Method Article

المناعية لتصور الفئران المعوية العصبي تطوير النظام

DOI:

10.3791/52716

⸱

April 29th, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Neurosciences, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون الجهاز العصبي المعوي من خلايا القمة العصبية التي تتكاثر وتهاجر وتستعمر الأمعاء. تتمايز خلايا القمة العصبية إلى خلايا عصبية ذات علامات خاصة بالنمط الظاهري للناقل العصبي. يصف هذا البروتوكول تقنية لتشريح وتثبيت وتلوين الجهاز الهضمي الجنيني للفئران لتصور تعبير الناقل العصبي للجهاز العصبي المعوي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون الجهاز العصبي المعوي من خلايا القمة العصبية التي تتكاثر وتهاجر وتستعمر الأمعاء. بعد الاستعمار ، يجب أن تتمايز خلايا القمة العصبية إلى خلايا عصبية ذات علامات خاصة بالنمط الظاهري للناقل العصبي. يتم تحديد الخلايا العصبية الكولينية ، وهي نمط ظاهري رئيسي للناقل العصبي في الجهاز العصبي المعوي ، عن طريق تلطيخ أسيتيل ترانسفيراز الكولين (ChAT) ، وهو إنزيم توليف الأسيتيل كولين. تم إعاقة الجهود التاريخية لتصور الخلايا العصبية الكولينية بسبب الأجسام المضادة ذات الخصائص المختلفة للجهاز العصبي المركزي مقابل الجهاز العصبي المحيطي ChAT. لقد تغلبنا نحن وآخرون على هذا القيد باستخدام جسم مضاد ضد Chat المشيمي ، والذي يتعرف على كل من Chat المركزي والمحيطي ، لتصور الخلايا العصبية الكولينية المعوية الجنينية بنجاح. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بمقارنة هذا الجسم المضاد بالمراسلين الوراثيين ل ChAT وأظهرنا أن الجسم المضاد أكثر موثوقية أثناء التطور الجنيني. يصف هذا البروتوكول تقنية لتشريح وتثبيت وتلوين الجهاز الهضمي الجنيني للفئران لتصور تعبير الناقل العصبي للجهاز العصبي المعوي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعمل الجهاز العصبي المعوي (ENS) التي تسيطر على الحركة، وامتصاص المواد الغذائية، وتدفق الدم المحلي، أمر ضروري في الحياة 1. يتم تشكيل ENS من قبل خلايا قمة العصبية (NCC) التي تتكاثر، الهجرة واستعمار القناة الهضمية، حيث تفرق في العقد تحتوي على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. مرض هيرشسبرونغ (HSCR، الانترنت وراثة مندلية في مان)، وهو اضطراب خلقي multigeneic مع حدوث 1 في 4000 ولادة حية، يمكن اعتبار المرض prototypic لدراسة تشكيل ENS تعطلت. في HSCR، NCC تفشل في الهجرة إلى استعمار وأطوال مختلفة بين المعى المؤخر القاصي 2. بالإضافة إلى ذلك، ترتبط الجهاز الهضمي المشتركة الأخرى (GI) وجود عيوب التنموية في عدد من الأطفال، مثل التشوهات الشرجية، atresias المعوية، واضطرابات الحركة مع اضطرابات في وظائف ENS الأساسية، وعلى الأرجح يرتبط خفية، لا تقدر حق قدرها، والتغيرات التشريحية وتغييرات وظيفية في3-6 ENS. لذلك، قد التقنيات التي تسمح لنا لفهم المحددات التنموية لتشكيل ENS تسليط الضوء على المرضية والعلاج المحتملة للاضطرابات الجهاز الهضمي للأطفال.

وبعد الهجرة والاستعمار، NCC يفرق في الخلايا العصبية مع علامات محددة لالنمط الظاهري العصبي بهم. تتكون الخلايا العصبية كوليني ما يقرب من 60٪ من الخلايا العصبية المعوية 7، ويمكن الكشف عنها بواسطة تلطيخ للأسيتيل كولين (الدردشة)، الانزيم توليف لالناقل العصبي الأسيتيل كولين مثير. تاريخيا، يحاول تصور ومرتبك الخلايا العصبية الكوليني التي كتبها اختلاف مستضد خصوصية الأجسام المضادة الموجهة ضد النظام العصبي المركزي (CNS) دردشة مقابل الجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية) دردشة 8-10. ومع ذلك، الأجسام المضادة الموجهة ضد المشيمة دردشة تعترف كل من دردشة المركزية والطرفية 11-13، ولدينا تقنيات وصفها مؤخرا التي تسمح للvisualization من ENS الخلايا العصبية الكوليني مع حساسية عالية في التنمية في وقت سابق من تحقق مع خطوط مراسل دردشة 14.

هنا، نقدم تقنية لتشريح، وتحديد والمناعية من الفئران الجنينية GI الجهاز لتصور ENS العصبي التعبير في الخلايا العصبية. لهذه الدراسات، ولقد استخدمت الفئران دردشة لجنة المساواة العرقية تزاوج مع R26R: الحيوانات tdTomato لإنتاج دردشة لجنة المساواة العرقية؛ R26R: floxSTOP الفئران tdTomato (كما هو موضح دردشة لجنة المساواة العرقية tdTomato في جميع أنحاء المخطوط): floxSTOP. ثم تم تزاوج هذه الحيوانات مع متماثل الفئران مراسل دردشة GFP، للحصول على الفئران التعبير عن كل صحفيين الفلورسنت التي تكشف عن التعبير دردشة 14. هذه الحيوانات مراسل هما على خلفية C57BL / 6J ومتاحة تجاريا (مختبرات جاكسون، بار هاربور، ME).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت جامعة ويسكونسن رعاية الحيوان واستخدام اللجنة كافة الإجراءات.

1. إعداد حلول

  1. استخدام 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كما عازلة تشريح وحل الشطف.
  2. إعداد 30٪ سكروز عن طريق وزن 30 غرام من السكروز ومكان في زجاجة. إضافة 99 مل من برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 1 مل 10٪ أزيد الصوديوم. تخلط جيدا حتى يذوب كل من السكروز. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
  3. إعداد عرقلة الحل عن طريق خلط 1X PBS، 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.1٪ تريتون-X-100. تخلط جيدا وتخزينها في الثلاجة لحين الحاجة إليها.
  4. إعداد 8٪ امتصاص العرق (PFA) حل في برنامج تلفزيوني 1X عن طريق وزن كمية مناسبة من PFA في برنامج تلفزيوني 1X ثم احتضان عند 65 درجة مئوية حتى يذوب تماما. متجر في 25 مل قسامات في -20 ° C الفريزر لحين الحاجة إليها. تمييع إلى 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1X في يوم من الاستخدام.

2. الأجنة والوتر تشريحأيون

  1. وفقا لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة وافقت البروتوكولات، الموت ببطء توقيت الماوس الحوامل ونقل الرحم إلى 60 مم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
  2. تحت المجهر تشريح باستخدام مقص حاد، وقطع جدار الرحم مفتوح لفضح الأجنة. إزالة الأجنة من الرحم والمكان إلى بيئة نظيفة 60 مم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
  3. الموت ببطء كل ​​الجنين عن طريق قطع الرأس في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X. إذا كنت تستخدم الفئران المعدلة وراثيا تحتوي على البروتينات الفلورية، تحت إضاءة مضان، وتحديد الأجنة وراثيا إيجابية.
  4. تشريح الجهاز الهضمي من كل جنين باستخدام مجهر تشريح. باستخدام ملقط غرامة، توجيه الجنين مثل أن الجانب الأيسر ومتجهة لأعلى وعلى الجانب الأيمن هو ضد الجزء السفلي من طبق بيتري. إزالة جدار الجزء العلوي من الجسم من الجنين لفضح الأعضاء الداخلية. إدراج ملقط غرامة بين جدار الجسم الظهري والأعضاء الداخلية. كرتابعنا ملقط ضد بعضها البعض في عمل قطع مثل مقص لإزالة الأعضاء الداخلية من الجنين.
  5. مزيد من دون تشريح الجهاز الهضمي بعيدا عن الأجهزة المحيطة ومن ثم وضع كل الجهاز الهضمي في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.

3. تثبيت للGI شيتاغونغ

  1. شطف كل الجهاز الهضمي 3 مرات مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني 1X ثم قم باستبدال مع 4٪ PFA. إصلاح مساحات GI في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge على منصة هزاز في RT لمدة 1.5 ساعة. شطف مساحات GI 3 مرات لمدة 5 دقائق على RT ثم لمدة 1 ساعة على منصة هزاز. في هذه المرحلة، وتخزين مساحات GI في 4 ° C في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم لحين الحاجة إليها.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، تخزين الأجنة في 30٪ سكروز لمدة تصل إلى واحد من دون أي تأثير على سلامة الأنسجة. تخزين العينات في 30٪ سكروز يسمح معالجة لاحق من العينات إما لالمناعية أو إلى أكتوبر لالبرد sectioniنانوغرام. بدلا من ذلك، المضي قدما في بروتوكول المناعية المفصلة أدناه.

4. بروتوكول المناعية

  1. إذا تم تخزينها العينات في 30٪ سكروز، شطف لهم 3 مرات لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1X على منصة هزاز.
  2. وضع مساحات GI إلى عرقلة الحل على منصة هزاز ل1H في RT.
  3. إزالة حل الحجب واحتضان مساحات GI مع كمية مناسبة من الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل إما 4 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية على منصة هزاز. استخدام 1: 1000 تخفيف البشرية الأضداد المضادة هو جين تاو (المصل تم الحصول عليها من المريض)، 1: 1000 تخفيف من الدجاج مكافحة الأخضر بروتين فلوري (GFP) الأجسام المضادة و 1: 100 التخفيف من الماعز الأجسام المضادة لمكافحة الدردشة.
    ملاحظة: علينا الاستفادة من الأجسام المضادة لمكافحة البشري هو جين تاو التي تم الحصول عليها محليا من المريض، ومع ذلك، هي أضداد هو جين تاو المتاحة تجاريا، على سبيل المثال، والماوس المضادة للهو جين تاو، (استخدام في 1: 500 تمييع).
  4. شطف مساحات GI في برنامج تلفزيوني 1X3 مرات لمدة 5 دقائق ثم لمدة 1 ساعة على RT على منصة هزاز.
  5. استبدال برنامج تلفزيوني 1X مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف 1: 500 في عرقلة الحل على منصة هزاز إما 4 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. استخدام حمار مكافحة الإنسان وأمين صبغ رد الفعل مثل Dylight، حمار Cy2 مكافحة الدجاج وحمار المضادة للماعز Cy5. إذا باستخدام الماوس المضادة للهو الضد ثم استخدم 1: 500 التخفيف من حمار مكافحة الماوس أمين صبغ رد الفعل 405.
    ملاحظة: كثافة GFP الذاتية وtdTomato التعبير ووضوح المناعية الزيادة مع التقدم في العمر التنموي. نحن immunostain عادة الشجاعة الجنينية بشكل فردي في 0.2 مل الأنابيب مع 150 ميكرولتر من الحل تلطيخ من أجل الحد من حجم الأجسام المضادة المستخدمة وأيضا لضمان كفاءة تلطيخ من الأنسجة.
  6. شطف مساحات GI في برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات لمدة 5 دقائق ثم لمدة 1 ساعة على RT على منصة هزاز.
  7. ضع بضع قطرات من مضان تصاعد المتوسطة مع دابي على شريحة زجاجية. تزج هيئة تنظيم الاتصالات GIط م في المتوسط ​​مضان تركيب وإضافة غطاء زجاجي مباشرة على الجزء العلوي من الأنسجة. مضان تصاعد -G المتوسطة هو مركب للذوبان في الماء الذي يوفر ختم شبه دائم.
    ملاحظة: استخدام مضان المتوسطة المتزايدة مثل Vectashield وهو الجلسرين المستندة إلى تصاعد المتوسط ​​الذي يمنع يتلاشى وphotobleaching من الأجسام المضادة. كل من هذه المنتجات تمكين الأنسجة ليتم تخزينها لفترات طويلة من الزمن في 4 ° C.
  8. التقاط الصور من كل من fluorophore باستخدام مجهر متحد البؤر. استخدام موجات الإثارة لfluorophores والفلاتر المستخدمة الواردة في الجدول 3.
  9. لتحليل صورة بمساعدة الكمبيوتر باستخدام البرمجيات المناسبة تبعا لنوع من متحد البؤر استخدامها لالتقاط الصور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفناها سابقا جيل من الفئران التعبير عن كل GFP وtdTomato للصحفيين الفلورسنت التي تكشف عن التعبير دردشة 14. باختصار، كانت تزاوج الفئران دردشة لجنة المساواة العرقية مع R26R: floxSTOP: الحيوانات tdTomato لإنتاج دردشة لجنة المساواة العرقية؛ R26R: الفئران tdTomato (وتسمى دردشة لجنة المساواة العرقية tdTomato): floxSTOP. ثم تم تزاوج هذه الحيوانات مع متماثل الفئران مراسل دردشة GFP. تم عزل الأجنة وتم تشريح الأنسجة قب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت مختبرنا وغيرها من الجهات التي عيوب المعوية في HSCR لا تقتصر على القولون بانعدام العقد ولكن تمديد قريب، حتى في الأمعاء الدقيقة عقدي 5،15،16. وتشمل هذه التغيرات تغيرات في الخلايا العصبية ENS الكثافة والعصبي النمط الظاهري وربما تمثل dysmotility التي لوحظت في المرضى الذين يعانون من HSCR. لقد استخدمت التقنيات المذكورة أعلاه في جهودنا لفهم محددات تشكيل ENS. على وجه التحديد، وقد استخدمت هذه التقنيات لتصور الخلايا العصبية أكسيد النيتريك سينسيز (nNOS) الخلايا العصبية، ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل أعد الصورة جائزة طب الأطفال الأمريكية الجراحية جمعية مؤسسة (AG) والمعاهد الوطنية للصحة K08DK098271 (AG).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
فوسفات مخزن محلولملحي أوكسويدBR0014G
سكروزفيشرS2
أزيد الصوديومفيشرBP9221
ألبومين مصل البقرفيشرBP1605
تريتون X-100سيجماX100
بارافورمالديهايدسيجما158127
60 ملم أطباق بتريفيشرFB0875713A
مجهر مضاننيكونSMZ-18 مجهر
نيكونSMZ-18 مجسم مجسم
ملقط دقيقأدوات العلوم الدقيقة11252-20
1.5 مل أنابيب EppendorfVWR20170-038
Fluoromount-GSouthernBiotech ، برمنغهام ، AL0100-01
شرائح زجاجيةفيشر12-550-15
غطاء زجاجيVWR16004-330
مجهر متحد البؤرنيكوننيكون A1
عناصرنيكون
تشريح

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
  2. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
  3. Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
  4. Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
  5. Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
  6. Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
  7. Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
  8. Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
  9. Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
  10. Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
  11. Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
  12. Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
  13. Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
  14. Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
  15. Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
  16. Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
  17. Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enteric Nervous SystemMurine Embryonic GutCholine AcetyltransferaseImmunostaining TechniquePlacental ChAT AntibodyNeural Crest CellsCholinergic NeuronsGastrointestinal Tract DissectionEmbryonic DevelopmentNeurotransmitter Phenotype

Related Articles