مقالة منهجية

استخدام استراتيجية قفيصة التأسيس Antigen ل تطوير المناهج اتش المصلي 5 تنقلها لقاح

DOI:

10.3791/52655

⸱

مايو 6, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول لتوليد نوع ثنائي التكافؤ اتش 5 (Ad5) ناقلات إثبات صحة المبدأ Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 من خلال الاستفادة من استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس. وقد تجلى هذا متجه لعرض اللياقة البدنية النوعية، والقدرة على الهروب الأمصال Ad5 إيجابية في المختبر، واستضداد وكذلك المناعية لمستضدات يدمج.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اتش المصلي 5 (Ad5) تم تعديل نطاق واسع مع أساليب التحوير التقليدية لتطوير لقاح. وكفاءات انخفاض هذه النواقل Ad5 تعديل تقليديا في التجارب السريرية يمكن أن تكون مرتبطة في المقام الأول مع Ad5 الحصانة موجودة من قبل (PEI) بين الغالبية العظمى من السكان. لتعزيز التنمية قاح تنقلها Ad5 من خلال حل قلق Ad5 PEI، واستخدمت استراتيجية مبتكرة مستضد قفيصة التأسيس. من خلال ميزة هذه الاستراتيجية، Ad5-تنقلها نحن بني لأول مكوك hexon البلازميد HVR1-صاحب KWAS-HVR5 6 / pH5S التي كتبها subcloning المنطقة hypervariable (HVR) 1 من hexon إلى البلازميد المكوك شيدت سابقا HVR5-صاحب 6 / pH5S، الذي كان له 6 العلامة دمجها في HVR5. تم توليفها هذه القطعة HVR1 DNA تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية حاتمة ELDKWAS. وكان 6 / pH5S HVR1-KWAS-صاحب HVR5-ثم خطي وتحويلها بالاشتراك مع خطي العمود الفقري البلازميد pAd5 / ΔH5 (GL)،لإعادة التركيب مثلي. هذا البلازميد معاد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 تم transfected في الخلايا لتوليد ناقلات فيروسية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6. تم التحقق من صحة هذه متجه لياقة بدنية النوعية المشار إليها الفيروسي عيار البدني (VP / مل)، عيار المعدية (IP / مل)، والمقابلة VP نسبة / IP. كل من حاتمة فيروس نقص المناعة البشرية وصاحب 6 العلامة كانت على قفيصة Ad5 المعرضة للسطح، واحتفظت استضداد حاتمة محددة من تلقاء نفسها. وأشار مقايسة تحييد قدرة هذا ثنائي التكافؤ ناقلات للتحايل على تحييد بواسطة الأمصال Ad5 إيجابية في المختبر. أظهر تحصين الفئران توليد القوي محددة مناعة الخلطية لحاتمة فيروس نقص المناعة البشرية وصاحب 6. وأشارت هذه الدراسة إثبات صحة المبدأ القائل بأن البروتوكول المرتبطة باستراتيجية مستضد قفيصة التأسيس يمكن الاستفادة عمليا للجيل اللقاحات Ad5 تنقلها عن طريق تعديل البروتينات قفيصة مختلفة. بل يمكن و هذا البروتوكولurther تعديل لتوليد اللقاحات تنقلها اتش نادر-المصلي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اتش الإنسان (الإعلان) هو المتوسطة الحجم، غير يلفها الفيروسات مع قفيصة منواة لذوات الوجوه التي تحتوي على ضعف جينوم الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. الإعلان ينتمي إلى عائلة فيروسات غدانية، مع تصنيف إلى سبع مجموعات (A خلال G). تحتوي كل مجموعة الفيروس من الأنماط المصلية مختلفة. لقد منها، اتش المصلي 5 (Ad5) من مجموعة C الأكثر درس على نطاق واسع وتطبيقها على نطاق واسع للنهج تنقلها مثل العلاج الجيني واللقاحات.

وقد وضعت استراتيجية التحوير التقليدية وتطبيقها للتعديلات Ad5، الذي يتميز عن تشريد الفيروس الجينات في وقت مبكر مع الجين في المصالح، والتعبير تركيزا من الجينات من الاهتمام في مضيف. ومن الأمثلة على ذلك بناء pENV9 / Ad5hrΔE3 من خلال استبدال الجينات في وقت مبكر 3 (E3) مع مراجعة الجينات من قردي بفيروس نقص المناعة 1، وبناء AdCMVGag من خلال استبدال الجينات في وقت مبكر 1 (E1) مع الجين هفوة من نقص المناعة البشريفيروس (HIV) 2، وبناء أمريكا اللاتينية والكاريبي الإعلان Z عن طريق استبدال E1 مع أمريكا اللاتينية والكاريبي Z الجينات 3. وتطبيق واسع النطاق للاستراتيجية التحوير التقليدية على Ad5 يعتمد على الأسس الموضوعية التالية: مجموعة واسعة من المضيفين لAd5، والهندسة الوراثية الممكنة على الفيروس وانتشار الفيروس، والإقامة كبيرة من إدراج الجين الغريب وسلامة Ad5 4،5. ومع ذلك، فإن انخفاض كفاءات من العلاجات السريرية Ad5 تنقلها عن طريق استخدام هذه الاستراتيجية كان عقبة رئيسية، والتي تم تعيينها لتكون مرتبطة في المقام الأول مع Ad5 PEI، منذ Ad5 هو السائد حتى بين الغالبية العظمى من الأطفال والبالغين 4،6.

للتغلب على عقبة رئيسية من Ad5، فإن الهدف الأساسي هو وضع استراتيجية بديلة التحايل Ad5 PEI. المناعة الفطرية 7، حصانة التكيفية مثل تحييد الأجسام المضادة (يعتقل) 10/08 وCD8 + T استجابات الخلايا وقد ثبت أن 10 ضد Ad5 للمشاركةntribute إلى Ad5 PEI، مع Ad5 يعتقل الظهور للعب دور مهيمن في المساهمات في Ad5 PEI 10،11. وعلاوة على ذلك، Ad5 يعتقل الحواتم الهدف الموجود في البروتينات قفيصة، بما في ذلك hexon بروتين رئيسي والألياف وقاعدة بينتون. منها، hexon هو الهدف الرئيسي للAd5 يعتقل 8،11-13. وبناء على هذه النتائج، وقد تم عرض استراتيجية مبتكرة مستضد قفيصة التأسيس. هذه الاستراتيجية الجديدة تسلط الضوء على استبدال أو إدراج البروتينات من الفائدة على Ad5 البروتينات قفيصة، الأمر الذي يحول أو أقنعة الحواتم Ad5 تحييد، مما يؤدي إلى الاعتراف ينقص من جانب يعتقل وكفاءة الإدارات ناقلات Ad5. ومن الجدير بالذكر أن هذه الاستراتيجية التنافسية لأنه يمكن أن يساعد أيضا المضيفين يثير مناعة الخلطية قوية والمناعة الخلوية قوية من خلال تقديم مباشرة مستضدات المصالح لجهاز المناعة 4،14،15. وبناء على هذه الاستراتيجية، والاستنساخ الجزيئي والمؤتلف الانقاذ الإعلان ناقلات فيروسية يمكن تقسيم الهيكليةإلى أربع خطوات رئيسية: (أ) إعداد الجينات في المصالح جزء إما عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) أو التوليف؛ (ب) ربط جزء من الجينات في البلازميد المكوك الذي يحتوي على جزء الجينات في المصالح والأسلحة مثلي إلى العمود الفقري اتش. (ج) إعادة التركيب مثلي من قبل البلازميد المكوكية التي تحتوي على جزء الجينات في المصالح مع العمود الفقري البلازميد خطي pAd5 / ΔH5 (GL) 16-تحويل المشترك؛ (د) ترنسفكأيشن من خطي البلازميد الفيروسة الغدانية المؤتلف لانقاذ ناقلات الإعلان المؤتلف تدمج مع مستضدات من الفائدة.

قمنا بمد مجموعتنا والبعض الآخر هذه الاستراتيجية التأسيس الإعلان بديلة عن الإعلان تطوير لقاح ضد مسببات الأمراض المعدية تنقلها مختلفة. أبلغنا توليد متجه الإعلان المؤتلف الإعلان، وHVR1-خطابات الضمان، صاحب 6 -V3 من خلال دمج صاحب الموسومة HIV-1 مستضد V3 في لغة HVR1 من Ad5 hexon (hexon5). وأثار هذا متجه ولدت شارعاونج الاستجابة المناعية الخلطية محددة لحاتمة V3 4. أبلغنا أيضا تطوير Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 من خلال دمج HIV-1 غشاء المنطقة ectodomain الداني (MPER) في لغة HVR2 من hexon5 2. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت مجموعة الدكتور تشو فوائد هذه الاستراتيجية التأسيس الإعلان لتطوير المصلي الإعلان 3 (AD3) اللقاحات تنقلها، أي، توليد الفيروسية ناقلات R1SP70A3 من خلال دمج SP70 تحييد حاتمة من الفيروس المعوي 71 في HVR1 من AD3 hexon (hexon3). R1SP70A3 ولدت يعتقل قوي وإنتاج IFN-γ محددة لSP70 حاتمة، مما يؤدي إلى معدل عال من الحماية ضد الفيروس المعوي 71 تحديا 15.

لغرض مرجعية فنية، اتخذت دراستنا الاستفادة من استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس النوعية التركيز على جيل من ثنائي التكافؤ Ad5 ناقلات Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 من خلال دمج مستضد HIV-1 في HVR1 لدا صاحب العلامة إلى HVR5 من hexon5. كما تم تقييم ناقلات فيروسية ولدت مناعيا. ويمكن استخدام استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس نحو وضع نهج التطعيم Ad5 تنقلها ضد الأمراض المعدية المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت جامعة ألاباما في برمنغهام المؤسسي استخدام الحيوان والعناية اللجنة استخدام الفئران كما هو موضح في هذه الوثيقة بموجب البروتوكول رقم افق 101109272.

1. البناء الوراثية لتعديل البلازميد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 مع استراتيجية قفيصة التأسيس مستضد

  1. بناء البلازميد مكوك 6 / pH5S HVR1-KWAS-صاحب HVR5-
    1. طلب البلازميد التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي توليفها HVR1-KWAS بين المواقع انزيم التقييد AgeI إلى ACCI من hexon5 الجينات.
    2. هضم 6 ميكروغرام من جزء توليفها (HVR1-KWAS) مع الانزيمات AgeI (6 وحدات) وACCI (6 وحدات) لمدة 3 ساعات في 37 ° C. حل جزء هضمها في هلام الاغاروز 2٪ بحلول الكهربائي، وتنقية جزء مع مجموعة استخراج الهلام DNA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. على أساس نسبة المولي من إدراج لناقلات بنسبة 3: 1، استخدم يغاز T4 DNA ويغاز بuffer إلى ligate 12 نانوغرام من جزء (HVR1-KWAS) إلى 100 ​​نانوغرام من البلازميد المكوكية التي شيدت سابقا HVR5-صاحب 6 / pH5S 17 في حجم 10 ميكرولتر في RT لمدة 2 ساعة، عن طريق مواقع AgeI وACCI.
    4. تحويل 1 ميكرولتر من 10 ميكرولتر من المنتج إلى ربط 50 ميكرولتر من الخلايا DH5α electrocompetent في electroporator (في 1800 V). إضافة 950 ميكرولتر من SOC المتوسط ​​إلى الخلايا DH5α تحول واحتضان الخليط لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية، مع 300 دورة في الدقيقة. انتشار 100-200 ميكرولتر من خليط 1 مل على لوريا، Bertani (LB) أجار التي تحتوي على كانامايسين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
      1. لفحص ~ 10 المستعمرات التي PCR استهداف جزء HVR1-KWAS، مزيج من التمهيدي إلى الأمام (TATGTGTGTCATGTATGCGT)، عكس التمهيدي (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) وDH5α مستعمرة واحدة في حل مزيج الرئيسي PCR (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة). تشغيل العينات على thermocycler من خلال الإشارة إلى دليل المقدمة مع الحل PCR مزيج الرئيسي.
      2. استخدام التمهيدي إلى الأمام (TATGTGTGTCATGTATGCGT) تسلسل جزء HVR1-KWAS في استنساخ عرضه في قسم 1.1.4.1.
  2. بناء البلازميد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6
    1. ملخص 6 ميكروغرام من HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 / pH5S مع الانزيمات EcoRI (6 وحدات) وPmeI (6 وحدات) لمدة 3 ساعات في 37 ° C، وتنقية جزء يحتوي على الأسلحة إعادة التركيب مثلي والمزدوجة المعدلة وراثيا hexon5، كما جاء في الخطوة 1.1.2. خطي البلازميد العمود الفقري pAd5 / ΔH5 (GL) 16 مع صوي.
    2. شارك في تحويل 100 نانوغرام من جزء الهدف من البلازميد مكوك و 100 نانوغرام من خطي pAd5 / ΔH5 (GL) العمود الفقري إلى 50 ميكرولتر من الخلايا BJ5183 electrocompetent لإعادة التركيب مثلي في electroporator (في 1800 V). إضافة 950 ميكرولتر من SOC متوسطة إلى الخلايا تحولت واحتضان الخليط لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية، 300 دورة في الدقيقة. انتشار 100-200 ميكرولتر من خليط 1 ملعلى أجار LB تحتوي على كانامايسين (نهائي 50 ميكروغرام / مل) للO / N الحضانة عند 37 درجة مئوية.
      1. اختيار ~ 10 المستعمرات الصغيرة إلى 3 مل السائل LB تحتوي على كانامايسين (نهائي 50 ميكروغرام / مل) للO / N الحضانة عند شاكر (250 دورة في الدقيقة، 37 ° C). استخراج البلازميدات من الثقافة. استخدام تحليل PCR لفحص 10 المستعمرات من خلال استهداف جزء HVR1-KWAS، كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.1.
      2. لفحص نفس المستعمرات من خلال تحليل PCR استهداف جزء بيكسل من الجينوم العمود الفقري، مزيج التمهيدي إلى الأمام (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT)، عكس التمهيدي (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) واحدة BJ5183 مستعمرة في حل مزيج الرئيسي PCR (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة). تشغيل العينات على thermocycler من خلال الإشارة إلى دليل المقدمة مع PCR حل مزيج الرئيسي.
      3. تعيين PCR المستعمرات انقر نقرا مزدوجا إيجابية pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6.
    3. تحويل 100 نانوغرام من البلازميد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 فيلDH5α الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.
      1. استخدام تحليل PCR لفحص ~ 10 المستعمرات من خلال استهداف جزء HVR1-KWAS، كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.1.
      2. استخدام تحليل PCR لفحص نفس المستعمرات من خلال استهداف جزء بيكسل من الجينوم العمود الفقري، كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.2.
      3. استخدام التمهيدي إلى الأمام (TATGTGTGTCATGTATGCGT) تسلسل جزء HVR1-KWAS في pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6.

2. إعداد التعديل Ad5 الفيروسية المتجهات Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6

  1. تشكل المتوسطة كاملة من خلال إضافة FBS (النهائية 10٪) والأحماض الأمينية 100X غير الضرورية (النهائي 0.1 ملم)، و 200 ملي L-الجلوتامين (النهائي 2 مم) والبنسلين / الستربتومايسين الحل (النهائي 1٪) في DMEM مع ارتفاع نسبة الجلوكوز . الحفاظ على الكلى الجنينية (HEK293) الخلايا البشرية في المتوسط ​​كاملة في حاضنة الثقافة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2 تحت 85٪ شروط مرطب).
  2. إنقاذ الفيروسية هاءالمنشئ Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6
    1. البذور 3.0 × 10 6 الخلايا HEK293 في واحدة T-25 قارورة تحتوي على 5 مل من المتوسط ​​الشامل وثقافة O / N لتحقيق أحادي الطبقة مع 80٪ التقاء.
    2. خطي 15 ميكروغرام من pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 في حجم 100 ميكرولتر مع انزيم التقييد باشي (15 وحدة) عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
      1. استخراج خطي pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 بواسطة الطرد المركزي رد فعل مرتين (10000 x ج لمدة 1 دقيقة) مع حجم مساو من الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي (النسبة 25: 24: 1) في غطاء الدخان وبواسطة الطرد المركزي متسلسل (10000 x ج لمدة 10 دقيقة) مع الحل المختلط (300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ و 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم) و 700 ميكرولتر من الايثانول 70٪. تجاهل طاف في كل خطوة الطرد المركزي.
    3. Resuspend والبلازميد المنقى في ~ 40 ميكرولتر من الماء المقطر أو تريس، EDTA (TE) العازلة. Quantitate الحمض النووي البلازميد عن طريق قياس دي البصريnsity (OD) في 260 نانومتر.
    4. Transfect 3 ميكروغرام من البلازميد خطي مع التجاري كاشف liposomal ترنسفكأيشن في قارورة T-25، وفقا لدليل الشركة المصنعة. تغيير المتوسطة ترنسفكأيشن مع المتوسطة كاملة في 6 ساعات بعد ترنسفكأيشن وحضانة لاحقة في حاضنة الثقافة. الحفاظ على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عن طريق استبدال المتوسطة كاملة كل يومين أو ثلاثة أيام، حتى الفردي شكل لويحات الفيروسية.
    5. عندما تتطور لويحات لتأثير الاعتلال الخلوي الكامل (CPE)، تتخلص من الخلايا المتبقية من القارورة في غطاء العقيمة، والمحللة خلية الحصاد بواسطة الطرد المركزي المتوسطة في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تعليق بيليه خلية في ~ 1 مل من المتوسط ​​تحتوي على 2٪ FBS، وكسر الخلايا عن طريق تجميد ذوبان أربع مرات. جمع طاف تحتوي على الفيروس إنقاذهم بعد الطرد المركزي المحللة في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. نشر على نطاق واسع من ناقلات فيروسية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6
    1. نشر عشرفيروس البريد في T-75 قارورة تحتوي على خلايا HEK293 في غطاء العقيمة التي تصيب مع 1/3 لالمحللة كامل من القارورة T-25. السماح CPE الكامل لتطوير ضمن 2-3 أيام في حاضنة الثقافة. حصاد طاف المحللة كما جاء في الخطوة 2.2.5.
    2. نشر الفيروس في 02:59 T-175 قوارير في غطاء العقيمة التي تصيب مع 1/2 لالمحللة كامل من القارورة T-75، اعتمادا على ظروف انتشار الفيروس. السماح CPE الكامل لتطوير ضمن 2-3 أيام في حاضنة الثقافة. حصاد طاف المحللة كما جاء في الخطوة 2.2.5.
    3. نشر الفيروس في أحد عشر أو أكثر T-175 قوارير في غطاء العقيمة التي تصيب مع 1/2 لالمحللة الكامل من T-175 قارورة السابقة (ق). تحديد مقدار استخدام قارورة استنادا إلى ظروف انتشار الفيروس وكمية الفيروس في أمس الحاجة إليها. حصاد طاف المحللة كما جاء في الخطوة 2.2.5 عندما يحدث CPE كاملا في غضون 2-3 أيام في حاضنة الثقافة.
  4. Purification من Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 كلوريد السيزيوم
    1. إعداد اثنين من كثافة حلول CSCL في 5 ملي HEPES: 1.33 جم / مل و 1.45 جم / لتر، في حين تجنب الاتصال مع CSCL.
    2. تحميل 4 مل من CSCL (1.33 جم / مل) في أنبوب معقم نابذة فائقة السرعة، وتحميل بلطف 4 مل من CSCL (1.45 جم / مل) ضد الجزء السفلي من الأنبوب. تحميل 4 مل من المحللة طاف ببطء على الجزء العلوي من التدرجات في غطاء العقيمة.
    3. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 110،000 x ج لمدة 3 ساعات في 4 درجات مئوية لفصل ناضجة / الشريط السفلي الفيروس من معيبة / أعلى الفرقة الفيروس. جمع الشريط السفلي باستخدام حقنة 3 مل المسلحة مع G إبرة 33 وتمييع الفرقة مع 5 ملي HEPES إلى وحدة تخزين 4 مل في غطاء العقيمة.
    4. تحميل أنبوب آخر مع اثنين من كثافة حلول CSCL والفرقة مخفف من الفيروس كما هو موضح في الخطوة 2.4.2. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 110،000 x ج O / N عند 4 درجات مئوية. جمع الفرقة الفيروسية كما هو موضح في الخطوة 2.4.3.
    5. حقن محلول الفيروسات التي تم جمعها في dialysغير الكاسيت التي كتبها حقنة 3 مل المسلحة مع G إبرة 33 في غطاء العقيمة.
    6. وضع الكاسيت في 700 مل من 1X العازلة غسيل الكلى (1 L صفة: 100 مل من 10X PBS، 100 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ و 800 مل من الماء المقطر، تصفية المخزن المؤقت من خلال مرشح 0.22 ميكرون) واستبدال العازلة غسيل الكلى كل 3 ساعة لمدة 4 مرات. نضح من الحل فيروس مدال باستخدام حقنة اذعا.

3. التحقق من ناقلات الفيروسية إنقاذهم

  1. الفيروسية المتجهات المعايرة
    1. للفيروس عيار البدني، وتمييع كل من الفيروسات وعازلة لغسيل الكلى (التحكم الخلفية) في 1: 10 و 1: 20 في تحلل العازلة فيروس (10٪ SDS في تريس، EDTA) في أنابيب صغيرة، واحتضان جميع الأنابيب عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    2. بدوره على مقياس التكيف للظلام وتعيين طريقة الامتصاصية في OD 260 نانومتر. استخدام المخزن المؤقت لغسيل الكلى المخفف (1: 10) لتحقيق التوازن في إشارة الخلفية بالضغط على أسفل "على بياض". اكتب "10 + 90" في قرار مجلس الأمن مقياس التكيف للظلامالتابعين، وقراءة إشارة من الفيروس المخفف (1: 10).
    3. قراءة إشارة من الفيروس المخفف (1: 20) باتباع الأسلوب في خطوة 3.1.2، ولكن بدلا من كتابة "5 + 95" في شاشة مقياس التكيف للظلام. ضرب رقمين قراءات الفيروس عن طريق 1.1x10 12 وحساب متوسط ​​عيار مع وحدة منصب نائب الرئيس / مل، استنادا الى اثنين من التتر الفردية من التخفيفات اثنين.
    4. لعيار المعدية فيروس (IP / مل)، استخدم KARBER TCID الإحصائي 50 طريقة 14 لتحديد عمق الإصابة على الخلايا HEK293 في 10 يوما بعد العدوى (نقطة في البوصة)
  2. تقييم العرض التعرض الأنتيجين على ناقلات فيروسية
    1. معطف ناقلات فيروسية في لوحة ELISA والمضي قدما مع بقية الخطوات في طريقة ELISA القياسي 14. استخدام البشري مكافحة gp41 (2F5) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) والفأر مكافحة صاحب العلامة ماب للكشف عن مستضدات أدرجت 14 المقابلة.
    2. حل ناقلات فيروسية في denatuأحمر الكهربائي هلام بروتين (SDS-PAGE) والمضي قدما مع بقية الخطوات في القياسية طريقة الغربية وصمة عار 14. استخدام البشري مكافحة gp41 (2F5) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) والفأر مكافحة صاحب العلامة ماب للكشف عن مستضدات أدرجت 14 المقابلة.
  3. في تقييم المختبر من ناقلات على القدرة على تجاوز الأمصال Ad5-الفعل positve
    1. الحفاظ على خلايا هيلا في المتوسط ​​كاملة في حاضنة الثقافة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 تحت 85٪ شروط مرطب). تشكل المتوسطة كاملة من خلال إضافة FBS (النهائية 10٪)، و 200 ملي L-الجلوتامين (النهائي 2 مم) وحل البنسلين / الستربتومايسين (النهائي 1٪) إلى الحد الأدنى الضروري المتوسطة النسر (MEME).
    2. البذور خلايا هيلا في 6 لوحات جيدا في الخلايا 1x10 6 / جيد، واحتضان لوحات في حاضنة الثقافة (37 درجة مئوية و 5٪ CO الظروف مرطب 2 تحت 85٪) لمدة 2 ساعة. احتضان الأمصال Ad5 إيجابية (0.1 ميكرولتر أو 0 ميكرولتر) مع 5 IP / خلية من ناقلات فيروسية (Ad5 أو Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6) في حاضنة الثقافة لمدة 1 ساعة قبل إضافة مخاليط على 6 لوحات جيدة تحتوي على خلايا.
    3. في 24 ساعة إصابة آخر (HPI)، وشطف خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني والخلايا ليز في 0.5 مل من تحلل العازلة. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 5 دقائق، وجمع طاف. مزيج 20 ميكرولتر من طاف مع 100 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل للقراءة إشارة luciferase المراسل، منذ الفيروسات تحتوي على الجين luciferase المراسل.

4. المناعية تقييم ناقلات الفيروسية إنقاذهم

  1. إعداد مجموعتين التحصين: Ad5 وAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6.
    1. حقن الفئران (ن = 8 / مجموعة) العضل مع الفيروسات في 1X10 10 VP / الماوس، في مثلي "رئيس-دفعة" نظام التحصين، مع فاصل من 2 أسابيع.
    2. في 2 أسابيع آخر كل الحقن، وتنزف الفئران بدون تخدير التي كتبها الخد النزيف مع المشارط الحيوان (5 ملم طول الحافة) لجمع الدم في أنابيب 1.5 مل.
  2. مزيج من الدم في أنابيب كتبها قلب صعودا وهبوطا، واحتضان الدم في RT لمدة 30 دقيقة. تدور الأنابيب في 10000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية، ونقل الأمصال (الطبقة العليا) إلى 1.5 مل أنابيب جديدة.
    1. تدور الأنابيب الجديدة في 10000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية، ونقل الأمصال للتميز حديثا 1.5 مل أنابيب لتخزين في -80 ° C.
  3. تقييم مستضد معين مناعة الخلطية بواسطة ELISA القائم على الأمصال
    1. تمييع صاحب الببتيد (السهم عند 1 ملم) وHIV-1 الببتيد (السهم عند 1 ملم) بشكل منفصل في 100.
    2. ملي العازلة كربونات (الرقم الهيدروجيني 9.5) لتحقيق تركيز الببتيد طلاء على 10 ميكرومتر. معطف لوحات ELISA مع الببتيدات المخفف بشكل منفصل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر واحتضان لوحات O / N عند 4 درجات مئوية.
    3. تغسل الصحون مع PBST لمدة أربعة مرات في 200 ميكرولتر / جيد وكتلة لمدة 1 ساعة في 5٪ BSA في PBST. تطبيق الفئران الأمصال لوحات في التخفيف 1: 100 في عرقلة BUFفر، و 100 ميكرولتر / جيد. احتضان لمدة 2 ساعة حضانة في RT.
    4. تغسل الصحون مع PBST لأربع مرات. منع الصفائح التي يحتضنها في RT لمدة 30 دقيقة في عازلة تمنع في 100 ميكرولتر / جيد.
    5. تطبيق الماعز المضادة للماوس مفتش-HRP (1: 5000 في المنطقة العازلة حجب) في 100 ميكرولتر / جيد على حد سواء لوحات المغلفة مع صاحب الببتيد وHIV-1 الببتيد فردي. احتضان لمدة 2 ساعة على RT. تغسل الصحون مع PBST.
    6. قراءة لوحات في OD450 نانومتر بعد احتضان مع HRP الركيزة لمدة 30 دقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت هذه الاستراتيجية مستضد قفيصة التأسيس (الشكل 1A) لتوليد ثنائي التكافؤ Ad5 ناقلات فيروسية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6. أولا، المكوك البلازميد HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 / تم pH5S التي شيدت من قبل subcloning HVR1-KWAS جزء في السابق البلازميد المكوك شيدت HVR5-صاحب 6 / pH5S 17. ثانيا، البلازميد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 14 شيد قبل إعادة التركيب المتماثل بين جزء من "EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-Hi...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد تقلصت تطبيق استراتيجية التحوير التقليدية على تعديل Ad5 لتطوير لقاحات ويرجع ذلك أساسا إلى عنق الزجاجة المرتبطة Ad5 PEI 4،6. هذا الاختناق يمكن أن تقلص جزئيا من خلال تطبيق البديل مستضد قفيصة التأسيس استراتيجية (الشكل 1A)، لأن هذه الاستراتيجية يمكن التهرب من تحييد كتبها Ad5 يعتقل من خلال استبدال الحواتم تحييد من Ad5 مع مستضدات من الفائدة، وتسهيل توليد مناعة قوية لمستضدات من الفائدة يدمج. في هذه الدراسة، وجيل من ثنائي التكافؤ تعديل ناقلات فيروسية Ad5 / H5...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح 5T32AI7493-20 و5R01AI089337-03. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01لتقسيم الخلايا   ؛
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02لتحضير عازلة غسيل الكلى
الجلسرينSIGMAG5516-1Lلإعداد المخزن المؤقت لغسيل الكلى
SDSBIO-RAD161-0301لتحضير عازلة تحلل الفيروسات
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Thermo ScientificSH30910.03مكون من وسط الثقافة
100x الأحماض الأمينية غير الأساسية & نب سب.Thermo ScientificSH30238.01من وسط الثقافة
200 ملي مولار L-glutamineCellgro25-005-CIمكون متوسط
زراعة البنسلين / محلول الستربتومايسين  Cellgro30-002-CIلوسط الاستزراع
DMEM مع ارتفاع الجلوكوزالحراري العلميSH30081.01لزراعة الخلايا HEK293
الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسيSIGMAM5650لثقافة خلايا HeLa
الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزوميل  SIGMAP3803-100MLلحجم كبير من تنقية الحمض النووي
كلوريد السيزيوم   ؛منتجات الأبحاث الدوليةC68050لتنقية الفيروسات
HEPESCellgro25-060-CIلتحضير محلول CsCl
HEK293ATCC51-0036لإنقاذ الفيروسات ورفع مستوى
HeLaATCCCCL-2لفحص التحييد
قارورة T-25156367 علميةحرارية لزراعة الخلايا   ؛
قارورة T-75CORNING430641لزراعة الخلايا  
قارورة T-175Thermo Scientific159910لزراعة الخلايا  
جهاز طرد مركزي فائقBECKMANNAلتنقية
الفيروسات أنبوب الطرد المركزي الفائقBECKMAN344059لتنقية الفيروسات
كاسيت غسيل الكلى   ؛Thermo Scientific66380لغسيل الكلى الفيروسي
لوحة ELISA442404 علمي حراريل ELISA
البشري المضاد ل gp41 (2F5) mAbبرنامج كاشف المعاهد الوطنية للصحة الإيدز1475للمقايسات المناعية
الفأر المضاد لعلامته mAbGenScriptA00186للمقايسات المناعية
SOC المتوسطةCORNING46-003-CRللتحول
حل المزيج الرئيسي PCRQIAGEN201445 لإبرة
الوخز الحيوانية PCR (طول النقطة عند 5 مم)MEDIpointلنزيف الفئران   ؛
مقياس الضوء الحيويEppendorfللمعايرة بالتحليل الكيميائي للفيروس
مكون مكون شركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
  2. Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815(2010).
  3. DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
  4. Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112(2014).
  5. Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
  6. Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
  7. Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571(2013).
  8. Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
  9. Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
  10. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
  11. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
  12. Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
  13. Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
  14. Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347(2013).
  15. Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381(2012).
  16. Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
  17. Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
  18. Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
  19. Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
  20. Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089(2014).
  21. Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
  22. Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
  23. Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
  24. Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
  25. Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
  26. Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533(2013).
  27. Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699(2012).
  28. Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Viral Vector ConstructionPlasmid Shuttle SystemHomologous RecombinationViral Titer AnalysisNeutralization AssayHIV Epitope DisplayHis6 Tag IncorporationCesium Chloride Purification

مقالات ذات صلة