Method Article

القيطم المورق نموذجا لتحديد الترجمة انخفاض قيمة

DOI:

10.3791/52724

⸱

September 27th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Team "Early Stages of Parkinson's Disease" of the Jean-Pierre Aubert Research Center, INSERM UMR-S1172, CHRU Lille, University of Lille 1 and Lille 2, 2Team "Signal Division Regulation", CNRS UMR 8576, University of Lille 1

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدث التحكم في تخليق البروتين بشكل أساسي في خطوة بدء الترجمة ، حيث ترتبط أوجه القصور باضطرابات متنوعة. لفهم مسببات أسبابهم بشكل أفضل ، وصفنا هنا بروتوكولا باستخدام بويضات Xenopus laevis لتقييم ترجمة نسخة mos في وجود طفرة لعامل بدء الترجمة eIF4G1.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخليق البروتين هو عملية أساسية في التعبير الجيني يؤثر العمليات البيولوجية المختلفة وخاصة التكيف مع الظروف البيئية. الخطوة بدء، الذي ينطوي على تجميع مفارز الريباسي في مرنا بدء كودون، تشارك عامل الشروع بما في ذلك eIF4G1. ترتبط عيوب في هذا معدل الحد خطوة من الترجمة إلى اضطرابات متنوعة. لدراسة العواقب المحتملة لمثل هذه deregulations، القيطم المورق البويضات تشكل نموذجا جذابا مع درجة عالية من الحفاظ على الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية مع الإنسان. بالإضافة إلى ذلك، أثناء النضج الانتصافي، وقمع transcriptionally البويضات ويتم تحويل جميع البروتينات اللازمة من قبل الايجاد، من mRNAs المستمدة أمومي. هذا النموذج غير مكلفة يمكن مرنا خارجي لتصبح متكاملة تماما مع ترجمة فعالة. هنا يوصف بروتوكول لتقييم الترجمة مع عامل الفائدة (هنا eIF4G1) باستخدام ستورإد مرنا الأمهات التي هي أول من مذيل بعديد الأدينيلات وترجمتها خلال نضوج البويضة كما قراءات الفسيولوجية. في البداية، مرنا synthetized من قبل في المختبر النسخ من البلازميدات الفائدة (هنا eIF4G1) يتم حقنها في البويضات وحركية نضوج البويضة بواسطة جرمينال الحويصلة كشف انهيار يتحدد. ودرس الهدف مرنا الأمهات سيرين / موس ثريونين البروتين كيناز. يتم التحقيق في تذييل بعديد الأدينيلات وترجمتها لاحقا إلى جانب التعبير والفسفرة من بروتينات موس يشير التعاقبي المشاركة في نضوج البويضة. الاختلافات في البروتوكول الحالي لطرح ويقترح العيوب متعدية أيضا التأكيد على انطباق العام لها. في ضوء الأدلة التي تخليق البروتين الشاذة قد تكون لهم علاقة في التسبب في اضطرابات العصبية الناشئة، ويوفر هذا النموذج فرصة لتقييم بسهولة هذا الانخفاض وتحديد أهداف جديدة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات هي العناصر الأساسية للحياة الخلوية وبالتالي في نطاق أكبر من الكائن الحي. وتضمن الجزء الأكبر من الوظائف الخلوية بما في ذلك الهيكل، والنقل، والحفز رد فعل، والتنظيم، التعبير الجيني الخ التعبير عنها هو نتيجة لآلية معقدة للترجمة السماح للتحويل من مرنا في البروتين. يخضع ترجمة لضوابط مختلفة للتكيف وتنظيم التعبير الجيني وفقا لاحتياجات الخلية، أثناء التطور والتمايز، والشيخوخة، والضغوط النفسية أو المظاهر المرضية.

وتنقسم الترجمة إلى 3 مراحل (بدء، واستطالة وإنهاء) ويعرض 3 أنظمة الترجمة بدء من أجل الاستجابة لهذه الاحتياجات: تعتمد على كأب، وقبعة مستقل عبر

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب القيطم في منشأة الحيوان من جامعة ليل 1 وفقا للقواعد من المبادئ التوجيهية مجلس الاتحاد الأوروبي (86/609 / EEC) عن التجارب على الحيوانات المختبرية. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلية (لجنة D'Ethique أون التجريب أنيمل نور-با-دو-كاليه، CEEA 07/2010).

1. سيت المناولة

  1. تحضير محلول مخدر: حل 1 غرام من مسحوق سلفونات تريكين الميثان في 1 لتر من الماء المعقم.
  2. يغرق ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النضج الحركي من البويضات القيطم وتحديد GVBD نسبة البويضة بعد 24 ساعة من التحفيز PG (أرقام 2B، 2C):

من أجل دراسة النتائج متعدية للطفرة eIF4G1-DN، وردا على PG في القيطم المورق البويضات microinjected مع كرنا eIF4G1-DN يتم مقارنة eIF4G1-WT وظروف التحكم الأخرى (H 2 O، GFP). ضوابط تتيح لتقييم حالات البويضة microinjection بغض النظر عن طبيعة كرنا حقن أو من eIF4G1 overexpressi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الترجمة هي آلية المشاركة في الفيزيوباثيا العديد من الاضطرابات الإنسان بما في ذلك العديد من الأمراض العصبية. على سبيل المثال في مرض باركنسون اقترحت عدة تقارير ضعف في الترجمة المرتبطة بطفرات وراثية 8،12،13.

تتوفر لدراسة ترجمة العديد من النماذج الخلوية. هنا، من أجل دراسة النتائج متعدية من طفرة في eIF4G1 الذي يعمل طفرة السلبية السائدة عن الحد من التفاعل بين eIF4G1 وeIF4E شركاء 8، والقيطم

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث بمنحة من INSERM ، جامعة ليل 1 ، جامعة ليل 2 ، مركز المستشفى الإقليمي في ليل (CHR de Lille). تعترف MCCH بالدعم المقدم من مؤسسة فرنسا وتود أن تشكر IRCL ، البروفيسور سوننبرغ على هدية بلازميدات V5 ، والدكتور ديسوس (معهد باستور ، ليل) على هدية الأجسام المضادة ل GFP ، و UMS 3387 (جامعة رين) حيث يتم شراء بويضات Xenopus والدكتور تايمانز (JPArc ، ليل) للقراءة النقدية لنص المخطوطة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
كبريتات الميثان ثلاثيSandozMS-222البويضات التعامل
مع الملقطموريادومون MC40
الستربتومايسين / البنسلينسيجما781
بيروفات الصوديومسيجماP2256
مثبط تريبسين فول الصوياسيجماT9128
التتراسيكلينسيجماT7660
خيط فيكريل قابل للامتصاص للطبيب البيطريJohnson& amp Johson IntlJV1205
Collagenase ARoche Diagnostics10103586001
PmeINew England BiolabsR0560Sتحضير mRNA الاصطناعي
DNA / RNAse الخالي من H2< / sub>OLife Technologies10977
أسيتات الصوديومMerck6268
الإيثانول المطلقسيجما02854
نانو قطرةحراري علمي
TBE 10XEppendorf0032006.507
بروميد الإيثيديوم 10 مجم / مللايف تكنولوجيز15585-011
mMESSAGE mMACHINE KitAmbion by Life TechnologiesAM1344
MOPSSigmaM1254
EDTAFluka03609
AgaroseLife Technologies16500-500
الفورمالديهايد 37٪ميرك1.04003.1000
فورماميدفلوكا47671
جل دوك تصويربيوراد
بويضات ماصة مع 100 8 "شعيرات دموية زجاجيةشركة دروموند العلمية3-000-510-Xالحقن
المجهرياستبدال الزجاج 8 "شركة دروموند العلمية3-000-210-G8
0.45 & micro ؛ مرشح mMilliporeSLHA025NB
البروجسترونسيجماP0130
هيبسسيجماH3375ويسترن بلطخ
NaClسيجماS5886
SDSBiorad161-0301
MgCl2< / sub>SigmaA3294
مصل الأبقار الألبومينسيجماA4612
leupeptinSigmaL8511
aprotininSigmaA1153
benzamidineSigmaB6506
PMSFSigmaP7626
فانادات الصوديومSigmaS6508
Laemmli bufferBiorad161-0737
NuPAGE Novex 4-12٪ جل البروتين Bis-Tris ، 1.0 مم ، 15 جيداLife TechnologiesNP0323BOX
الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ،456-1036 و -1096
W.E.P. Compagny
GlycineBiorad161-0718
Tris-HClBiorad161-0719
Hybond ECL غشاءAmersham LifeScience 10401180
MethanolVWR20846-292
Ponceau Red (0.5٪)SigmaP3504
Tween 20SigmaP2287
Anti-GFPLife TechnologiesA11122
anti-V5Santa Cruz Biotechnologysc-58052
anti-Eg2Santa Santa كروز التكنولوجيا الحيويةsc-27884
المضادة ل Eg2-Pخلية الإشاراتC39D8
المضادة ل ERK2سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-1647
المضادة ERK2-P (Tyr204)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-7976
المضادة ل Rskسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-231
المضادة للموسسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-86
الفجل الحار المضاد للفأر بيروكسيداز المسمى الجسم المضاد الثانويسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-2005
بيروكسيداز الفجل الحار المضاد للأرانب المسمى الجسم المضاد الثانويسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-2812
مكافحة الفجل الحار بيروكسيداز المسمى الجسم المضاد الثانويسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-2378
نظامالكشف عن ECL المتقدمAmershan Life ScienceRPN2135
PBS 1xSigmaP4417مقايسة بولي الأدينيل
TRIZOL (كاشف تحلل Qiazol)Qiagen79306
ChloroformSigma31998-8
IsopropanolSigma278475-1L
RNeasy mini kitQiagen74106
RTL buffer   ؛Qiagen79216
RNAse الحرة مجموعة DNAseQiagen79254
PrimersEurogentec
T4 RNA ligase 1  New England BiolabsM0204S
مجموعة النسخ العكسي c-DNA عالية السعةالأنظمة الحيوية التطبيقية ، تقنيات الحياة4368813
Taq polymeraseLifeTechnologies 10342020
العرق نظام النشاف الأفقي شبه الجاف المصغر TGX Biorad

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  2. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Xenopus laevisTranslation InitiationOocyte MaturationGerminal Vesicle BreakdownWestern BlotmRNA PolyadenylationMos Signaling CascadeProgesterone StimulationeIF4G1 MutationCapillary Microinjection

Related Articles