والهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن الحمض النووي الأكسدة علامة، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo) من قبل HPLC-ED، في DNA من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة الحيوانية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
HPLC قياس الحمض النووي الأكسدة العلامات البيولوجية، 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine، في الخلايا المستزرعة والأنسجة الحيوانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويرتبط الاكسدة مع العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية، وكذلك التمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا، مما يؤدي إلى أكسدة الجزيئات الكبيرة، بما في ذلك الحمض النووي. ولذلك، كشف الفعال للأكسدة الحمض النووي مهم لمجموعة متنوعة من التخصصات البحثية، بما في ذلك الأدوية والسموم. A العلامات البيولوجية المشتركة للأضرار الحمض النووي oxidatively هو 8-أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo، غالبا ما يشار إليها باسم خطأ 8-هيدروكسي-2'-deoxyguanosine (8-OH-dGuo أو 8 -oxo-DG)). وقد وصفت عدة بروتوكولات لقياس 8 أوكسو dGuo ارتفاع ضغط اللوني السائل مع كشف الكهروكيميائية (HPLC-ED). ومع ذلك، طبقت هذه أساسا لDNA تنقية تعامل مع الموالية للتأكسد. بالإضافة إلى ذلك، بسبب الاختلافات المنهجية بين المختبرات، ويرجع ذلك أساسا إلى الاختلافات في المعدات التحليلية، واعتماد أساليب نشرت للكشف عن 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED يتطلب التحسين دقيق من قبل كل مختبر. Aبروتوكول شامل، واصفا مثل هذه العملية الأمثل، غير متوفرة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة للكشف عن 8 أوكسو dGuo من قبل HPLC-ED، في DNA من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة الحيوانية. فإنه يوضح كيفية إعداد عينة من الحمض النووي يمكن بسهولة وبسرعة الأمثل لتقليل أكسدة الحمض النووي غير المرغوب فيها التي يمكن أن تحدث أثناء إعداد العينات. ويظهر هذا البروتوكول كيفية اكتشاف 8 أوكسو dGuo في الخلايا المستزرعة الإنسان غدية السنخية (أي الخلايا A549) تعامل مع عامل مؤكسد KBrO 3، ومن الطحال من الفئران المعرضة للثنائي بنزو الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (صفر، ع) chrysene (DBC، المعروف سابقا باسم بنزو (أ، ل) بيرين، DalP). عموما، يوضح هذا العمل كيف منهجية HPLC-ED يمكن أن يكون الأمثل بسهولة للكشف عن 8 أوكسو dGuo في العينات البيولوجية.
المقدمة
تساهم أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، الذي مستويات ثابتة للدولة يمكن أن تزيد خلال العديد من الحالات المرضية والتمثيل الغذائي xenotoxic، إلى زيادة وتيرة الحمض النووي من التلف التأكسدي. بين عدة النووية nucleobases الممكنة منتجات الأكسدة، ويمكن أن الحمض النووي من التلف التأكسدي بسهولة أن تقاس باستخدام علامة مستقرة 8 أوكسو 7،8-ثنائي هيدرو-2'-deoxyguanosine (8 أوكسو dGuo)، التي تعد واحدة من أشكال المؤكسد من 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-أوكسو dGuo هو آفة DNA الأكثر وفرة 2، وبالتالي، وقد درس لمزيد من التفاصيل والعلامات البيولوجية أكسدة الحمض النووي على الرغم من وجود الحمض النووي عدة منتجات الأكسدة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
التأكد من أن جميع تربية الحيوانات، والإسكان، والتعامل مع والتجريب الالتزام بالقواعد واللوائح المحلية وتمت الموافقة على أن بروتوكولات التجارب قبل البدء في أي دراسة. لوصف التجارب، تمت الموافقة على رعاية الحيوان، ومعالجة، والعلاج من قبل لجنة رعاية الحيوان وزارة الصحة الكندية. راجع "الجدول الكواشف" للحصول على معلومات الموردين.
1. جمع العينات البيولوجية
- الخلايا أو الأنسجة الحيوانية
- زراعة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ولوحظ dGuo أن يكون لها الوقت الاحتفاظ 4.7 دقيقة في حين كان 8 أوكسو dGuo فترة الاحتفاظ حوالي 6.4 دقيقة (الشكل 2A وباء). هناك اختلاف حول 1000 أضعاف في مرتفعات الذروة بين التحاليل اثنين، كما يظهر في الشكل 2C. تم الحصول على Voltammograms لمدة 8-أوكسو dGuo وdGuo وفقا للمعايير التوالي في إمكانية العمل في مجموعة من 0،2-1،1 V. تم تحديد إمكانية العمل المثلى ل8 أوكسو dGuo أن يكون +0.5 V، و+0.9 V لdGuo (الشكل 3). هذه الإمكانات هي في الاتفاق .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من أن 8 أوكسو dGuo تم الإبلاغ عن العلامات البيولوجية مفيدة للأكسدة الحمض النووي، يمكن تقدير لها موثوق تحديا. على الرغم من أن العديد من الطرق التي نشرت موجودة، وهناك حاجة ل، نظرة عامة وصفية شاملة للبروتوكول للسماح للباحثين لنشر الأسلوب في مختبراتهم. نحن هنا تقديم لمحة مفصلة عن بروتوكول القائم HPLC من شأنها أن تسمح للمستخدمين الجدد لإنشاء وسيلة فعالة للكشف عن 8 أوكسو dGuo النوعي والكمي.
ثلاث طرق رئيسية ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح أو المصالح المالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل مبادرة وزارة الصحة الكندية الجينوم بحوث والتنمية (GRDI) والاستراتيجية التنظيمية الكندية للتكنولوجيا الحيوية (CRSB). الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 8-oxo-dGuo القياسي | شركة كايمان للكيماويات | 89320 | يشار إليها بشكل غير لائق باسم "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" ؛ انظر الشكل 1< / قوي> والنص للحصول على التفاصيل. |
| الفوسفاتيز القلوي | سيجما ألدريتش | P5931 | من E. القولوني< / em> |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | مخلبات المعادن الثقيلة |
| ديسفيروكسامين ميسيلات | سيجما ألدريتش | D9533 | |
| dGuo قياسي | سيجما ألدريتش | D7145 | |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة | سيجما ألدريتش | S9390 | |
| الحمض النووي من المنوية السلمون | Sigma-Aldrich | D1626 | ملح الصوديوم |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII ، من البنكرياس البقري |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ثنائي ملح ثنائي الصوديوم ثنائي هيدرات (EDTA) | سيجما ألدريتش | E4884 | يذوب المركب تماما حتى يتم ضبط درجة الحموضة في المحلول إلى 8.0 ( على سبيل المثال< / em> مع هيدروكسيد الصوديوم) |
| F12-K وسائط | ATCC | 30-2004 | |
| مصل الأبقار الجنيني | ATCC | 30-2020 | |
| عمود الحرس | تخصصات كروماتوجرافية | YBA 99S03 0204GC | يحمي الكولون من التلوث ؛ قد يؤدي أيضا إلى تراكم الضغط |
| كلوريد المغنيسيوم | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| فوسفات | الصوديوم أحادي القاعدةSigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات | Invitrogen | 15190-250 | |
| إنزيم Phosphodiesterase I ؛ | Sigma-Aldrich | P3243 | النوع الثاني من Crotalus adamaneus سم |
| مفالط تفلون | Thomas Scientific | 7724T-1 أو 7724T-5 لمدة 1 أو 5 مل ، على التوالي | الحجم (القدرة على الاحتفاظ) يعتمد على كمية العينة المراد معالجتها. |
| عمود Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC مع | تخصصات كروماتوغرافية | YBA 99S03 1546WT |
المراجع
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
