مقالة منهجية

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

DOI:

10.3791/52652

⸱

يوليو 13, 2015

 , 
1UMR Centre des Sciences du Goŭt et de l'Alimentation, CNRS, INRA, Université de Bourgogne

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال تحليل الخصائص الفسيولوجية للخلايا العصبية الحسية الشمية يواجه قيودا تقنية. هنا نقوم بتسجيلها من خلال مشبك رقعة مثقب في تحضير سليم للظهارة الشمية في الفئران المستهدفة بالجينات. تسمح هذه التقنية بتوصيف خصائص الغشاء والاستجابات لروابط معينة من الخلايا العصبية التي تعبر عن مستقبلات حاسة الشم المحددة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل الاستجابات الفسيولوجية للخلايا العصبية الحسية الشمية (OSN) عندما حفز مع بروابط معينة أمر بالغ الأهمية لفهم أساس السلوكيات مدفوعة حاسة الشم والتشكيل الخاصة بهم. هذه الخصائص الترميز تعتمد بشكل كبير على التفاعل الأولي بين جزيئات الرائحة ومستقبلات الشم (OR) أعربت في OSNs. هوية وخصوصية ويجند الطيف من التعبير عن أو حاسمة. أعرب احتمال العثور على يجند من OR في OSN اختيارها عشوائيا داخل الظهارة منخفضة جدا. لمواجهة هذا التحدي، هذا البروتوكول يستخدم وراثيا الفئران الموسومة معربا عن GFP بروتين فلوري تحت سيطرة المروج من نسب الأرجحية محددة. وتقع OSNs في ظهارة ضيقة وتنظيم المبطنة للتجويف الأنف، مع الخلايا المجاورة تؤثر النضج وظيفة. نحن هنا تصف طريقة لعزل والظهارة الشمية سليمة وتسجيل من خلال تسجيلات التصحيح المشبك خصائص OSNs هxpressing مستقبلات الرائحة محددة. بروتوكول يسمح احد لتوصيف خصائص الغشاء OSN مع الحفاظ على تأثير الأنسجة المجاورة. تحليل نتائج التصحيح، المشبك غلة الكمي الدقيق ليجند / أو التفاعلات، ومسارات نقل والصيدلة، والترميز خصائص OSNs 'والتشكيل على مستوى الغشاء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSN) تمثل الخطوة الأولى للإدراك حاسة الشم. تقع في الظهارة الشمية بطانة التجويف الأنفي لدى القوارض، وتحويل المعلومات الكيميائية للعطر في إمكانات العمل التي يتم إرسالها عبر محور عصبي على الدماغ. لفهم أفضل للآليات الترميز حاسة الشم، فمن الضروري أن تميز تنبيغ وغشاء خصائص OSNs. حتى وقت قريب، نفذت معظم التقنيات المستخدمة لوصف خصائص OSNs الثدييات خارجا على فصل OSNs 1-4. تستخدم عملية التفكك المختلفة (أي الإنزيمات) العمليات الميكانيكية والكيميائية لتحرير OSNs من بيئتهم. هذه العمليات لحث على عدد منخفض من خلايا متاحة للتسجيلات. هذا العدد المنخفض يمكن أن يكون أكثر أهمية في حالة الخلايا GFP المسمى. التفكك أيضا إلى إزالة الخلية الى خلية التفاعلات المحلية بين OSNs وخلايا أخرى من الظهارة الشمية التي قد تعزز survivالقاعدة وتعديل خصائص OSNs. من أجل تجاوز الإجراء التفكك، تم وضع إعداد سليمة 5.

كل OSN يعبر عن مستقبلات الشم واحدة (OR) مختارة من عائلة متعددة الجينات كبيرة 6. هناك ~ 1000 نسب الأرجحية التي أعرب عنها في الظهارة الشمية الرئيسية في الماوس. نظرا لوجود عدد كبير من الحيوانات أو في نوع البرية، وفرص لتسجيل OSNs التعبير عن نفسه أو منخفضة جدا. للتغلب على هذه القيود، هي الجينات المستهدفة الفئران المتاحة فيها جميع OSNs التعبير عن الهوية أو وصفت مع البروتين الفلوري 7-9. واستخدمت هذه OSNs المسمى للقيام تحليل وظيفي في الأعمال التحضيرية فصلها 7،10،11 مع العيوب المذكورة في وقت سابق. لذا لإعداد ظهارة سليمة 5 من الفئران وصفت وراثيا تلتف هذه القضايا. لأنها تتيح رصد نشاط OSNs معربا عن نسب الأرجحية محددة بدقة في بيئة أقرب إلى في السادسفو وقت ممكن. الى جانب ذلك، تسجيلات التصحيح المشبك من OSNs تسمح أيضا تحليل دقيق لخصائص الغشاء، تنبيغ مسار الصيدلة، يجند / أو التفاعلات. بالكاد يمكن تحليل كل هذه المواضيع باستخدام التسجيلات خارج الخلية. استخدمنا هذه التقنية لرصد ردود OSNs التعبير عن مستقبلات الرائحة SR1 وMOR23 12،13. تم تأكيد جدوى هذه التقنية من قبل مجموعات أخرى على MOR23 معربا عن OSNs 14 فضلا عن نسب الأرجحية الأخرى معربا عن الخلايا العصبية 15،16. رصد مجموعة محددة من OSNs يمكن أن يؤدي إلى تحليل خصائصها في العديد من السياقات المختلفة مثل التنمية 14، والشيخوخة 17، الرائحة التي يسببها اللدونة 18، ودور الاختلافات في تسلسل مستقبلات الرائحة في رائحة الترميز 15. وبالتالي يتيح هذا البروتوكول أداة قوية لرصد الخصائص الفنية للOSNs المعرفة على مستوى الغشاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة دي بورغون وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق جامعة دي بورغون.

1. الحيوانات

  1. استخدام الفئران المعدلة وراثيا OR-IRES-tauGFP المتاحة في مختبر جاكسون. وقد وضعت هذه الفئران في المختبر الدكتور بيتر Mombaerts "من أجل تحليل استهداف أكسون وتطوير النظام الشمي 19. على سبيل المثال، خط MOR23-IRES-tauGFP، والأوراق المالية رقم 006643، يحمل اسم سلالة B6 الرسمي؛ 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ. وبالمثل، فإن خط SR1-IRES-tauGFP، والأوراق المالية رقم 6717 يحمل اسم B6 الرسمي؛ 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ.
  2. وفيما يتعلق عمر الحيوانات: من أجل نتائج أفضل من البروتوكول، واستخدام الحيوانات بين 2 و 4 أسابيع من العمر. في هذه الفئة العمرية، وتشريح هو أسهل (العظام أكثر ليونة، أكثر حزما الظهارة الشمية) والمقابض شجيري هي ثنائيةgger مقارنة الحيوانات الأكبر سنا.

2. إعداد أقطاب وحلول

  1. لماصات محفزة: شراء prepulled تحفيز ماصات. خلاف ذلك، وإعداد عليها يدويا.
    1. باستخدام اللهب، ثني ستة الماصات الزجاج 1 مم في حوالي 1 سم من الحافة. إدراج هذه الماصات ستة زائد على التوالي ال 7 في 1.5 سم الحرارة يتقلص أنابيب تعزيز من قبل العيينة.
    2. الحرارة يتقلص أنابيب للحفاظ على برميل المرفقة معا. إرفاق إضافي أنابيب الحرارة يتقلص إلى أقصى الطرف الآخر من برميل. سحب هذا ماصة تحفيز مع مجتذب متعددة برميل.
    3. إضافة بعض الغراء السائل الأبيض حول العيينة لتعزيز نصائح محني. اسمحوا الجافة O / N.
  2. إعداد 1 أو 2 لتر من محلول طبيعي رينغر خارج الخلية (في ملي: كلوريد الصوديوم 124، بوكل 3، 4 MgSO 1.3، CaCl 2 2، 3 NaHCO 26، ناه 2 PO 4 1.25، الجلوكوز 15؛ درجة الحموضة 7.6 و 305 الميلي أسمول). الحفاظ على 4 ° Cحتى الاستخدام.
  3. إعداد محلول المخزون داخل الخلايا (مم): بوكل 70، KOH 53، حمض methanesulfonic 30، EGTA 5، HEPES 10، السكروز 70؛ الرقم الهيدروجيني 7.2 (KOH) و 310 الميلي أسمول. الحفاظ على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. جيدة لعدة أسابيع.
  4. يعد حل داخل الخلايا تسجيل مع النيستاتين بشكل إرتجالي (في آخر لحظة) قبل التجربة.
    1. تزن 3 ملغ من النيستاتين، إضافة 50 ميكرولتر من DMSO. دوامة 20 ثانية ثم يصوتن 2-3 دقائق حتى المخفف بالكامل.
    2. إضافة 20 ميكرولتر من حل DMSO نيستاتين في 5 مل من محلول المخزون داخل الخلايا. دوامة و 20 ثانية، ثم يصوتن 3 دقائق. الحفاظ على هذا الحل في 4 درجات مئوية، وحماية من الضوء المباشر، نيستاتين غير حساسة للضوء. هذا الحل يمكن استخدامها لبضع ساعات. استبدال كل يوم.
    3. مرة واحدة إعداد الظهارة الشمية تحت المجهر، واتخاذ بعض من هذا الحل في حقنة 1 مل مع طرف الأصفر ممدود اللهب لملء الأقطاب. بعيدا عن الضوء المباشر. مرة واحدة على RT، والحل نيستاتينغير مستقر. استبدال الحل في حقنة 1 مل كل ساعة أو الاحتفاظ بها في الجليد.
  5. سحب أقطاب تسجيل مع ساحبة للحصول على رقبة طويلة ورأس صغير (~ 2 ميكرون) مع المقاومة من 15-20 MΩ مع الحل نيستاتين الداخلي.
  6. يعد حل الرائحة عند 0.5 M في DMSO تحت غطاء الدخان. قسامة والحفاظ على درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تخفيف الرائحة في حل قارع الأجراس حتى التركيز المطلوب. ملء ماصة محفزة.

3. إعداد الظهارة الشمية

ملاحظة: الفئران OR-IRES-tauGFP تعبر عن tauGFP تحت سيطرة أو المروج. في هذه الفئران، وصفت جميع الخلايا العصبية معربا عن OR في المصالح مع GFP. ويتم تكييف هذا البروتوكول لنسب الأرجحية التي أعرب عنها في جميع المناطق. ومع ذلك، تشريح والتسجيلات هي أسهل للنسب الأرجحية أعرب في المنطقة الظهرية.

  1. تخدير الحيوان عن طريق حقن مزيج من الكيتامين وزيلازين (150 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم بودالوزن ذ، على التوالي). قطع الرأس يمكن القيام بها مع مقص حاد للفئران شابة أو مع المقصلة القوارض وتصان بشكل مناسب لالفئران الأكبر سنا.
    1. باستخدام مقص حلقة تشريح جعل شق وسطي طولية من خلال الجلد الظهرية. إزالة الجلد عن طريق سحب إربا. باستخدام مقص، وقطع أقل الفكين في مفصل الفك. إزالة الأسنان الأمامية العلوية التي كتبها خفض مواز الاكليلية للأسنان.
    2. اجراء خفض الاكليلية من الرأس خلف العينين وتبقي فقط على الجزء الأمامي من الرأس. تراجع في حل قارع الأجراس المثلج للتشريح ضمن نطاق.
  2. تشريح تحت النطاق: في الجانب البطني، وجعل قطع طولية على طول الفك العلوي / الأسنان. قطع العظام الظهرية طوليا، في أعقاب الجانب ظهراني الجانبي للتجويف الأنف. إزالة معظم العظام والحنك. نقل الحاجز وظهارة المرتبطة به في الاوكسيجين قارع الأجراس في RT.
  3. لتشريح النهائي: الحق قبل البدء في تسجيلالدورة، قشر بعيدا ظهارة من الحاجز الأساسي بالملقط. فصل ظهارة مع ملقط ومع اثنين من 4-5 ملم تخفيضات مقص (microvannas استخدام مقص) في الجزء الأمامي من الحاجز حيث التصاق أقوى.
    1. إزالة بعناية الجهاز الميكعي بقطع عليه على طول اتصال ظهري لظهارة الحاجز. نقل الظهارة إلى غرفة تسجيل مع طبقة المخاط مواجهة. يبقيه شقة في غرفة مع القيثارة.
  4. تثبيت غرفة تحت المجهر تستقيم مجهزة البصريات مضان وكاميرا حساسة. تصور إعداد على شاشة الكمبيوتر في تضخم عالية من خلال 40X الهدف الغمر بالمياه (الفتحة العددية 0.8) و2X أو 4X التكبير اضافية من خلال عدسة مكبرة تحقيقه. يروي باستمرار مع الاوكسيجين قارع الأجراس في RT (1-2 مل / دقيقة).

4. تسجيل الدورة

  1. بحث عن الخلية الفلورسنت: تثير إعداد 480نانومتر لEGFP، التي تنبعث الضوء في نطاق 530-550 نانومتر. هدف واحد مقبض شجيري وهو أمر واضح بشكل صحيح في مضان وتحت حقل مشرق.
  2. ملء القطب مع الحل الخلايا مع النيستاتين. إزالة الفقاعات من خلال استغلال بلطف على القطب.
  3. إدراج القطب على حامل الكهربائي، وتطبيق الضغط الايجابي في ماصة. يجب أن تكون المقاومة 15-20 MΩ.
  4. جلب الكهربائي بالقرب من الخلية؛ عند بلوغ المقاومة ~ 40 MΩ، والإفراج عن الضغط الإيجابي والضغط السلبي طفيف للوصول إلى gigaseal.
  5. حالما يتم التوصل إلى ختم، تعيين غشاء المحتملة بنحو -75 بالسيارات.
  6. مرة واحدة يتم فتح الخلية، والمضي قدما مع بروتوكولات التحفيز، والعلاجات الدوائية. لقياس استجابة لتحفيز الرائحة واحد، سجل 200-500 ميللي ثانية من النشاط العفوي، وتحفيز لمدة 500 ميللي ثانية وقياس استجابة الخلايا لمدة تصل إلى 10 ثانية (13). لعلاجات الدوائية، يروي كلاء الدوائية فيالتركيز المطلوب 20.

5. تحليل البيانات

  1. تحليل التيارات التي تسببها التحفيز الرائحة على النحو التالي: الحد الأقصى للسعة، لمرة وارتفاع (الوقت اللازم لتصل إلى 90٪ من الحد الأقصى للسعة، في مللي ثانية)، ومجموع (منطقة تحت منحنى في PAS) الحالية، والوقت بنسبة 50٪ (الوقت بين بداية وإزاحة استجابة بنسبة 50٪ من الحد الأقصى للسعة، في مللي ثانية).
    1. باستخدام التيارات ذروة تنبيغ (بلغت أقصى اتساع) بتركيزات مختلفة، ورسم وتناسب منحنى الاستجابة للجرعة باستخدام المعادلة هيل: I = ايماكس / (1 ​​+ (K 02/01 / C) ن)، حيث كنت يمثل الذروة الحالية ، IMAX أكبر عدد من الردود في تركيزات تشبع، K1 / 2 تركيز الذي تم التوصل نصف الحد الأقصى للاستجابة، C تركيز الرائحة ون معامل هيل.
  2. تحليل تسجيلات لغشاء المحتملة في المشبك الحالي لتحقيق أقصى قدر من الاستقطاب، وTOTAل إمكانات أثارت (منطقة تحت منحنى في mVsec)؛ سجل النشاط العفوي ارتفاعه أكثر من 30 ثانية إلى 1 التسجيلات دقيقة. استثارة سجل عن طريق المسامير التي تسببها الحقن التيارات (5-10 باسكال).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نتائج هذا البروتوكول يعتمد على نوعية تشريح. يجب أن يكون هذا الخطوات تشريح قصيرة (أقل من 10 إلى 15 دقيقة) ودقيق (أي، لتجنب أضرار من ظهارة). يوضح الشكل 1 كيف يمكن إعداد مثالية يشبه في مستويات التكبير المختلفة. في تضخم منخفض تحت حقل مشرق أنواع مختلفة من الخلايا (مثل المقابض من OSNs، ودعم الخلايا) يمكن تمييزها (الشكل 1A). على أعلى مستوى التكبير، وعادة 80X إلى 160X، في حقل مشرق، المقابض شجيري من OSNs ينبغي أن يكون التمييز بوضوح بين الخلايا الد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدرة هذا البروتوكول لرصد خصائص OSNs صحية بشكل صحيح تعتمد بشكل كبير على جودة إعداد. ولذلك، فإن الخطوات تشريح حاسمة. أولا من المهم جدا أن تولي اهتماما لنوعية (الرقم الهيدروجيني، الأسمولية)، الأوكسجين ودرجة الحرارة (المثلج ولكن ليس المجمدة) من المتوسط ​​تشريح. ثانيا، التلاعب في ظهارة مع أدوات تشريح يجب محدودة بقدر الإمكان لتجنب الأضرار. وأخيرا، من المهم جدا للحصول على إعداد شقة ممكن من أجل الوصول إلى أكبر عدد من السكان OSN وقت ممكن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصلحة مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا Peter Mombaerts على الهدية السخية من الفئران OR-GFP; آن ليفرانك ومنشأة CSGA لرعاية ممتازة للحيوانات. تم توفير التمويل من قبل CNRS من خلال منح ATIP و ATIP Plus ، من قبل Conseil Régional de Bourgogne (منح FABER و PARI) ، من قبل جامعة بورغون (برنامج BQR).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طاولة الاهتزاز مع قفص فارادايTMC63-500 SERIESالمطلوبة: يعزل نظام التسجيل عن الاهتزازات التي تسببها البيئة (حركات المجرب ، اهتزازات المعدات مثل مراوح تبريد أجهزة الكمبيوتر ، إلخ) ؛ يمكن أيضا شراؤها بقفص فاراداي ، أو مجهزة بقفص فاراداي مخصص ؛ يوصى بهذا القفص لتجنب الضوضاء الكهربائية من
بصريات
البيئةمجهرأوليمبوسBX51WIمجهر مستقيم مجهز بالتألق السطحي ؛ مرحلة ثابتة أو متحركة اعتمادا على أهداف تفضيل المستخدم
أوليمبوسLUMPLFL40XWهدفين على الأقل مطلوبة: 4X أو 10X للنهج الخشن للخلية ؛ ومثال الغمر على المسافات الطويلة أوليمبوس LUMPLFL40XW / الأشعة تحت الحمراء / 0،8 / WD: المكبر 3.3 مم
أوليمبوسU-TVCACمطلوب تماما: يوضع في مسار الضوء بين الهدف والكاميرا ؛ يسمح لتكبير الصورة على الشاشة من أجل الوصول بدقة إلى المقبض مع كاميرا تسجيل القطب
الأولمبوسDP72كاميرا جيدة لرؤية الخلايا العصبية في التألق وكذلك في المجال الساطع؛ برنامج التحكم بسيط ويسمح بالتقاط الصور والقيام بصورة الكاميرا الحية لمراقبة اقتراب القطب الكهربائي للخلية. الكاميرا فائقة الحساسية ليست ضرورية
لتصفيةأوليمبوس / كرومااعتمادا على بروتين الفلورسنت المستخدم في الفئران ؛ مثال على GFP: الإثارة: BP460-490: الانبعاث: HQ530 / 50m
مكبر للصوتHEKAEPC10يراقب USB التيارات المتدفقة عبر قطب التسجيل ويتحكم أيضا في النفخ عن طريق إرسال إشارة TTL إلى الرشاش ؛ يتم التحكم في إعداد EPC10 بواسطة
برنامجالكمبيوترHEKA Patchmasterفي مكبر الصوت أثناء التجربة
يسمح بمعالج دقيقدقيق SutterMP225بحركات دقيقة تصل إلى 1/10 ميكرومتر ؛ هذا النموذج مستقر للغاية ؛ تجنب المتلاعبين الهيدروليكيين الذين قد ينجرفون
مجتذب القطب الكهربائيSutterP97مع خيوط الحوض العريضة FT345-B ؛   لإعداد ماصات التسجيل من حوالي 2 & micro ؛ قطر م مع طرف طويل للوصول إلى الخلايا ؛ يجب أن تكون المقاومة من 15 إلى 20Mohm مع زجاج محلول مشبك التصحيح المثقب
SutterBF120-69-10في ظروف التسجيل لدينا ، هذا الزجاج مثالي لتسجيل غرفة تسجيل الماصات
Warner InstrumentsRC-26Gهناك حاجة إلى غرفة لضبط التحضير تحت المجهر. للحفاظ على التحضير في وسط الغرفة ، يجب استخدام شبكة / مرساة.
التحفيز
WPITW100F-4المرفق في مجموعات من 7 ، وتستخدم هذه الماصات لإعداد ماصات محفزة مسبقة السحب
مجتذب متعدد الماسوراتMDIPMP-107-Zعن طريق الارتباط بالسحب والالتواء ، يسمح لنا هذا المجتذب بإعداد أقطاب كهربائية للنفخ مع 7 براميل
حاقن ضغط دقيق   ؛شركة TooheyP / N T25-1-900 قناة واحدة      يتحكم حاقن الضغط الدقيق هذا في الضغط المقذوف في مجتذب متعدد الأسطوانات ؛ يتم التحكم فيه يدويا أو بواسطة مكبر الصوت بواسطة 5V & nbsp ؛
TTLs micromanipulatorNarishigeYOU-1مناور خشن يكفي لإحضار قطب النفخ بالقرب من أنبوب موقع التسجيل
N / ATygon لجلب الضغط من البخاخ إلى محاليل الماصة المنتفخة
/ التروية / المواد الكيميائية
فراغغاردنر دنفر300 سلسلةتعتبر المضخة الغشائية الاهتزازية أكثر هدوءا وكفاءة من الأنواع الأخرى من
الترويةN / Aنضح الجاذبية مع أنابيب بولي إيثليلين لإدخال وإخراج الحل الخارجي من غرفة التسجيل
نيستاتينسيجما-ألدريتشN3503إلزامي لحل داخلي لمشبك التصحيح المثقب
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما-ألدريتشD5879تستخدم لحل النيستاتين للحل الداخلي للتصحيح المثقب   ؛
محلول كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS9625خارج الخلية
كلوريد البوتاسيومسيجما-ألدريتشP4504محلول داخل الخلية / خارج الخلية
هيدرات كلوريد الكالسيوممحلول سيجما-ألدريتشC7902أحادي
هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaH2< / sub>PO4< / sub>)سيجما ألدريتشمحلول S9638خارج الخلية
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات (MgSO4< / sub> 7H2< / sub>O)محلول Sigma-Aldrich63140خارج
الخلية محلول الجلوكوزSigma-AldrichG8270خارج الخلية
بيكربونات الصوديومSigma-AldrichS6297محلول
خارج الخليةEGTA (الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N & Prime ؛ N & حمض رباعي الأسيتيك)محلول داخلي Sigma-AldrichE3889
محلول داخلي هيدروكسيد البوتاسيومSigma-AldrichP1767
ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتشW387509محلول داخل الخلايا
Hepes-NaSigma-AldrichH7006داخل الخلايا
السكروزسيجما ألدريتشS0389داخل الخلايا
مطلوب يتحكم ، ، زجاج مضخة نظام للمضخات نظام ثنائي محلول داخلي محلول محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
  2. Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862(2012).
  3. Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
  4. Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
  5. Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
  6. Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  7. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  8. Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
  9. Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
  10. Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
  11. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  12. Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
  13. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  14. Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
  15. Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
  16. Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
  17. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
  18. Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
  19. Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
  20. Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
  21. Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
  22. Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
  23. Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
  24. Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
  25. Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
  26. Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
  27. Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة