
PBS (1x) ، درجة الحموضة 7.4HyCloneSH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]Elsworth Adhesives3097358-1004
Tyrpsin / EDTA (10x)Sigma Aldrich44174
RPMI-1640 متوسط (1x)HyCloneSH30027-02
مصل الأبقار الجنينيHyCloneSH30073-03
البنسلين ستربتومايسينMP Biomedicals1670046
المنظفات: Triton-XSigma AldrichT8787
الفورمالديهايد 37٪ محلولSigma AldrichF1635
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma AldrichA2153
مجموعة حجب التصاق الخلية القائمة على BSA &# 8212; مجموعة مصفوفة التصاق الخلايا ECMChemicon InternationalECM540
معدات المختبر التي يمكن التخلص منها< / دعم بلاستيكي قوي >
مرن &# 8212 ؛ فيلم GelBond PAG للمواد الهلامية بولي أكريلاميدGE Healthcare Bio-Sciences309819
ألواح زجاجيةSlumpysGBS4100SFSL
50 مل أنابيب مخروطيةفيشرScientific 3181345107
15 مل أنابيب مخروطيةFALCON352097
أنابيب الطرد المركزيالدقيقة فيشر ساينتفيك2 مل: 02681258
صفيحة 96 بئر (قاع مسطح)فيشر ساينتفيك12565501
الماصات التي تستخدم لمرة واحدة (1  مل ، 2   ؛ مل ، 5   ؛ مل ، 10   ؛ مل ، 25   ؛ مل ، 50   ؛ مل)فيشر ساينتفيك1 مل: 13-678-11 ب ، 2 & nbsp ؛ مل: 05214038 ، 5   ؛ مل (FALCON): 357529 ، 10 & nbsp ؛ مل: 13-678-11E, 25  مل: 13-678-11, 50  مل: 13-678-11F
ماصات نقل الزجاجفيشر Scientific5 3/4 ": 1367820A ، 9 ": 136786B
أطراف الماصة (1-200   ؛ μ ل, 101-1000  μ ل)فيشر العلمي2707509
البلاستيك القياسي نقل الماصات المتاحفيشر Scientific13-711-9D
ParafilmPARAFILM & nbsp ؛PM992
قفازات الفحص الخالية من المسحوقQuest92897
فواصل السيليكون &# 8212 ؛ لوح سيليكون ، بسمك 0.5 مم / 13 سم × 18 سمGrace Bio-LabsJTR-S-0.5
<قوي> معدات مختبر كبيرة / غير قابلة للتصرف < / قوي >
خفيف ودقيق (Axiovert 200M)Zeiss3820005619
MicroscopeZeissAxioVision Rel. 4.8.2
فرن الأشعة فوق البنفسجيةUVITRONUV1080
غرفة الفراغ / مزيل الغازمضخة فراغ BelArt999320237
لمزيلKNFLab 5097482
غطاء ثقافة الأنسجةNUAIRENU-425-600
غطاء الدخان الكيميائيKEWAUNEE99151
مجهر مقلوب (Axiovert 25)حاضنة 663526
Zeiss NUAIRENU-8500
شركة Pipette AidDrummond ScientificP-76864
مقياس الدم383684الخط الساطع

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
  2. Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  5. Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
  6. Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929(2011).
  7. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107(2012).
  8. Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
  9. Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
  10. Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
  11. Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905(2010).
  13. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  14. Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
  15. Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
  16. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  17. Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
  18. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  19. Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  20. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  21. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  22. Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
  23. Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
  24. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  25. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  26. Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
  27. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
  28. Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918(2010).
  30. Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
  31. Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
  32. Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
  33. Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
  34. Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
  35. Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
  36. Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116(2010).
  37. Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polyacrylamide Gel PreparationMultiwell Plate FormatStiffness dependent Cell ResponsesHydrogel Substrate PreparationFlexible Plastic SupportGel Polymerization ProcessCollagen Coating ApplicationCell Morphology AnalysisYoung s Modulus MeasurementMicroscopy Imaging Techniques

Related Articles