الخواص الميكانيكية والمجهرية من المصفوفة خارج الخلية تؤثر بقوة الهجرة 3D من الخلايا. طريقة في المختبر لدراسة السلوك الزماني المكاني هجرة الخلايا في بيئات متغيرة biophysically، في كل من السكان ومستويات الخلايا الفردية، يوصف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نظام جل متحدة المركز لدراسة دور الفيزيائية الحيوية من مصفوفة المكروية في 3D خلية الهجرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
قدرة الخلايا على الهجرة أمر بالغ الأهمية في مجموعة واسعة من وظائف الخلية في جميع مراحل الحياة من التطور الجنيني والتئام الجروح إلى الورم والانبثاث السرطان. وعلى الرغم من الجهود البحثية المكثفة، لا تزال غير مفهومة مبادئ الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية الأساسية للهجرة الخلية بالكامل، وخاصة في ثلاثية الأبعاد (3D) microenvironments ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. هنا، نحن تصف مقايسة في المختبر يهدف إلى إتاحة الفحص الكمي لل3D السلوكيات الهجرة الخلية. طريقة يستغل القدرة mechanosensing الخلية والميل إلى الهجرة إلى المصفوفة خارج الخلية غير مأهولة سابقا (ECM). نحن نستخدم غزو خلايا سرطان الثدي الغازية للغاية، MDA-MB-231، في المواد الهلامية الكولاجين كنظام نموذج. انتشار السكان الخلية وديناميات الهجرة من الخلايا الفردية خلال الأسابيع الثقافة يمكن رصدها باستخدام التصوير الخلية الحية وتحليلها لاستخراج البيانات حل spatiotemporally. علاوة على، فإن هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة للمصفوفات خارج الخلية متنوعة، مما يتيح وسيلة بسيطة لكنها قوية للتحقيق في دور العوامل الفيزيائية الحيوية في المكروية على الهجرة الخلية.
المقدمة
هجرة الخلايا تلعب دورا رئيسيا في مختلف الاستجابات الفسيولوجية مثل التطور الجنيني، تخثر الدم، والاستجابة المناعية وكذلك في العمليات المرضية مثل أمراض الأوعية الدموية، والالتهابات، والسرطان 1. تشريح العوامل الكيميائية الحيوية والفيزياء الحيوية الكامنة وراء الهجرة الخلية لذا فمن المهم أساسي ليس فقط لفهم المبادئ الأساسية للالوظائف الخلوية، ولكن أيضا لتعزيز مختلف التطبيقات الطبية الحيوية، كما هو الحال في هندسة الأنسجة، ومكافحة ورم خبيث وتطوير الأدوية المضادة للالتهابات. منذ المراقبة في الجسم الحي يمثل تحديا تقنيا، وقد تركز الكثير من الجهود في المختبر على خلاصة الهجرة الخلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
حصاد 1. خلية
- الحصول MD-MBA-231 الخلايا من 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة. فصل الخلايا من لوحة زراعة الأنسجة باستخدام 0.5٪ التربسين-EDTA الحل. استخدام 1 مل من محلول التربسين-EDTA لخلايا مستنبتة في قارورة T25.
- خلايا بيليه في 15 مل أنبوب مخروطي بواسطة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق، ونضح طاف، وخلايا resuspend في 5 مل من وسائل الإعلام الثقافة.
- عد كثافة الخلايا، ρ، وذلك باستخدام عدادة الكريات.
ملاحظة: لتحضير هلا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إجراء فحص هلام متحدة المركز المقدمة هنا باستخدام خلايا سرطان الثدي الغازية للغاية، MDA-MB-231، مع 2.4 ملغ / مل الداخلي جل الكولاجين وكثافة البذر خلية = 2 × 10 6 خلية / مل، وكمثال على ذلك. كما هو مبين في الشكل 2، وعادة بعد بضعة أيام من الثقافة، خرقت الخلايا واجهة هلام الداخلية، الخارجي، وبدأت لغزو هلام الخارجي. ينتشر السكان خلية في الغالب شعاعيا الخارج.
يمكن تعديل الشروط البلمرة من ه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول ، نصف مقايسة في المختبر لدراسة سلوك الهجرة ثلاثي الأبعاد للخلايا في بيئات المصفوفة التي تشبه طوبولوجيا ECMs التي تمت مواجهتها في الجسم الحي. هناك ثلاث نقاط قوة رئيسية لهذا الاختبار مقارنة بالطرق الأخرى المتاحة حاليا. أولا ، يسمح هذا الاختبار للمرء بفحص آليات هجرة الخلايا في وقت واحد على مستوى السكان ومستوى الخلية الفردية. هذا يفتح إمكانيات دراسة الهجرة الجماعية للخلايا13 ، والتي اقتصرت حتى الآن إلى حد كبير على فحوصات ثنائية الأبعاد14 ، مع مراقبة سلوك الخلية الفردي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
الكتاب أشكر W. الشمس وK. يانسن للمناقشات حاسمة، وتقر الدعم من الميكانيكا الحيوية مختبر النانو في جامعة سنغافورة الوطنية. يعترف NAK الدعم من معهد التمويل الدولي زمالة ماري كوري.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حاضنة زراعة الخلايا | فيشر Scientific Pte Ltd | الموديل: 371 ، S / No 318854-6055 | |
| مجهر متحد البؤر | نيكون A1R | مجهر المسح الضوئي بالليزر المقلوب متحد البؤر مجهز بغرفة حاضنة | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | تقنيات | الحياة10082-147 | |
| صبغة CellTracker الفلورية CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| طبق ذو قاع زجاجي | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | قطره 35 مم بقطر 12 مم بئر زجاجي قاع |
| كثافة الدم | iN CYTO | DHC-N01 (تحسين Neubauer) مقياس | |
| الأس الهيدروجيني للمعالجات | الدقيقة Hanna Instruments | درجة الحموضة 211 | |
| Nutragen الكولاجين | المتقدم BioMatrix | # 5010-D | الكولاجين البقري المذاب بالحمض من النوع الأول (درجة الحموضة ~ 2) |
| العدسة الموضوعية | نيكون | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC ، WD 8.2-6.9 مم ، NA 0.45. | |
| بنسلين ستربتومايسين | لايف تكنولوجيز | 15140-122 | |
| مقياس الأس الهيدروجيني | Sartorius | S / No 29153352 | مقياس الأس الهيدروجيني الأساسي PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
المراجع
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
