مقالة منهجية

استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

10.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52756

⸱

يونيو 25, 2015

 ,  , 
1Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Ulm University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا نوضح سير العمل لاستخدام نظام TetON لتحقيق التعبير الجيني الخاص بالأنسجة في زعنفة ذيل الزرد المتجددة للبالغين.

الملخص

أصبح سمك الزرد كائنا نموذجيا مهما جدا لدراسة نمو الفقاريات وعلم وظائف الأعضاء والمرض وتجديد الأنسجة. يتطلب الفهم الشامل للآليات الجزيئية والخلوية المعنية أدوات تجريبية تسمح بالتلاعب المحفز الخاص بالأنسجة للتعبير الجيني أو مسارات الإشارات. لذلك ، قمنا نحن وآخرون مؤخرا بتكييف نظام TetON لاستخدامه في أسماك الزرد. يسهل نظام TetON التعبير الجيني الذي يتم التحكم فيه مؤقتا ومكانيا وقد استخدمنا هذه الأداة مؤخرا للتحقيق في الوظائف الخاصة بالأنسجة لإشارات Wnt / beta-catenin أثناء تجديد زعانف ذيل الزرد. نصف هنا سير العمل لاستخدام نظام TetON لتحقيق تعبير جيني محفز خاص بالأنسجة في زعنفة ذيل الزرد المتجددة للبالغين. يتضمن ذلك توليد خطوط TetActivator و TetResponder المعدلة وراثيا المستقرة ، وتحريض الجينات المعدلة وتقنيات التحقق من التعبير الجيني الخاص بالأنسجة في تجديد الزعنفة. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول بمثابة مخطط لإنشاء نظام TetON وظيفي في أسماك الزرد واستخدامه اللاحق ، لا سيما لدراسة تجديد الزعانف.

المقدمة

الزرد هو كائن نموذج الفقاريات راسخة لدراسة العديد من جوانب التنمية، علم وظائف الأعضاء، والمرض، وتجديد. مع اعتماد متزايد من الزرد كنموذج للعمليات البيولوجية بعد الجنينية، والأدوات التجريبية للمحرض، والتلاعب الأنسجة محددة التعبير الجيني أو مسارات الإشارات أصبحت ذات أهمية متزايدة. بشكل خاص، عانت الدراسات إلى الجهاز وتجديد أطرافهم في الزرد الكبار من عدم وجود أدوات للتشريح من المتطلبات المكانية والزمانية لمسارات الإشارات خلال هذه العمليات التجدد.

حاليا، وقد استخدمت ثلاثة أنظمة مختلفة لتحقيق المشروط، الأنسجة محددة التعبير الجيني في تجديد أجهزة الزرد الكبار: نظام جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، والتعبير فسيفساء من حرارة صدمة الجينات المحورة محرض باستخدام بوساطة ينقول transgenesis الجسدية، ونظام تيتون 1 -3. تيتون يشير إلى متغير من التتراسيكلين-تابعتوالت نظام تفعيل النسخي، حيث يتم تنشيط التعبير في وجود المضادات الحيوية التتراسيكلين أو مشتق، على سبيل المثال الدوكسيسيكلين. نظام جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، حيث تم حتى الآن استخدامها في الأسماك البالغة، يعتمد على لجنة المساواة العرقية recombinase تسيطر تاموكسيفين (CreERT2)، الذي يقتصر مكانيا من قبل عناصر تنظيمية الأنسجة محددة التعبير. إزالة لجنة المساواة العرقية يحركها من شريط إيقاف تسهل التعبير عن الجينات في المصالح يقودها المروج التي يجب أن تكون نشطة في جميع أنواع الخلايا 1. إنشاء بوساطة ينقول من الجينات المحورة جسدية أعرب mosaically يوفر نظام لمحرض التعبير التحوير في الأنساب الخلية الفردية. حقن الأجنة الزرد مع ينقول Tol2 يحمل الجين من الفائدة تحت السيطرة النسخي من الصدمة الحرارية النتائج المروج في الأفراد خيالية تحمل عادة التحوير فقط في الأنساب خلية منفصلة من جهاز تجديد 2. في حين أن كلا المنظومتين تتيح للالمشروط الأنسجة جمعية مهندسي البترولcific التعبير الجيني، ونظام لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن لا يمكن عكسها، واستراتيجية باستخدام القائم على ينقول وضع العلامات نسيلي يعاني من طبيعتها العشوائية. وبالتالي، نحن وغيرنا لقد تأقلم مؤخرا أنظمة تيتون المعدلة وراثيا لاستخدامها في الزرد، والتي تسهل زمانيا ومكانيا التعبير الجيني للرقابة التي بالإضافة الانضباطي وعكسها 3-5.

يتألف نظام تيتون المستخدمة هنا خط سائق المعدلة وراثيا (TetActivator) فيه دوكسي (DOX) المنشط النسخي -inducible (تحسين transactivator التتراسيكلين العكسي، irtTA، باختصار تيتا) هو تحت سيطرة تسلسل الجينوم التنظيمية الأنسجة محددة. ثانيا، فإنه يتطلب خط الرد المعدلة وراثيا (TetResponder) التي تؤوي الجين من الفائدة تحت السيطرة النسخي المشغل التتراسيكلين (عنصر استجابة تيت؛ TetRE) (الشكل 1A). وهكذا، واستخدام مجموعات محددة من TetActivator وTetResponder خطوط يسمح للالمشروط الأنسجة SPECIالتلاعب المرورية في التعبير الجيني.

لقد استخدمت مؤخرا نظام تيتون للتحقيق لوظائف الأنسجة محددة من WNT / بيتا catenin الإشارات في الكبار تجديد الذيل الزعنفة الزرد 3. في البروتوكول المذكورة هنا نحن تصف تدفق العمل لانشاء واستخدام نظام تيتون في الزرد، ولا سيما بالنسبة للدراسات تجديد الزعانف. هذا يتضمن تعليمات مفصلة حول كيفية توليد TetActivator وTetResponder خطوط المعدلة وراثيا مستقرة وبروتوكول لتحريض التحوير في الأجنة والزرد الكبار. وعلاوة على ذلك، وصفنا تقنيات للتحقق من الأنسجة محددة التعبير الجيني في تجديد الزعانف، بما في ذلك بروتوكول لإعداد cryosections زعانف الزرد الكبار. بالإضافة إلى ذلك، نحن نناقش اعتبارات لتصميم التحوير TetActivator، واختيار طريقة transgenesis، والكشف عن TetResponder التعبير. وبالتالي، فإن الهدف العام من هذا البروتوكول هو بمثابة مخططلوضع المتابعة نظام تيتون وظيفية في الزرد لتحقيق المشروط الأنسجة محددة التعبير الجيني، والتي يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنسجة في المصالح.

أنشأنا ناقلات TetActivator السماح لI-SCEI أو الجيل Tol2 بوساطة خطوط TetActivator مستقرة باستخدام قصيرة تسلسل الجينوم التنظيمية (شظايا محسن؛ Weidinger مختبر قاعدة البيانات البلازميد أي 1247؛ الشكل 1B). يحتوي هذا البناء الكاسيت TetActivator تتكون من البديل متحولة M2 من العكسي تيت مجال كاظمة تنصهر مع فيروس الهربس البسيط VP16 transactivation مجال مشتقة 3F [irtTAM2 (3F)]. التعبير عن TetActivator (تيتا) يمكن رصدها بسهولة لأنها مع AmCyan fluorophore من نفس إطار القراءة المفتوح أعرب المشارك؛ الببتيد P2A يتوسط الريباسي الطفر، والتي ينبغي أن يؤدي إلى إنتاج تيتا وAmCyan كما البروتينات منفصلة في نسبة 1: 1 5،6. يحتوي بناء أيضا poylinker 5 'من TetActivator كاسيت لتسهيل إدراج تسلسل الجينوم التنظيمية ذات الاهتمام باستخدام أساليب الاستنساخ التقليدية.

بالإضافة إلى ذلك، أنشأنا بناء تتكون من الكاسيت أعلاه وصف TetActivator بالإضافة إلى مجموعة كاسيت كانامايسين (Weidinger قاعدة البيانات البلازميد مختبر أي 1180؛ الشكل 1C)، والتي يمكن معاد في الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC) تحتوي على منطقة الجينومية كبيرة ( عادة في كودون بداية الجين الذي التعبير النمط أن يحاكي قبل التحوير). تتوفر كل من يبني من المختبر Weidinger بناء على طلبها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. توليد المعدلة وراثيا TetActivator خطوط السمك

  1. جيل من TetActivator بناء
    1. تسلسل التنظيمية نسخة من المنبع مصلحة كاسيت TetActivator في ناقلات # 1247 باستخدام التقنيات القياسية. بدلا من ذلك، استخدام تقنيات إعادة التركيب لتوليد BAC، حيث يتم إدراج TetActivator كاسيت (ناقلات # 1180) في اكسون الأول من الجينات المستهدفة، وحيث مقلوب Tol2 يتم تقديمها يكرر في العمود الفقري BAC (لبروتوكول recombineering مفصل، انظر 7،8).
    2. إعداد خالية من السموم DNA البلازميد أو مستحضرات BAC DNA باستخدام أدوات متوفرة تجاريا.
  2. جيل من خطوط الأسماك TetActivator المعدلة وراثيا
    1. أداء Microinjection من التركيبة TetActivator فقا للاجراءات المتبعة 9.
      1. حقن 25-50 خريج من الحمض النووي البلازميد أو ما يصل إلى 250 خريج DNA BAC إلى الأجنة في مرحلة خلية واحدة جنبا إلى جنب مع توج الترميز الشعور RNA لهيئة تنظيم الاتصالات tol2nsposase للبوساطة ينقول transgenesis، أو مع البروتين I-SCEI لtransgenesis I-SCEI بوساطة.
        ملاحظة: الاعتبارات في اختيار طريقة transgenesis يمكن العثور عليها في قسم المناقشة.
        ملاحظة: يفضل حقن في السيتوبلازم، وليس الصفار، منذ كفاءة transgenesis قد تنخفض عندما لا يتم تسليم DNA إلى السيتوبلازم.
    2. رفع الأجنة G0 حقن لمرحلة البلوغ. اختياريا، الأجنة الشاشة G0 لAmCyan مضان وتفضيلي تنمو الأجنة تظهر نمط التعبير المطلوب. هذا قد يزيد من معدل انتقال خط الجرثومية، ولا سيما لtransgenesis Tol2 بوساطة.
    3. تقييم نجاح التكامل خط الجرثومية من قبل التهجين الأسماك G0 الفردية إلى البرية من نوع الأسماك وظهور مضان AmCyan في نمط التعبير المتوقع في الأجنة F1 أو اليرقات باستخدام stereomicroscope الفلورسنت (يظهر المثال في الشكل 1D).
    4. رفع مضان إيجابيالأجنة F1 إلى مرحلة البلوغ وتتزاوج لهم البرية من نوع السمك للحصول مستقرة الأسماك F2 المعدلة وراثيا.
    5. رفع وتميز لا يقل عن 3 sublines مختلفة مستمدة من مختلف الأسماك G0 مؤسس، لأن خطوط الفردية قد تختلف في مستويات التعبير، نمط التعبير، والقدرة على إحداث خطوط TetResponder، التسرب، وقابليتها للإسكات.
      ملاحظة: العديد من الجينات المحورة التي يتم التعبير عنها بقوة في الأجنة إما جزئيا أو كليا إسكاته في وقت متأخر من مرحلة اليرقات أو الأسماك البالغة. وبالتالي، إذا كان القصد من خطوط لاستخدامها في الأسماك البالغة، تميز العديد من خطوط المستقلة للتعبير TetActivator وظيفة خلال مرحلة البلوغ.
      ملاحظة: لقد ولدت لجنة من خطوط TetActivator للتعبير الأنسجة محددة من TetActivator في كل من الأجنة والبالغين السمك، وهي مدرجة في الجدول 1 هي هذه الخطوط المتاحة من المختبر Weidinger بناء على طلبها.

2. توليد المعدلة وراثيا TetResponder خطوط السمك

ملاحظة: لقد ولدت بناء TetResponder السماح لI-SCEI أو الجيل Tol2 بوساطة خطوط TetResponder مستقرة، والذي يتوفر من المختبر Weidinger عند الطلب (Weidinger قاعدة بيانات مختبر البلازميد أي 1444؛ الشكل 1E). يحتوي هذا البناء مشغل التتراسيكلين، تليها منطقة polylinker تسهيل إدراج تسلسل الترميز (CDS) من الجين من الفائدة وتسلسل الترميز YFP المشتقة YPet. وبالتالي، تم تصميم بناء للتعبير تيتا بوساطة من الانصهار-C محطة من البروتين في المصالح مع YPet. إذا لابد من تجنب التعبير عن بروتين الانصهار الموسومة، ويمكن إدخال P2A أو T2A الببتيد مع الجينات في CDS الفائدة، مما يسهل شارك في التعبير عن بروتين من الفائدة وYPet كما البروتينية منفصلة 6،10.

  1. جيل من TetResponder بناء
    1. CDS نسخة من هذا الجين من الفائدة 3 'المشغل التتراسيكلينو 5 'من CDS YPet فقا للاجراءات المتبعة. تأكد من أن رامزة توقف تمت إزالة من الجينات في CDS الفائدة.
    2. إعداد التحضيرات DNA البلازميد خالية من السموم باستخدام أدوات متوفرة تجاريا.
  2. جيل من خطوط الأسماك TetResponder المعدلة وراثيا
    1. أداء Microinjection من TetResponder بناء وفقا للاجراءات المتبعة 9.
      1. حقن 25-50 خريج من الحمض النووي البلازميد في سيتوبلازم خلايا الأجنة في مرحلة واحدة جنبا إلى جنب مع الشعور توج ترميز الحمض النووي الريبي لtransposase tol2 للبوساطة ينقول transgenesis أو مع I-SCEI انزيم لبمساعدة meganuclease transgenesis.
        ملاحظة: الاعتبارات في اختيار طريقة transgenesis يمكن العثور عليها في قسم المناقشة.
        ملاحظة: يفضل حقن في السيتوبلازم، وليس الصفار، منذ كفاءة transgenesis قد تنخفض عندما لا يتم تسليم DNA إلى السيتوبلازم.
    2. رفع حقن الأجنة G0 لdulthood.
    3. تقييم نجاح التكامل خط الجرثومية وinducibility من التحوير من قبل التزاوج الأسماك G0 الفردية مع خط TetActivator المحددة سابقا تليها العلاج دوكسي الأجنة F1 أو اليرقات F1.
      ملاحظة: عادة ما نستخدم يحركها المروج خط TetActivator بتحول (بتحول: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2، قصيرة بتحول: تيتا AmCyan 3) للكشف عن شركات TetResponder الوظيفية، وهذا الخط يدفع التعبير في كل مكان إلى حد ما في الأجنة والكبار الأسماك، وبالتالي هي مناسبة تماما لتقييم TetResponder inducibility في جميع أنسجة الفائدة. هذا الخط هو متاح من المختبر Weidinger بناء على طلبها.
    4. جمع الأجنة من كل مخلب في 10 سم طبق بتري منفصلة تحتوي على E3 المتوسط ​​الجنين (انظر الجدول مواد)، واحتضان الأطباق في 28.5 درجة مئوية.
    5. السمك مكان G0 التي أعطت أجنة في خزانات مرقمة الفردية (مربعات تربية؛ انظر الجدول المواد) حتى كانت الأجنة الشاشةأد. وهذا يسمح للانتعاش من الأسماك G0 التي تظهر الجرثومية خط نقل من التحوير.
    6. إذا كان من المتوقع نصف فقط من الأجنة لحمل التحوير TetActivator (في حال عبرت حاملة TetActivator متخالف لسمكة مؤسس TetResponder)، حدد للأجنة تحتوي على التحوير TetActivator من قبل ظهور AmCyan مضان في هذه المرحلة التنموية المناسبة.
    7. حمل TetActivator النشاط النسخي عن طريق علاج الأجنة مع دوكسي (DOX) كما هو موضح في القسم 2.3.
    8. الأجنة الشاشة F1 للظهور YPet مضان. تفضل خطوط (الأسماك G0) التي تنتج متجانسة التعبير YPet، وهذا هو أن الأجنة في مخلب عرض الاصباغ يذكر في مجال التعبير المتوقع واختلاف بسيط بين الأجنة الفردية. رؤية النصال في الشكل 1F والشكل 1G للحصول على أمثلة التمثيلية.
    9. زميله G0 الأسماك يحيل فيها التحوير TetResponder محرض المحددة فيالخطوة 2.2.8 مع من النوع البري الأسماك ورفع جميع الأجنة F1 إلى مرحلة البلوغ.
    10. تحديد الكبار الأسماك F1 المعدلة وراثيا إما عن طريق انماط PCR القائم (انظر القسم أو عن طريق عبور الأسماك F1 الفردية إلى خط TetActivator تليها العلاج DOX الأجنة F2 وظهور YPet مضان (انظر القسم 2.5).
    11. إنشاء وتميز لا يقل عن 3 sublines TetResponder مختلفة مستمدة من مختلف الأسماك G0 مؤسس، منذ inducibility قد تختلف في خطوط الفردية. ولا سيما مستويات التعبير قابلة للتحقيق، وما إذا كان يمكن تفعيلها المستجيب في جميع أنواع الخلايا قد تختلف. بالإضافة إلى ذلك، سوف القابلية للإسكات تختلف بين السطور. أخيرا، في بعض الحالات قد يكون من الأفضل لتحديد الخطوط التي تتوسط فقط مستويات التعبير معتدلة من البروتين من الفائدة، ولا سيما إذا كان من المتوقع أن يسبب تشوهات تنموية أو سمية التعبير المتسرب أنتجت بالاشتراك مع خط TetActivator في غياب دوكسي.
      ملاحظة: تيتخطوط المستجيب التي هي محرض بقوة في الأجنة يمكن إسكات إما جزئيا أو كليا في أواخر مرحلة اليرقات أو الأسماك البالغة. وبالتالي، إذا كان القصد من خطوط لاستخدامها في الأسماك البالغة، يجب أن توصف العديد من خطوط المستقلة للinducibility في البالغين. إذا تحريض الجينات في المصالح متوافق مع مزيد من التطوير، وقد ثبت أنه من المفيد لخلق الأجنة وراثيا مزدوجة (TetActivator س TetResponder)، للحث على التعبير العراقية في الأجنة واختيار وجمع سوى الأشخاص الذين تظهر فسيفساء أقوى وأقل الحث.
    12. للحفاظ على ونشر خطوط TetResponder المعمول بها، وراثى الأسماك البالغة كما هو موضح في القسم 2.5).
  3. العلاج دوكسي الأجنة
    1. إعداد 2،000x دوكسي (DOX) الأسهم. حل DOX في 50٪ ETOH لتحقيق تركيز من 50 ملغ / مل (97 ملم). الأسهم تخزين DOX باي من الضوء في -20 ° C.
    2. صب غالبية E3 المتوسطة من الأجنة واستبدالهاE3 الجنين المتوسطة التي تحتوي على DOX بتركيز نهائي من 25 ميكروغرام / مل DOX (2.5 ميكرولتر من 2،000x DOX الأسهم في 50 مل E3). غير مطلوب Dechorionation.
    3. العودة الأجنة إلى 28.5 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 6 ساعات قبل تقييم التعبير عن الجينات الموسومة الاهتمام من جانب ظهور YPet مضان.
    4. تقييم التسرب من TetActivator / TetResponder الجمع عن طريق علاج الأجنة مع ETOH مذيب فقط.
      ملاحظة: في الموقع التهجين (ISH) أو RT-PCR للكشف عن TetResponder مرنا ويمكن استخدام تدابير أكثر حساسية من التسرب من مضان من الجينات الموسومة الفائدة. ومدى التسرب تعتمد على مزيج معين خط TetActivator / TetResponder وأنه قد تختلف أيضا بين الأنسجة ومراحل النمو.
  4. تخدير الزرد الكبار
    1. إعداد 10 سم القطر طبق بتري أو دورق صغير مملوء بالماء نظام السمك الذي يحتوي على 1 ملغ / مل تريكين (إيثيل 3-أمينوبنزوات methanesulfonate، MS-222).
    2. نقل الأسماك إلى حاوية تحتوي على مخدر وانتظر حتى يصل إلى المستوى 4 من التخدير كما يتبين من فقدان كامل للتوازن (الأسماك تقع على جانبها)، أي الحركات وأي رد على لمس 11.
    3. نقل بعناية الأسماك باستخدام الملقط أو ملعقة على شريحة زجاجية، غطاء طبق بتري البلاستيك، أو المغلفة الاغاروز طبق بتري وإجراء بتر الزعنفة أو التصوير (انظر القسم 3.2).
    4. عودة الأسماك إلى حاوية تحتوي على كمية كبيرة من المياه النظام الأسماك الطازجة ومراقبة ذلك. إذا الحركات الخيشومية لا تستأنف في غضون 3 دقائق، والمساعدة التي تهب الماء عن طريق الخياشيم باستخدام الماصة نقل البلاستيك.
  5. انماط PCR القائم من الأسماك TetResponder
    1. أداء البتر الجزئي للزعنفة الذيل 12. ضع السمك في الفردية والدبابات مرقمة (مربعات تربية؛ انظر الجدول المواد). وهذا يسمح للانتعاش من الأسماك المعدلة وراثيا التالية التنميط الجيني الناجح.
    2. هيئة تنظيم الاتصالاتالأنسجة زعنفة nsfer إلى الآبار الفردية للجيدا 96 PCR لوحة معبأة سلفا مع 20 ميكرولتر خالية من الدناز المياه لعزل الحمض النووي الجيني 13.
      1. إضافة 120 ميكرولتر 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل بئر واحتضان عينات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية باستخدام thermocycler.
      2. عينات البرد إلى 4 درجات مئوية، إضافة 14 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة) إلى كل بئر، والعينات لفترة وجيزة الدوامة. عينات الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 16000 x ج لتكوير الحطام الخلية. تخزين الحمض النووي الجيني في 4 ° C لحين الحاجة إليها.
    3. الاشعال تصميم لتضخيم وجه التحديد جزء من التحوير TetResponder. استخدام 2 ميكرولتر من عزل الحمض النووي في رد فعل PCR القياسية وتحليل المنتج PCR على هلام الاغاروز.

3. الحث الأنسجة محددة من التعبير التحوير في الذيل الكبار مجدد الزرد فنلندا

  1. إنشاء TetActivator. TetResponder الأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة
    1. تتزاوج ناقلات TetActivator مع TetResponder carriالمتطلبات البيئية.
    2. اختر الأجنة التي تحمل التحوير TetActivator في مرحلة النمو عندما العناصر التنظيمية القيادة الكاسيت TetActivator نشطة. يمكن بسهولة التعرف على الأجنة وراثيا قبل ظهور AmCyan مضان باستخدام المجهر الفلورسنت ستيريو.
      قد بدلا من تحديدها TetActivator السمك التحوير إيجابيا خلال مرحلة البلوغ التصوير الأسماك تخدير، على سبيل المثال: ملاحظة. بعد بتر زعنفة الذيل وظهور مضان AmCyan في تجديد.
    3. رفع الأجنة المحدد إلى مرحلة البلوغ.
    4. تحديد مزدوجة الأسماك البالغة المعدلة وراثيا (الأسماك التي تحمل TetResponder بالإضافة إلى TetActivator) من خلال انماط PCR القائم أو (يفضل) من خلال قدرتها على حث تعبير عن TetResponder في الأنسجة من الاهتمام. يوصف بروتوكول للTetResponder تحريض وكشف في تجديد زعنفة الذيل في القسم 2.3 و القسم (4).
      ملاحظة: إذا كان عابر التعبير TetResponder متوافقمع مزيد من التطور الجنيني أو اليرقات، فمن المفيد تحديد الأجنة وراثيا مزدوجة تحمل TetActivator وTetResponder الجينات المحورة بعد العلاج DOX أثناء التطور الجنيني كما هو موضح أعلاه (القسم 2.3، الشكل 1H). سوف الأجنة إيجابية مزدوجة تظهر AmCyan وYPet مضان. رفع الأجنة إيجابية إلى مرحلة البلوغ.
  2. بتر زعانف الذيل الزرد وتحريض التعبير التحوير في زعنفة تجديد
    1. أداء البتر الجزئي للزعنفة الذيل على الأسماك تخدير (انظر القسم 2.4) 12. علاج الأسماك إما مباشرة مع DOX أو إعادتها إلى نظام الإسكان الأسماك.
    2. إعداد مربع تربية (الشكل 2A؛ انظر الجدول المواد) مليئة 1 L من نظام أسماك المياه التي تحتوي على 25 ميكروغرام / مل DOX (إضافة 500 ميكرولتر من 2،000x 50 ملغ / مل الأسهم إلى 1 L من نظام أسماك المياه).
      ملاحظة: تحريض التعبير التحوير فورا بعد بتر يسمح لكماsessment من الآثار المترتبة على الأحداث في وقت مبكر خلال تجديد، في حين الاستقراء في 3 أيام بعد بتر (3 د ب أ) ينبغي أن تستخدم لتقييم التعبير التحوير أو وظيفة خلال النمو التجديدي.
    3. نقل ما يصل إلى 10 بتر سابقا، والأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة إلى مربع تربية وصندوق الوثيق مع غطاء مثل أن الأسماك لا يمكن الهروب (الشكل 2A).
    4. وضع صناديق تربية في الظلام للحد من التوتر. نحن عادة وضع صناديق في 28.5 درجة مئوية الحاضنة الهواء لضمان ظلام مستمر ودرجة الحرارة.
    5. علاج السلبية السيطرة الأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة مع ETOH فقط (250 ميكرولتر لكل نظام الأسماك 1L المياه).
      ملاحظة: المعدلة وراثيا واحدة أو من النوع البري الأسماك تعامل مع DOX يمكن استخدامها في مراقبة سلبية إضافية، على الرغم من أننا لاحظنا أبدا الآثار السلبية للجرعات DOX المستخدمة هنا على تجديد الزعانف.
    6. تخدير الأسماك كما هو موضح في القسم 2.4 والأسماك نقل باستخدام الملقط أو ملعقة الصعود إلى المغلفة الاغاروز بتري المبللة الطبق. نشر بعناية زعنفة الذيل باستخدام الملقط.
    7. الأسماك الشاشة لظهور YPet داخل تجديد باستخدام الفلورسنت ستيريو المجهر (الشكل 2B).
      ملاحظة: عادة، يحركها TetResponder مضان بحيث يمكن ملاحظتها بقوة بعد 6 ساعات من العلاج DOX. ومع ذلك، فإننا نوصي لوصف ديناميات TetResponder التعبير لكل خط تم إنشاؤه.
    8. عودة الأسماك إلى نظام الإسكان الأسماك لإنهاء TetResponder التحوير تحريض أو مواصلة العلاج.
      ملاحظة: بالنسبة لمعالجات> 24 ساعة (العلاج على المدى الطويل) لا بد من تبادل المياه وتنظيف شامل لصناديق تربية يوميا.
    9. خلال العلاج على المدى الطويل، والأسماك تغذية كل 2-3 أيام عن طريق نقل الأسماك إلى وعاء نظيف مع النظام الأسماك الطازجة الماء قبل إعادتهم إلى صناديق تربية بعد الرضاعة.

4. توصيف TetResponder التعبير في فنلندا يجدد

ر "> ملاحظة: نحن عادة التحقق من الأنسجة محددة التعبير الجيني في تجديد زعنفة الذيل باستخدام التصوير الفلورسنت من cryosections في 3 د ب أ عند هذه النقطة الوقت قد شكلت المقصورات الأنسجة المختلفة للتجديد، ويمكن التعرف بوضوح على الأنسجة أقسام، وcryosectioning هو أبسط مما كانت عليه في مراحل لاحقة من التجدد. الشكل 2C يصور المجالات الأنسجة التي يمكن تمييزها في تجديد ويسرد بعض الواسمات الجزيئية لهذه المجالات. ويصف بروتوكول التالية إعداد cryosections الطولي أو العرضي للتصوير المباشر أو المناعية .

  1. Cryosectioning زعانف الذيل الكبار
    1. علاج الأسماك التي بترت من 2 د.ب.أ حتى 3 د ب أ مع DOX كما هو موضح في القسم 3.2 زعانف الذيل
    2. تخدير الأسماك كما هو موضح في القسم 2.4
    3. استخدام الملعقة أو ملاقط لنقل بلطف السمك على غطاء من طبق بيتري البلاستيك.
    4. إعادة بتر تجديد الزعانف في حوالي 4-5 جزء عظميالصورة الأقرب إلى الطائرة بتر الأولية باستخدام مشرط وعودة الأسماك إلى المياه النظام الأسماك الطازجة.
    5. نقل بعناية تجدد إلى طبق بتري صغيرة (على سبيل المثال، 35 مم) التي تحتوي على 4٪ (ث / ت) لامتصاص العرق (PFA) في المياه المالحة 1X الفوسفات مخزنة (PBS؛ انظر الجدول المواد) باستخدام الملقط غرامة. لا تلمس تجديد ولكن فقط الجزء جدعة من الأنسجة.
    6. وضع الأنسجة مسطحة على الجزء السفلي طبق بتري وإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية.
    7. غسل تجدد مرتين في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 0.1٪ توين (PBT) لإزالة PFA واحتضان تجدد س / ن ب 4 ° C في 0.5 M EDTA-PBS (7.5 درجة الحموضة) ليزيل الكلس مصفوفة العظام.
    8. احتضان تجدد في RT في 10٪ سكروز، PBS، 20٪ سكروز، PBS، 30٪ سكروز-PBS و 30٪ سكروز-PBS: الأنسجة تجميد المتوسطة في نسبة 1: 1 (TFM؛ انظر الجدول مواد) لمدة 30 دقيقة لكل منهما. وفي وقت لاحق، واحتضان زعانف عند 4 درجة مئوية لمدة> 2 ساعة في الأنسجة تجميد المتوسطة.
    9. وضع cryomolds على شريحة المجهر وملءم مع تجميد الأنسجة المتوسطة. تجنب إدخال فقاعات الهواء.
    10. نقل إلى تجدد cryomolds والأنسجة توجيه بشكل مناسب للحصول على المقاطع الطولية أو العرضية من تجدد الزعانف (الشكل 2D). ضمان تجديد غير مباشرة، مما يسهل باجتزاء.
    11. نقل cryomolds جنبا إلى جنب مع المجهر الشريحة على رف معدني وضعه على سرير من الثلج الجاف لبدء عملية التجميد (الشكل 2D).
    12. بمجرد أن تصبح الأنسجة تجميد المتوسطة الصلبة، مكان cryomold على مقاعد البدلاء، وترك الجلوس في RT لبضع دقائق بحيث الأنسجة المتوسطة تجميد ذوبان في واجهة بلاستيكية متوسطة.
    13. استخدام قلم أو ما شابه ذلك لدفع كتلة المجمدة من cryomold. متجر cryoblocks في مربع في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء الأنسجة.
    14. إعداد 10-14 ميكرومتر cryosections سميكة باستخدام البرد مشراح وجمع المقاطع على التصاق شرائح المجهر (انظر الجدول المواد). متجر الشرائح في -20 درجة مئوية حتى شمال شرقeded.
  2. توصيف TetResponder التعبير على أقسام زعنفة على أساس YPet مضان
    1. علاج أقسام الزعانف لمدة 30 دقيقة مع 100٪ MeOH برود إلى -20 ° C إلى تحسين التمسك شريحة المجهر تليها اثنين يغسل في RT في PBT و1 يغسل في برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل منهما.
    2. تصور النوى من قبل أقسام يحتضنها لمدة 10 دقيقة في 4، 6- diamidino-2-phenylinodole (دابي) في برنامج تلفزيوني (1: 5000) تليها اثنين يغسل 10 دقيقة لكل منهما في برنامج تلفزيوني.
    3. جبل المقاطع في 75٪ الجلسرين-PBS أو يتصاعد antifade المتاحة تجاريا، وتغطي مع شريحة الغطاء.
    4. صورة YPet ومضان AmCyan تحت متحد البؤر أو مجال واسع المجهر الفلورسنت (الشكل 1E).
      ملاحظة: لتسهيل التعرف لا لبس فيه من أنواع الخلايا معربا عن YPet، المناعي أو المناعية مع الأجسام المضادة ضد المستضدات محددة الخلايا من نوع جنبا إلى جنب مع أضداد GFP (التي تتفاعل مع YPet، ولكن ليس AmCyan) لا يمكن أن يؤديها. بدلا من ذلك، لتسهيل كشف عن ضعف التعبير YPet، RNA في الموقع التهجين ضد YPet RNA يمكن أن يؤديها إما على كامل جبل زعانف أو أقسام البارافين من الزعانف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لإنشاء نظام تيتون وظيفية لالأنسجة محددة التعبير الجيني محرض، TetActivator المعدلة وراثيا وخطوط TetResponder تحتاج إلى أن تتولد (الشكل 1A). يتم ذلك عن طريق microinjecting TetActivator (الشكل 1B - C) أو TetResponder (الشكل 1E) يبني في الأجنة الزرد المبكرة واللاحقة التكامل خط الجرثومية. يمكن أن تكون إما إنشاء بنيات TetActivator الوظيفية عن طريق الاستنساخ من متواليات التنظيمية قصيرة (عناصر محسن) المنبع من الكاسيت TetA...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الزرد الكبار لديه قدرة مذهلة على تجديد العديد من الأعضاء الداخلية والزوائد بنجاح. فهم شامل للالآليات الجزيئية والخلوية تشارك يتطلب تحليل الأنسجة محددة من وظائف الجينات ومسارات الإشارات. لتحقيق هذا، ويوفر النظام تيتون أداة فعالة للتعبير عن الجينات التي تسيطر عليها spatiotemporally في الزرد الجنينية والكبار. وقد استخدمت بنيات النظام تيتون والمنهجية الموضحة في هذه المخطوطة بنجاح في دراسة حديثة من مختبرنا 3. وينبغي النظر في القضايا الإضافية التالية عند وضع النظام تيتون:

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

الكتاب أشكر كريستا هاس، دوريس ويبر وبريجيت كورتي للحصول على المساعدة الفنية. ويدعم العمل في المختبر Weidinger من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث WE 4223 / 3-1، WE 4223 / 4-1 ودويتشه FÜR غزلشافت Kardiologie عن طريق أوسكار-لاب-Stipendium وكلاوس جورج اوند-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صناديق التربيةAqua SchwarzAquaBox 1
مجهر الفلورسنت المركبعلى سبيل المثال ، Leica ، يختلف Zeissمع الشركة المصنعةلتصوير أقسام الأنسجة الفلورية
المجهر متحد البؤرعلى سبيل المثال ، Leica ، Zeissيختلف مع الشركة المصنعةلتصوير أقسام الأنسجة الفلورية
Cryostatعلى سبيل المثال ، Leica ، يختلف Thermo-Scientificباختلاف الشركة المصنعةللتقطيع بالتبريد
4 '، 6- دياميدينو-2-فينيلينودول (دابي)تستخدم Sigma-AldrichD95421/5,000 في PBS
لتصور النوى
DoxycyclineSigma-AldrichD9891تحضير المخزونات في 50٪ EtOH عند 50 مجم / مل (97 ملليمتر)
لتحريض TetResponder
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP61484٪ (وزن / حجم) بارافورمالدهيد في PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.5
للتثبيت
1x محلول ملحي من الفوسفات عازل (PBS)1.7 ملي مولار KH2PO4، 5.2 ملي مولار Na2HPO4، 150 ملي كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 7.5
1x محلول ملحي للفوسفات + توين 20 (PBT)1x PBS مع 0.1٪ Tween 20
Superfrost Ultra Plus شرائح مجهر الالتصاقThermo Scientific   ؛1014356190لجمع أقسام الأنسجة
المجهر الفلوري الاستريوعلى سبيل المثال ، Leica ، يختلف Zeissباختلاف الشركة المصنعةللتنميط الجيني القائم على التألق
Thermocyclerعلى سبيل المثال ، Biorad ، تختلف الأنظمة الحيويةالتطبيقية مع الشركة المصنعةللتنميط الجيني القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل
وسط تجميد الأنسجة (TFM)Triangel Biomedical SciencesTFM-Cلتضمين الأنسجة عينات
من التريكايين (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate / MS-222)Sigma-AldrichE10521للتخدير
استخدم عند 1 مجم / مل في وسط الجنين E3

المراجع

  1. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  2. Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317(2014).
  3. Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
  4. Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
  5. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  6. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
  7. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  8. Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
  9. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  10. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556(2011).
  11. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
  12. Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
  13. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610(2007).
  14. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  15. Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
  16. Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Wnt beta catenin

مقالات ذات صلة