يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصوير لايف من النيكوتين المستحثة اشارة الكالسيوم وناقل عصبي الإصدار جنبا إلى جنب بطني الحصين المحاوير

8.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52730

⸱

يونيو 24, 2015

 ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Science, Stony Brook University

في هذه المقالة

ملخص

لقد طورنا مستحضرا جينيا خيمريا، لدائرة الحصين البطني - التكتومبنس في المختبر الذي يسمح بالتصوير الحي المباشر لتحليل الآليات قبل المشبكية لمستقبلات الأستيل كولين النيكوتين (nAChRs) الإرسال المشبكي بوساطة يوفر هذا الإعداد أيضا نهجا إعلاميا لدراسة آليات ما قبل وبعد التشابك المشبكي للدونة المتشابكة.

الملخص

< p class = 'jove_content'> يعد التعزيز المستمر للإشارات المحورية وزيادة إطلاق الناقل العصبي عن طريق تنشيط مستقبلات أستيل كولين النيكوتين قبل التشابك (nAChRs) آلية مهمة للتعديل العصبي بواسطة الأسيتيل كولين (ACh). إن صعوبة الوصول إلى استكشاف آليات الإشارات داخل المحاور السليمة وفي الأطراف العصبية في المختبر وفي الجسم الحي قد حددت تقدما محدودا في دراسة المكونات قبل التشابك للدونة المتشابكة. نقدم هنا مستحضرا جينيا خيمريا، لدائرة الحصين البطني (vHipp)-acumbens (nAcc) في المختبر والذي يسمح بالتصوير المباشر المباشر لتحليل كل من مكونات الانتقال قبل وبعد التشابك مع تغيير المظهر الجيني بشكل انتقائي للخلايا العصبية قبل وبعد التشابك المشبكي. نوضح أن الإسقاطات من vHipp microslices ، كمدخلات محورية قبل التشابك ، تشكل نقاط اشتباك عصبي متعددة وموثوقة مع أهداف ما بعد التشابك ، الخلايا العصبية المشتتة من nAcc. يتم الكشف عن التوطين قبل التشابك لأنواع فرعية مختلفة من nAChRs ويتم مراقبة الإرسال المشبكي بوساطة إشارات النيكوتين قبل التشابك عن طريق التسجيل الفيزيولوجي الكهربي المتزامن وتصوير الخلايا الحية. يوفر هذا المستحضر أيضا نهجا إعلاميا لدراسة آليات ما قبل وبعد التشابك للدونة المشبكية الجلوتاماتيرجيك في المختبر.

المقدمة

تعديل الكوليني من الدائرة استثارة يساهم في الجوانب الأساسية للمعرفة، وتغيير التشكيل الكوليني هو سمة من سمات اضطرابات الاعصاب والعصبية والنفسية بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون والفصام والإدمان 1-4. آلية المتبعة في تسهيل الكوليني من انتقال متشابك في الجهاز العصبي المركزي هي عن طريق تفعيل مباشر من nAChRs المحلية في مواقع ما قبل متشابك. تفعيل هذه المستقبلات ما قبل متشابك يؤدي إلى زيادة الكالسيوم داخل الخلايا 2+ ([كا 2+] ط) في محطات ما قبل متشابك - سواء بصورة مباشرة، وذلك بسبب تصرف الكالسيوم عالية نسبيا لبعض الأنواع الفرعية nAChR، وبشكل غير مباشر، عبر إشارات بين الخلايا شلالات 5، وبالتالي تعزيز الإفراج العصبي. في الواقع، وقد تم ربط تفعيل nAChRs قبل متشابك مع التغيرات في الإفراج عن مجموعة واسعة من الناقلات العصبية بما في ذلك الغلوتامات، GABA، أدن تشافيز، لالثاني الدوبامين 10/06. وإن كان قد درس هذه العملية بصورة غير مباشرة باستخدام الطرق الكهربية في مختلف نقاط الاشتباك العصبي، للصحفيين البصري [كا 2+] ط وإعادة تدوير حويصلة متشابك تسمح بمزيد من القياس المباشر والدقيق زمنيا للظواهر ما قبل متشابك.

وقد ثبت التعريب قبل متشابك من nAChRs مقنع مع وضع العلامات المناعية الذهب مباشرة من nAChRs في مجهرية الإلكترون (EM) مستوى 11،12. كما تم استخدام عدة تقنيات أخرى للتصدي لتوطين nAChR غير مباشرة، بما في ذلك الكشف عن مواقع nAChRs subunit- الوهم بروتين فلوري في الخلايا العصبية مثقف 13،14، تسجيل الكهربية من التيارات nAChR في محطات متشابك 15،16، رصد النيكوتين الناجم عن التغيرات في [كا 2+] أنا في النهايات العصبية متشابك بواسطة التصوير الحي الخلية 17، والرصد غير المباشر لإطلاق النواقل العصبية في محطة متشابك من قبلتقنيات التصوير الخلية الحية مع مؤشرات الفلورية، بما في ذلك إيماس من الحويصلات المشبكية ينظر إليها من قبل styryl الأصباغ متقابلة الزمر FM (FM1-43 وFM4-64) و / أو synapto-pHluorin وللصحفيين العصبي الفلورسنت معين، مثل CNiFERs لأدن تشافيز وiGluSnFr لالغلوتامات 18-20. عموما، هذه المناهج الحالية لتحديد توطين ما قبل متشابك من nAChRs معقدة، وتتطلب أنظمة وتقنيات خاصة للسماح تحديد موثوقة ورصد الفسيولوجية للنشاط قبل متشابك.

نحن هنا وصف البروتوكولات ومعدات للنظام المشترك الثقافة في المختبر من قرن آمون البطني (vHipp) - النواة المتكئة (تحقق نموا مطردا) الدائرة التي توفر الوصول المباشر إلى تحديد وتحليل كل المكونات السابقة واللاحقة متشابك من انتقال متشابك. وتبين لنا أمثلة على توطين ما قبل متشابك من nAChRs والتصوير الخلية الحية من nAChR بوساطة كا 2+ الإشارات وإطلاق الناقلات العصبية منظمة العمل العربيةالمحاور نانوغرام vHipp. A امتدادا طبيعيا (واضحة) من بروتوكول المعروضة هنا هو إعداد الاتصالات قبل وبعد متشابك تتألف من الخلايا العصبية من الأنماط الجينية المختلفة. بهذه الطريقة يمكن تقييم مساهمة منتج جين معين إلى ما قبل و / أو آليات ما بعد متشابك التشكيل مباشرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا للمعاهد القومية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (NIH النشر رقم 80-23، منقحة 2012) وتمت الموافقة على الدراسات التي المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام لجان البحث في ستوني جامعة بروك (# 1618 و # 1792).

1. vHipp-تحقق نموا مطردا متشابك المشارك الثقافات

  1. الفئران التضحية (يوم بعد الولادة 0-3، من النوع البري (WT) أو nAChRs α7 خط الماوس المعدلة وراثيا) مع CO 2. قطع رأس كل الجرو وحفظ الذيل في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي لمدة رجعي التنميط الجيني. قم بتنفيذ الخطوات التالية في غطاء تعقيمها.
  2. إزالة الجزء العلوي من الجمجمة مع مقص وملقط لفضح الدماغ كله. بدءا من المرحلة حيث قشرات الدماغ جزء من كل caudally أخرى، الحصول على قسم الاكليلية التي تحتوي على القشور الخلفي بما في ذلك vHipp 5،21 تشريح تحت المجهر.
  3. تشريح الخامسشرائح الأنسجة هيب تحتوي المنطقة CA1-مرفد وفقا لوضع أطلس مخ الفأر 22 (الشكل 1A). نقل إلى صحن الثقافة 35 ملم تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة الباردة (4 ° C)، مقطعة إلى شرائح رقيقة صغيرة (حوالي 100 ميكرون × 100 ميكرون microslices).
  4. قبل احتضان 12 مم بولي-D-يسين / coverslips الزجاج المطلي laminin داخل 24 جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع وسائل الإعلام الثقافة (~ 500 ميكرولتر) لمدة 30 دقيقة على الأقل في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. إزالة وسائل الاعلام قبل الطلاء microslices.
  5. لوحة مع ماصة باستير مصقول النار على مركز للساترة مع الحد الأدنى من وسائل الإعلام (~ 50 ميكرولتر، التي تحتوي على ~ 20 قطعة من microslices) لتسهيل الحجز على إإكسبلنتس. لوحة microslices vHipp القادمة من حيوان واحد (إما + / + أو - / - التركيب الوراثي للخط α7 المعدلة وراثيا) على كل ساترة.
  6. بعد تسوية لل explants على ساترة، إضافة بلطف وسائط إضافية (~ 100 ميكرولتر) من خلال الالجدار ه بحيث أن مستوى وسائل الإعلام مرتفع بما يكفي لتغطية كامل لل explants على المحيط، ولكن ليس تلك في وسط ساترة.
  7. بعد O / N الحضانة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة، تفريق الخلايا العصبية تحقق نموا مطردا من أيام الجنينية 18 إلى ما بعد الولادة يوم 1 الفئران WT وإضافة إلى إإكسبلنتس.
    1. تشريح خارج الأنسجة تحقق نموا مطردا وفقا لوضع أطلس مخ الفأر 20 (الشكل 1B).
    2. مقطعة إلى قطع صغيرة (حوالي 500 ميكرون × 500 ميكرون microslices) ونقل إلى أنبوب 15 مل.
    3. علاج مع 0.25٪ التربسين (2 مل) لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C. غسل قطع الأنسجة ثلاث مرات مع وسائل الاعلام غسل الباردة (5 مل، 4 ° C)، يليه غسل ​​واحد في وسائل الإعلام ثقافة البارد (5 مل، 4 ° C). تسمح تعليق للراحة لمدة 5 دقائق في كل خطوة غسل، ثم تخلصي من طاف بعناية.
    4. فصل الخلايا عن طريق سحن لطيف في 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة مع ماصة باستير طفيفة مصقول النار.
    5. عبرتعليق خلية فر إلى أنبوب آخر 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة س لمدة 5 دقائق. إزالة طاف و resuspend الخلايا في وسائل الإعلام الثقافة في 1 مل لكل 6 الجراء. تفريق الخلايا عن طريق pipetting بلطف في وسائل الإعلام عدة مرات مع باستور ماصة مصقول النار.
    6. إضافة 0.25 مل من الخلايا تحقق نموا مطردا انتشروا في كل ساترة مع إإكسبلنتس vHipp.
    7. الحفاظ على الثقافات في ترطيب 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة. وضع لوحات الثقافة على المبلل منصات شاش معقم لتحقيق الاستقرار ميكانيكيا والحفاظ على الرطوبة، وتسهيل تشكيل المشبك.

2. سيتولوجية مناعية

  1. إصلاح الثقافات (5-7 أيام في المختبر) في بارافورمالدهيد 4٪ / 4٪ سكروز / PBS (~ 500 ميكرولتر في ساترة، 20 دقيقة، RT).
  2. ثقافات Permeabilize مع 0.25٪ تريتون X-100 / PBS (~ 500 ميكرولتر في ساترة، 5 دقائق، RT).
  3. ثقافات كتلة مع 10٪ مصل حمار عادي في برنامج تلفزيوني (~ 500 ميكرولتر في ساترة، 30 دقيقة، RT) قبل antibodذ تلطيخ. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية O / N عند 4 درجات مئوية. استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: nAChRs المضادة (α 4 -ECD 1: 500، مضادة للα 5 وحدات فرعية، 1: 500)، نقل الغلوتامات مكافحة حويصلي 1 (1: 250)، ومكافحة GAD65 (1: 100).
  4. يغسل الأجسام المضادة الأولية خارجا مع PBS (3 مرات / ~ 500 ميكرولتر في ساترة، 5 دقائق) ثم احتضان الثقافات في الأجسام المضادة الثانوية مترافق لاليكسا 488 (~ 500 ميكرولتر في ساترة، 1: 500) أو اليكسا 594 (~ 500 ميكرولتر في ساترة ، 1: 500) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
  5. احتضان الثقافات في αBgTx مترافق لاليكسا 594 (~ 500 ميكرولتر في ساترة، 1: 1000 في وسائل الإعلام الثقافة) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل التثبيت لوضع العلامات α7 سطح * nAChRs.
  6. جبل وختم coverslips.
  7. التقاط الصور مع المجهر مضان مجهزة أهداف الخطة-امزيغ (20X مع 0.8 NA أو 63X النفط مع 1.4 NA) وكاميرا CCD.

3. FM1-43 القائم الحويصلي فيوجن

  1. الحفاظ على الثقافات (5-7 أيام في المختبر) في غرفة التصوير، جبل الغرفة على الغزل القرص المجهر متحد البؤر. يروي باستمرار (1 مل / دقيقة) مع HBS كوكتيل في RT.
  2. وقف نضح وتحميل الثقافات مع 10 ميكرومتر FM1-43 في 56 ملي K + ACSF (~ 500 ميكرولتر) لمدة 90 ثانية (تلوين)، وغسل صبغ الخارجي بعيدا لمدة 15 دقيقة مع الكالسيوم 2+ HBS مجانية تحتوي على ADVASEP-7 (0.1 ملم) لكنس بغشاء FM1-43.
  3. تحفيز الثقافات مع 56 ملي K + ACSF (~ 500 ميكرولتر) دون FM1-43 لمدة 120 ثانية (destaining)، تحميل الثقافات مع FM1-43 باستخدام نفس الظروف، ويغسل مرة أخرى مع الكالسيوم 2+ HBS مجانية تحتوي على ADVASEP-7 ل 15 دقيقة.
  4. الحصول FM1-43 الصور مضان مع القرص الغزل المجهر متحد البؤر مجهزة هدف خطة-امزيغ (60X المياه مع 1.4 NA، الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 530 نانومتر) والتقاط الصور مع كاميرا CCD.
  5. جمع الأساس الصور FM1-43 مضان (كل 2 ثانية لمدة 1 دقيقة) كما تحكم مسبقا النيكوتين. تطبيق النيكوتين (1 ميكرومتر) من خلال نضح السريع (2 مل / دقيقة) لمدة 1 دقيقة، ثم يغسل النيكوتين خارجا مع HBS كوكتيل. إبقاء الوقت الفاصل بين الصور التقاط قبل وأثناء وبعد التطبيق النيكوتين كل 2 ثانية لمدة 5 دقائق.
  6. تحديد FM1-43 كثافة مضان قبل (F تلطيخ) وبعد (F destaining) تطبيق النيكوتين في كل حبة متشابك.
  7. حساب المبلغ الإجمالي من نشره مضان FM1-43 على طول المحاور vHipp عن طريق قياس الفرق من FM1-43 كثافة مضان قبل وبعد تطبيق النيكوتين (ΔF = F تلطيخ -F destaining). تحليل جزء من انخفاض كثافة مضان بعد النيكوتين مع المعادلة التالية: F = انخفاض٪ ΔF / F تلطيخ.

4. التصوير الكالسيوم

  1. شطف الثقافات (5-7 أيام في المختبر) بسرعة مع HBS العادية، ثم تحميل الثقافات مع 5 ميكرومتر فلوو-4 كا 2+ مؤشر (AM استر) و 0.02٪ Pluronic F-127 في HBS (2 مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
  2. تغسل فلوو-4 حل مع HBS (3 مرات / 5 دقائق). عودة الثقافات إلى الحاضنة (37 ° C / 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  3. الحفاظ على الثقافات في نفس غرفة التصوير ونفس الشروط كما هو موضح في FM1-43 مقرها قسم الانصهار الحويصلي (راجع الخطوة 3.1).
  4. جمع الصور فلوو-4 مضان من التوقعات محور عصبي من vHipp شرائح صغيرة مع هدف الخطة-امزيغ (60X المياه مع 1.4 NA، الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 530 نانومتر) وكاميرا CCD.
  5. جمع الأساسية فلوو-4 صور مضان (كل 10 ثانية لمدة 2 دقيقة) عن السيطرة قبل النيكوتين، وتطبيق النيكوتين (1 ميكرومتر) من خلال نضح السريع (2 مل / دقيقة) لمدة 1 دقيقة، ثم يغسل النيكوتين خارجا مع HBS كوكتيل. إبقاء الوقت الفاصل بين الصور التقاط قبل وأثناء وبعد التطبيق النيكوتين كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة.
  6. حفظ جميع الأطر من الخام فلوو-4 صور مضان والتصدير على شكل سلسلة منصور تنسيق TIFF لمزيد من التحليل.
  7. جمع شدة متكاملة من فلوو-4 مضان على طول المحاور vHipp قبل وبعد تطبيق النيكوتين.
  8. تطبيع كثافة مضان متكاملة مع المعادلة التالية: ΔF / F 0 = (FF 0) / F 0، حيث F 0 هو قبل النيكوتين كثافة مضان متكامل لتصحيح الخلفية وF هو كثافة مضان متكاملة على طول المحاور vHipp في كل نقطة زمنية بعد تطبيق النيكوتين. تحليل ورسم تطبيع كثافة مضان متكاملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إعداد العاملين يتكون من جينات خيالية شارك الثقافات الدوائر vHipp-تحقق نموا مطردا في المختبر. التوقعات الصادرة عن microslices vHipp، كمدخل المحاور قبل متشابك، يمكن أن تجعل الاتصالات متشابك مع أهداف ما بعد متشابك، والخلايا العصبية تفرق من تحقق نموا مطردا. النيكوتين التي يسببها مستدام (≥ 30 دقيقة) تيسير انتقال glutamatergic من الخلايا العصبية تحقق نموا مطردا معصب vHipp محاور 21 والكالسيوم لفترات طويلة مما يدل على طول المحاور vHipp 5 عبر α7 قبل متشابك * ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصف إعداد شارك في ثقافة إعادة يستسلم بطني الدوائر قرن آمون-المتكئة في المختبر. هذا الفحص تصاريح إعداد بسيط نسبيا ويمكن الاعتماد عليها لمحات المكانية والزمانية التي تفعيل nAChRs قبل متشابك تنتزع تعزيز نقل glutamatergic 5، 21.

يتم تعريف المشترك الثقافات باعتبارها نمو مختلف أنواع معينة من الخلايا في صحن واحد التي يمكن أن توفر الظروف الفسيولوجية في المختبر لإظهار في الجسم الحي تش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر Yehui Qin و Mallory Myers على الدعم الفني. كما نشكر الدكتور سيغيسموند هاك على تزويدنا بالجسم المضاد ل α4-ECD. هذا العمل مدعوم من قبل المعاهد الوطنية للصحة NS22061 منح ل L. W. R.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1. الثقافة الإعلامية (50 مل)
Neurobasal   ؛جيبكو1088802248 مل
B-27 مكملاتغذائية جيبكو0080085-SA1 مل
بنسلين ستربتومايسينجيبكو10908-0100.5 مل
مكمل جلوتا ماكسجيبكو35050-0610.5 مل
عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF)جيبكو15140-12220 نانوغرام / مل
HBSS ، خال من الكالسيوم ، لا المغنيسيوم ، لا الفينول الأحمر   ؛جيبكو14175-09599 مل
هيبس (1 م)جيبكو15630-1301 مل
كلوريد الصوديومسيجماS9888   ؛135 ملم
KClSigmaP9333 5 مللي متر
MgCl2SigmaM8266 1 ملي متر
CaCl2,SigmaC1016 2 مللي
HEPESSigmaH3375 10 ملم
الجلوكوزسيجماG0350500 10 ملم
4. كوكتيل HBS للتصوير الحي ، الرقم الهيدروجيني = 7.3
كلوريد الصوديوم، سيجماS9888 & nbsp ؛135 ملم
KClSigmaP9333 5 مللي متر
MgCl2SigmaM8266 1 ملي متر
CaCl2,SigmaC1016 2 مللي
HEPESSigmaH3375 10 ملم
الجلوكوزسيجماG0350500 10 ملم
السموم الرباعية  Tocris10782 & micro; م
بيكوكولينتوكرس13110 & M
D-AP-5Tocris10550 & Micro; M
CNQXTocris104520 & micro; M
LY341495Tocris120910 & micro; M
5. خالي من الكالسيوم  HBS    الأس الهيدروجيني = 7.3
كلوريد الصوديومسيجماS9888   ؛135 ملم
KClSigmaP9333 5 مللي متر
MgCl2SigmaM8266 1 ملي متر
HEPESSigmaH3375 10 ملم
الجلوكوزسيجماG0350500 10 ملم
6. 56 ملي مولار البوتاسيوم ACSF درجة الحموضة = 7.4
كلوريد الصوديومسيجماS9888119 ملي
مولار KClسيجماP933356 ملي
مولار MgSO4.7HسيجماM18801.3 ملي
CaCl2سيجماC10162.5 ملي
NaH2PO4سيجماS82821 ملي
NaHCO3سيجماS576126.2 ملي مولار
الجلوكوزسيجماG0350500 10 ملم
< TD colspan = "4" >2. وسائط الغسيل (HBSS ، 100 مل)< td colspan = "4" >3. HEPES محلول ملحي مخزن مؤقتا  (HBS)    الأس الهيدروجيني = 7.3

المراجع

  1. Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
  2. Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
  3. Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
  4. Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
  5. Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719(2013).
  6. McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
  7. Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
  8. Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
  9. Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
  10. Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911(2011).
  11. Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
  12. Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
  13. Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
  14. Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  15. Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
  16. Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
  17. Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
  18. Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  19. Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
  20. St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
  21. Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
  22. Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
  23. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  24. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
  25. Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
  26. Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
  27. Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تصوير الخلايا الحيةالمجهر البؤري ذو القرص الدوارمستقبلات الأسيتيل كولين النيكوتينيةتحضير الهجائن الجينيةدائرة النواة المتكئة في الحصين البطنيصبغ FM 1 43مؤشر الكالسيوم Flu Oh Four
تصوير لايف من النيكوتين المستحثة اشارة الكالسيوم وناقل عصبي الإصدار جنبا إلى جنب بطني الحصين المحاوير
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.