مقالة منهجية

الكشف عن الأمراض المرتبطة α-synuclein التي كتبها المحسن ELISA في دماغ الفئران المعدلة وراثيا Overexpressing A53T الإنسان تحور α-synuclein

DOI:

10.3791/52752

⸱

مايو 30, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم وصف ELISA يقدم نهجًا كميًا جديدًا. إنه يكشف بشكل خاص عن α-synuclein المرتبط بالمرض (αSD) في نموذج الفأر المعدّل وراثيًا (M83) من synucleinopathy باستخدام عدة أجسام مضادة إما لشكل αS المصلّب في Ser129 أو الجزء C- الطرفي من البروتين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالإضافة إلى أساليب راسخة مثل لطخة غربية، وهناك حاجة إلى أساليب جديدة بسرعة وسهولة لتحديد الأمراض المرتبطة α-synuclein (αS D) في نماذج تجريبية من synucleopathies. خط الماوس المعدلة وراثيا (M83) الإفراط في التعبير عن αS A53T البشرية وعفوية تطوير النمط الظاهري السريرية مثيرة بين ثمانية و 22 شهرا من العمر، وتتميز الأعراض بما في ذلك فقدان الوزن، والسجود، وإعاقة حركية شديدة، وقد استخدم في هذه الدراسة. للالتحليلات الجزيئية من αS D (αS الأمراض المرتبطة) في هذه الفئران، وقد صمم لELISA لتحديد على وجه التحديد αS D في الفئران المريضة. وأظهر تحليل للنظام العصبي المركزي في هذا نموذج الفأر وجود αS D بشكل رئيسي في مناطق الدماغ الذيلية والحبل الشوكي. لم تكن هناك اختلافات في توزيع αS D بين ظروف تجريبية مختلفة مما يؤدي إلى المرض السريري، أي في uninoculATED والشيخوخة عادة الفئران المعدلة وراثيا والفئران الملقحة مع مقتطفات الدماغ من الفئران المريضة. كشف محدد من αS D مناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد Ser129 مفسفر αS بواسطة ELISA المترابطة في جوهرها مع أن حصلت عليها لطخة غربية والمناعية. بشكل غير متوقع، وقد لوحظت نتائج مماثلة مع العديد من الأجسام المضادة الأخرى ضد الجزء C من محطة αS. نشر αS D، مما يشير إلى تورط آلية "تشبه بريون"، وهكذا يمكن رصدها بسهولة وكميا في هذا النموذج الماوس باستخدام نهج ELISA.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر الطرق الحالية للكشف عن α-سينوكلاين المرتبط بالمرض ( αSD ) في النماذج التجريبية لمرض باركنسون (PD)، مثل المناعية المجهرية أو Western blot، طرقًا متعبة وغير كمية. تُعرف هذه الأمراض التنكسية العصبية بتجميع ألفا-سينوكلاين بشكل رئيسي على شكل أشكال مضمّنة تحتوي على شكل متراكم للبروتين المشبكي المذاب بشكل طبيعي αS1,2 ( أجسام Lewy والأعصاب Lewy). بشكل طبيعي، يتم فسفرة αS بشكل طفيف فقط، إلا أنه يتم فركه بشكل مفرط في بقايا سيرين 129 في هذه الأشكال المضمنة3 ويمكن مراقبته بواسطة أجسام مضادة موجهة بشكل خاص ضد αS المفسفر في Ser129، وبالتالي يوفر علامة موثوقة للأمراض.

تشير الأبحاث الحديثة إلى أن آلية "شبه بريونية" قد تكون مرتبطة بانتشار تجميع αS داخل الجهاز العصبي للمريض المصاب4,5. أبلغت هذه الدراسات عن تسارع حدوث سينوكيلوباثيا عن طريق حقن المستخلصات الدماغية المحتوية على αSD في نموذج الفأر المعدّل وراثيًا (M83) الذي يعبر عن بروتين αS البشري الطافر A53T المرتبط بإعاقة حركية شديدة تحدث عندما تكبر الفئران6. بنفس الطريقة، أكدت لقاحات داخل المخ من αS المتراكم المؤتلف في نفس نموذج الفأر M83 تسارع التجميع5. تم الإبلاغ عن تحريض رواسب αS المفسفر بعد حقن الفئران C57Bl/6 من النوع البري إما بـ αS المؤتلف الليفي أو المستخلصات الدماغية من مرضى DLB البشريين7,8. أشار Sacino et al.9 مؤخرًا إلى أنه بعد حقن αS البشري الليفي، يمكن تحريض تشكل شامِل لـ αS في المخ في الفئران M83، ولكن ليس في الفئران المعدلة وراثيًا E46K أو الفئران غير المعدلة وراثيًا حيث كانت تشكل αS المستحثة عابرة ومقيدة بشكل رئيسي في موقع الحقن. أكدت الدراسات الحديثة على القرود انتشار تجميع αS بعد حقن المستخلصات المشتقة من PD في الأنواع الأقرب إلى البشر10.

يقترح الارتباط بين تعديلات αS ومرض باركنسون أن αSD هو مؤشر بيولوجي محتمل لمرض باركنسون11. أظهرت دراسة حديثة اكتشاف تجميعات قابلة للذوبان قليلة الجزيئات من α-سينوكلاين في السائل الدماغي الشوكي البشري (CSF) والبلازما كمؤشر بيولوجي محتمل لمرض باركنسون بناءً على نظام ELISA التقليدي للساندويتش باستخدام نفس الجسم المضاد لالتقاط واكتشاف αS12. بناءً على نفس الطريقة، تم التعرف على البروتينات متعددة الوحدات في العينات البيولوجية، بما في ذلك الدماغ، نظرًا لوجود عدة نسخ من المستضدات الموجودة في الأشكال المجمعة13. مؤخرًا جدًا، تم اكتشاف αS المرضي في السائل الدماغي الشوكي للمرضى المصابين بأمراض أجسام Lewy ثبت إصابتهم باستخدام كل من مجموعة ELISA مع جسم مضاد شديد الخصوصية ضد αSD (5G4) وفحص الترسيب المناعي14. يمكن لهذه الطرق التمييز بين مرضى PD/DLB عن أنواع أخرى من الخرف.

تمت دراسة انتشار αS "شبه البريونية" بشكل أكبر في نموذج الفأر المعدّل وراثيًا M83 باستخدام نهج ELISA الذي تم تصميمه لتحديد αSD بشكل خاص15. في هذه الدراسة، نقدم بروتوكول ELISA المفصل المستخدم للكشف الكمي عن αSD في الفئران المريضة (سواء تم حقنها بـ αSD من الفئران M83 المريضة أم لا) وبشكل خاص في مناطق الدماغ المستهدفة بشكل خاص بواسطة العملية المرضية في هذا النموذج الفأري المعدّل وراثيًا M834.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكانت كافة الإجراءات والبروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 86/609 / EEC والتي صادقت عليها يأتي، اللجنة الوطنية الفرنسية للنظر في الأخلاق في التجارب على الحيوانات (بروتوكول 11-0043). وتم إيواء الحيوانات والرعاية في افق ANSES في مرافق التجريبية في ليون (موافقة B 69387 0801).

1. إعداد الفئران

  1. الموت ببطء الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من جرعة قاتلة من بنتوباربيتال الصوديوم.
  2. استرداد كامل الدماغ من الجمجمة الماوس ووضعه في 35 ملم البلاستيك طبق بيتري على الجليد حتى الاستخراج.
  3. استخراج النخاع الشوكي العنقي.
    ملاحظة: αS استخراج إما من أحد نصفي الدماغ بعد باجتزاء سهمي أو من أدمغة فئران تشريح، متوفرة بعد التجارب المدرجة في الجدول 1.
التجربهتي الفئران
اللقاح (أي ما يعادل الدماغ) 		فترة البقاء على قيد الحياة
(نقطة في البوصة) 		متوسط ​​/ بقاء القصوى
(الأيام الخوالي) 		αS د الكشف عن طريق ELISA
/ WB / IHC
1 الفئران Uninoculated 441 ± 166 419/736 08/08
2 الفئران الملقحة (0.2 ملغم) 150 ± 52 140/241 09/09

الجدول 1. قائمة من التجارب التي أجريت على الفئران M83. أجريت التطعيمات في 6 أسابيع لتجربة 2 في منطقة striato القشرية مع 20 ميكرولتر من جناسة دماغ الفأر المرضى (1٪ بالوزن / المجلد في الجلوكوز 5٪)، بعد التخدير من 6 أسابيع من العمر الفئران M83 متماثل بنسبة 3٪ استنشاق الأيزوفلورين. نقطة في البوصة: آخر أيام inoculأوجه.

2. αS استخراج من الدماغ الأنصاف

  1. قطع Sagittally الدماغ للحصول على نصفين. تزن كل شوط في أنبوب ribolysis تحتوي على كرات طحن.
  2. إعداد كبيرة من الملح (HS) العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 750 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA، 1 ملم DTT، 1٪ الفوسفاتيز ومثبط البروتياز الكوكتيل. إضافة العازلة عالية من الملح إلى نصفين الدماغ للحصول على 20٪ (وزن / حجم) الخليط.
  3. إعداد عينات من نصفي الدماغ باستخدام الخالط الميكانيكية في 6.0 م / ث لمدة 23 ثانية مرتين. بعد أول التجانس 23 ثانية، ووضع الأنابيب التي تحتوي على الخليط على الجليد لمدة 2 دقيقة قبل دورة 23 ثانية الثانية.
  4. الطرد المركزي العينات في 1000 x ج لمدة 5 دقائق للقضاء على شظايا الدماغ unground. استرداد supernatants، تقسم إلى 200 مكل والاحتفاظ بها في -80 ° C لتحليل ELISA لاحق.

3. αS استخراج من تشريح مناطق الدماغ

  1. تشريحالدماغ كله في 35 ملم البلاستيك طبق بيتري على الجليد مع انخفاض المكبر الطاقة (8X التكبير) باستخدام اثنين من forcipes التي يتم الاحتفاظ بها معا إلا عند تشريح الحصين الغايات. لا تتجاوز 10 دقيقة للحفاظ على سلامة الدماغ. وضع الدماغ الجانب الأيمن حتى واسترداد مناطق الدماغ التالية في هذا النظام:
    1. مستقل واحد من اثنين بصيلات الشم باستخدام ملقط وضعت للتو وراء لمبة. سلخه من الدماغ عن طريق حركة إلى الأسفل. كرر هذه العملية لمبة الثانية.
    2. إسفين بلطف ملقط في فترة ما بين اللحاء اثنين وتحريكه إلى الأمام لتسهيل التفكك من اللحاء اثنين. الحفاظ على الدماغ في مكان واحد مع ملقط، واستخدام آخر لفصل القشرة من الحصين.
    3. وضع ملقط 2 ملم تحت القشرة. الحفاظ على ضغط لطيف على ملقط حتى الجزء العلوي من الحصين مرئيا. تقشر الجزء الأول من القشرة، وكرر مع الجزء الثاني. استخدام ملقط لفصل اللحاء اثنينابتداء من الساعة الحصين وتتحرك نحو الجزء الأمامي من الدماغ.
    4. وضع ملقط مفتوحة حول واحدة من الحصين. إغلاق ملقط في الجزء السفلي من الحصين ثم إزالة برفق، واستعادة قدر الإمكان. كرر الإجراء الحصين الثاني.
    5. وضع ملقط مفتوحة أقل من واحد من مخططية وفصل برفق من الدماغ. استخدام ملقط لإزالة أي القشرة المتبقية من المخطط. كرر هذا الإجراء المخطط الثاني.
    6. استخدام ملقط لخفض بلطف 2 مم كفاف من المخيخ لتسهيل فصل المخيخ من المخ. وضع ملقط خلف المخيخ وإزالته عن طريق تحريك ملقط إلى الأمام.
    7. استخدام جزء واسع من ملقط لرفع الدماغ المتوسط ​​من أجل أن نرى بوضوح حيث ينضم جذع الدماغ. جعل شق عمودي عند تقاطع ثم إزالة جذع الدماغ.
    8. وضع ملقط وراء الدماغ المتوسط، وهو ماق تتألف من أربعة مبان مدورة. شق عموديا حتى تم فصل الدماغ المتوسط ​​تماما من الدماغ المتبقية.
  2. إعداد الخليط من متغير٪ (وزن / حجم) في المخزن HS، اعتمادا على كمية من الأنسجة المتاحة، أي 5٪ جناسة لوزن ما بين 10 و 30 ملغ، 10٪ لوزن ما بين 30 و 80 ملغ، و 20٪ لوزن فوق 80 ملغ.
    1. إضافة حجم مناسب من العازلة HS إلى مناطق الدماغ تشريح للحصول على٪ المتوقعة من جناسة.
    2. دوامة وتأكد من أن الأنسجة مغمورة تماما في المنطقة العازلة HS.
    3. التجانس عينات أعدت من مناطق الدماغ تشريح أو الحبل الشوكي العنقي مع طاحونة الأنسجة تتكون من أنبوب زجاجي البورسليكات واثنين من المطاحن، A و B.
    4. صب كل منطقة في الدماغ لابد من سحقهم مباشرة في أنبوب. إدراج مدقة A في أنبوب وسحب عليه. كرر هذه الحركة عن عشر مرات لفصل الأنسجة. ثم استخدام مدقة B إلى Continue طحن الأنسجة مع 20 حركات أخرى. نقل الخليط في أنبوب 1.5 مل مع ماصة نقل 1 مل.
  3. الطرد المركزي العينات في 1000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية للقضاء على أي شظايا الدماغ unground. استرداد supernatants، تفرق بينهم ما يصل إلى 200 مكل والاحتفاظ بها في -80 ° C لتحليل ELISA لاحق.

4. الكشف عن αS بواسطة ELISA

  1. تمييع الأجسام المضادة طلاء إلى 0.01 نانوغرام / مل. استخدام إما معاداة αS بولكلونل الأرنب أو وحيدة النسيلة استنساخ 42 الأجسام المضادة في 50 ملي نا 2 CO 3 / NaHCO 3 العازلة (درجة الحموضة 9.6).
  2. معطف ال 96 جيدا microplates مع 100 ميكرولتر لكل بئر من هذا الحل طلاء، وترك في 4 درجات CO / N. استخدام مكافحة αS الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة في حل طلاء للELISAs باستخدام الأجسام المضادة كشف syn514، استنساخ 42، LB509، AS11، 4D6 أو 8A5. استخدام مكافحة αS وحيدة النسيلة الأجسام المضادة استنساخ 42 كحل طلاءجنبا الى جنب مع مكافحة pSer129 αS الكشف عن الأجسام المضادة.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن أبقى لوحات في 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد قبل ELISA يتم تنفيذ.
  3. استخدام لوحة غسالة لغسل الصحون خمس مرات مع 300 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.05٪ توين 20 (PBST) لكل بئر. من هذه الخطوة فصاعدا، الحضانة في RT.
  4. إضافة 200 ميكرولتر من T20 PBS عازلة تمنع لكل بئر. يهز لمدة 1 ساعة على 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
  5. تمييع الخليط الدماغ (التخفيف 1: 100 من 20٪ من الخليط، 01:50 من٪ 10 من الخليط و1:25 من 5٪ من الخليط في PBST BSA 1٪)، وإضافة 100 ميكرولتر إلى كل بئر. ثم احتضان لمدة 2 ساعة في حين تهتز في 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
  6. إضافة مختلف الأجسام المضادة كشف αS في PBST مع BSA 1٪ في التخفيفات المذكورة في قائمة المواد. احتضان لمدة 1 ساعة على 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
  7. إضافة إما المضادة-mouse أو المضادة للأرنب تقارن مفتش HRP المخفف 1: 8000 في PBST تستكمل مع جيش صرب البوسنة 1٪ لمدة 1 ساعة في حين تهتز في 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) حل كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام بينما تهتز في 150 دورة في الدقيقة.
  9. وقف رد فعل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك لكل بئر ثم قياس الامتصاصية في 450 نانومتر مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
  10. لتحليل البيانات، طرح قيمة OD الحصول عليها في بئر مع جميع الكواشف باستثناء أي عينات مخ الفأر (جيد فارغة) من القيم OD قياس لكل من العينات التي تم تحليلها.

5. حاتمة رسم الخرائط

  1. أداء رسم الخرائط حاتمة وفقا للطريقة التي وصفها عثمان 16. لفترة وجيزة، والببتيدات بقعة من سلسلة α-synuclein الإنسان تحتوي على 12 الأحماض الأمينية على نتروسليلوز مع 10 الأحماض الأمينية متداخلة.
  2. منع مع 50 ملي تريس / 150 ملي كلوريد الصوديوم درجة الحموضة عازلة 10 تحتوي على 0.05٪ توين 20 و 5٪ مسحوق الحليب. احتضان الأجسام المضادة في عرقلة الحل بتركيز 2 ميكروغرام الأجسام المضادة لكل مل في 2-10 درجة CO / N.
  3. يغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام 50 ملي تريس / 150 ملي كلوريد الصوديوم العازلة درجة الحموضة التي تحتوي على 10 0.05٪ توين 20. احتضان مع الماعز المضادة للماوس مفتش HRP المترافقة. غسل غشاء خمس مرات أخرى باستخدام نفس المخزن ثم يلون باستخدام وصمة عار TMB عدة تلطيخ الغربية.

6. التحليل الإحصائي

  1. استخدام البرنامج R وnlme حزمة لأداء آثار مختلطة انحدارات لنموذج OD. لكل المقارنة، نفذ نموذج الأثر الانحدار مختلطة. استخدام الأثر الثابت للتمييز أعراض من مجموعة أعراض.
  2. استخدام تأثير عشوائي لتعكس التغير في تكرار للماوس معين. تحقق متماثل التفاوت عن طريق فحص المخلفات وإذا لزم الأمر، استخدام وظائف التباين في تصميم نموذج لهيكل الفرق من أخطاء داخل المجموعة وذلك تمشيا مع بينيرو وبيتس 17 اضبط 0.05 كعتبة أهمية P.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، وELISAs استخدام التعرف على وجه التحديد αS الأمراض المرتبطة (αS D) في الخليط الدماغ أعدت في منطقة عازلة عالية من الملح من الفئران المريضة M83. استخدام أجسام مضادة الاعتراف تحديدا pSer129 αS (ع = 0.0074)، وELISA يميز بسهولة القديمة والفئران المريضة (> 8 أشهر من العمر) من الشباب (2-5 أشهر من العمر)، M83 الفئران السليمة (الشكل 1). وأظهرت عدة أجسام أخرى إشارات عالية بالمثل (0.6> OD) فقط في الخليط الدماغ من الفئران المريضة. هذا هو الحال ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تجلى استخدام وسيلة ELISA للكشف على وجه التحديد αS D مباشرة من الخليط الماوس الدماغ أثناء المرض في M83 نموذج الفأر المعدل وراثيا. والحقيقة أن هذا ELISA التمييز بسهولة الفئران M83 المريضة من الفئران M83 صحية باستخدام الخليط الدماغ بالكامل فقط في المخزن عالية من الملح.

أهم الخطوات لتحقيق نتائج ناجحة باستخدام هذه ELISA هي: تشريح مناطق مختلفة من أدمغة فئران بشكل صحيح من خلال تطوير ما يلزم من البراعة الي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم أي مصالح متنافسة للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر داميان جيلارد عن التطعيمات والمتابعة من التجارب على الحيوانات. وأيد هذا العمل من قبل ANSES (الوكالة الفرنسية للأغذية، البيئة والصحة والسلامة المهنية) وبمنحة من مؤسسة فرنسا باركنسون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
LB509Abcamab27766Detection antibody 1/2,000
AS11Produced at AnsesDetection antibody 1/1,000
4D6Abcamab1903Detection antibody 1/2,000
PSer129Abcamab59264Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Detection antibody 1/1,000
syn514Abcamab24717Detection antibody 1/500
clone 42BD Biosciences610787Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5Provided by Dr. AndersonDetection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibodyMilliporeAB5038PCoating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugateSouthern Biotech1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugateSouthern Biotech4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugateDianova115-035-164
HS bufferAdjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSAdjust at pH 7.5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktailPierce78428
1% protease inhibitor cocktailRoche04 693 132 00150x concentrated
Microplate MaxiSorpTMThermo Scientific442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602.86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking bufferPierceE6423H10x concentrated
TMBSigmaT0440Used for ELISA
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302Used for epitope mapping
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120keep on ice at this step
Grinding tubesBiorad355-1197
Plate washerTecanColumbus Pro
Plate readerBioradModel 680
Low power magnifier VWR630-10628X magnification
Forceps Dumont#7WPI14097For dissection steps
Transfer pipette 1ml SamsoSamso043231
1.5 ml tubesDutscher033290

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
  2. Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
  3. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  4. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
  5. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  8. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
  10. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
  11. Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
  12. El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
  13. Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
  14. Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
  15. Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).
  16. Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
  17. Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
  18. Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
  19. Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11(2001).
  20. Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
  21. Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
  22. Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225(2011).
  23. Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
  24. Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ELISA Phospho Ser129

مقالات ذات صلة