مقالة منهجية

التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم

12.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52771

⸱

أبريل 29, 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, 2Biointerfaces Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

في هذه المقالة

ملخص

نصف التصوير الحيواني الكامل والتقنيات القائمة على قياس التدفق الخلوي لمراقبة توسع خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد استجابة للتحصين بالجسيمات النانوية في نموذج تطعيم الفئران.

الملخص

المواد المساعدة للقاحات التقليدية ، مثل الشب ، تثير استجابات الخلايا التائية CD8 + دون المستوى الأمثل. لمواجهة هذا التحدي الرئيسي في تطوير اللقاح ، تم تصميم أنظمة الجسيمات النانوية المختلفة لتقليد ميزات مسببات الأمراض لتحسين توصيل المستضد إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة وزيادة امتصاص المستضد بواسطة الخلايا العارضة للمستضد ، مما يؤدي إلى تركيبات لقاح جديدة محسنة لتحريض استجابات الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد. في هذه المقالة ، نصف تخليق نظام الجسيمات النانوية "الذي يحاكي مسببات الأمراض" ، والذي يطلق عليه الحويصلات متعددة الصفائح المتشابكة بين الطبقات (ICMVs) والتي يمكن أن تكون بمثابة ناقل لقاح فعال للتوصيل المشترك لمستضدات الوحدات الفرعية والعوامل المحفزة للمناعة واستنباط استجابات الخلايا الليمفاوية CD8 + T السامة للخلايا (CTL). نصف طرق توصيف الحجم الهيدروديناميكي والشحنة السطحية للجسيمات النانوية للقاح مع تشتت الضوء الديناميكي ومحلل إمكانات زيتا ونقدم إجراء قائما على الفحص المجهري متحد البؤر لتحليل توصيل المستضد بوساطة الجسيمات النانوية إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة. علاوة على ذلك ، نعرض تقنية تصوير حيوانية كاملة جديدة تستخدم النقل بالتبني لخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد التي تعبر عن لوسيفيراز إلى الفئران المتلقية ، متبوعا بالتطعيم بالجسيمات النانوية ، والذي يسمح بالاستجواب غير الجراحي لأنماط التوسع والاتجار ب CTLs في الوقت الفعلي. نصف أيضا تلطيخ رباعي الذرات وتحليل قياس التدفق الخلوي لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة للقياس الكمي الطولي لاستجابات الخلايا التائية الذاتية في الفئران التي تم تطعيمها بالجسيمات النانوية.

المقدمة

تطوير لقاح التقليدية وقد استخدمت أساسا للنهج العملي من التجربة والخطأ. ومع ذلك، مع التطورات الأخيرة في مجموعة واسعة من المواد الحيوية واكتشاف المحددات الجزيئية لتنشيط جهاز المناعة، أصبح من الممكن الآن لتصميم بعقلانية تركيبات اللقاح مع العظة الفيزيائية الحيوية والكيمياء الحيوية المستمدة من مسببات الأمراض 1،2. على وجه الخصوص، وقد تم فحص مختلف منصات توصيل الدواء الجسيمية الناقلين لقاح لأنها يمكن أن يشترك محملة مستضدات الوحيدات وكلاء مناعة وحماية مكونات لقاح من التدهور، وتعزيز تعاونهم التسليم لمستضد الخلايا تقديم (ناقلات الجنود المدرعة) المقيمين في الليمفاوية العقد (LNS)، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من التحفيز المناعي وتفعيل 3-5. في هذا التقرير، وصفنا تركيب نظام جسيمات متناهية الصغر "محاكية الممرض"، ووصف-interbilayer crosslinked الحويصلات عديد الصفاحات (ICMVs)، والتي تم في السابق أثبتت بمثابة المنهاج لقاح فعالم للالاستنباط من قوة الخلايا اللمفاوية التائية السامة (CTL) والاستجابات المناعية الخلطية في كل النظامية والمخاطية المقصورات الأنسجة 6-9. على وجه الخصوص، والتطعيم مع ICMVs حققت عززت بشكل كبير من مستويات مفتش مصل ضد مستضد الملاريا، مقارنة مع التطعيم مع المواد المساعدة التقليدية (على سبيل المثال، الشب وMontanide) 7 وأيضا أثارت ردود CTL قوية ضد الخلايا السرطانية ونماذج التحدي الفيروسية في الفئران 9. هنا، وذلك باستخدام ICMVs كنظام جسيمات متناهية الصغر لقاح النموذج، وصفنا طرق لتوصيف من لقاح النانو الصيغ، بما في ذلك حجم الجسيمات والقياسات زيتا المحتملة وتتبع الاتجار الجسيمات إلى LNS استنزاف (dLNs) باستخدام التصوير متحد البؤر الأنسجة cryosectioned 7. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم وسيلة تستند التصوير كله والحيوان تحليل توسيع الردود CTL في الفئران بعد نقل بالتبني مستضد محددة CD8 + T الخلايا، معربا عن luciferase المراسل 9،10. وأخيرا، فإننا ديالكاتب تلطيخ tetramer الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) لتقدير الطولي للاستجابات الخلايا T المحلية في تحصين الفئران مع النانوية 6،9.

ICMVs هي صياغة جسيمات متناهية الصغر القائم على الدهون توليفها من قبل الانصهار رقابة من الجسيمات الشحمية بسيطة في الهياكل عديد الصفاحات، والتي يتم بعد ذلك ثابتة كيميائيا من قبل جماعات رئيس فوسفورية-functionalized maleimide عبر ربط داخل طبقات الدهون مع ثنائي الثيول crosslinkers 6. مرة واحدة وقد تم تجميع ICMVs، وهو جزء صغير من الجسيمات النانوية يمكن أن تستخدم لتحديد حجم الجسيمات وزيتا المحتملة (أي تهمة سطح جزيئات) مع (DLS) نظام تشتت الضوء الحيوي ومحلل المحتملة زيتا. DLS يقيس التغيرات في تشتت الضوء في تعليق الجسيمات، مما يتيح تحديد معامل الانتشار وحجم الهيدروديناميكية الجسيمات 11. تحقيق ثابت حجم الجسيمات من دفعة لدفعة التوليف أمر بالغ الأهميةمنذ حجم الجسيمات هي واحدة من العوامل الرئيسية التي تؤثر تصريف الليمفاوي من جزيئات اللقاح لdLNs وامتصاص الخلوية لاحق من ناقلات الجنود المدرعة 12،13. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على إمكانات زيتا من خلال قياس سرعة الجسيمات عند تطبيق تيار كهربائي، والذي يسمح بتحديد التنقل الكهربي من الجسيمات والجسيمات سطح تهمة 11. ضمان القيم المحتملة زيتا ثابت من الجزيئات المهم منذ تهمة سطح جزيئات يحدد الاستقرار الغروية، التي لديها تأثير مباشر على تشتت الجسيمات أثناء التخزين وبعد المجراة الإدارة 14،15. من أجل تتبع توطين الجسيمات لdLNs، ICMVs يمكن المسمى مع fluorophores المطلوب بما في ذلك الأصباغ محبة للدهون ومولدات المضادات الموسومة تساهميا. بعد التطعيم، والفئران يمكن أن يتم التخلص عند نقاط زمنية مختلفة، dLNs مقطوعة، cryosectioned، وتحليلها مع المجهر متحد البؤر. هذا الأسلوب يسمح التصور من دري اللمفاوينينغ كل من ناقلات اللقاح جسيمات متناهية الصغر والمستضد إلى dLNs. بالإضافة إلى ذلك يمكن أن تكون ملطخة أقسام الأنسجة مع fluorescently المسمى الأجسام المضادة واستخدامها للحصول على مزيد من المعلومات، مثل أنواع من الخلايا المرتبطة مستضد وتشكيل مراكز جرثومي كما بينا سابقا 7.

مرة واحدة هو الأمثل لتجميع الجسيمات وأكد الاتجار إلى dLNs، فمن المهم للتحقق من صحة الاستنباط من التوسع في الجسم الحي CTL. من أجل تحليل الاستنباط من CD8 + T الخلايا مستضد معين ردا على التطعيم جسيمات متناهية الصغر، ونحن قد تستخدم مستضد نموذج، ألبومين البيض (OVA)، مع OVA 257-264 الببتيد (SIINFEKL) سائد مناعيا CD8 + T الخلايا حاتمة، والذي يسمح التحاليل المناعية مفصلة من استجابات الخلايا T مستضد معين الاولي 16،17 تطوير لقاح. على وجه الخصوص، لاستجواب ديناميات التوسع والهجرة من CD8 + T الخلايا مستضد معين، ونحن قد ولدتالمزدوج المعدلة وراثيا نموذج الفأر من خلال عبور يراعة luciferase المراسل، معربا عن الفئران المعدلة وراثيا (لوك) مع OT-I الفئران المعدلة وراثيا التي تمتلك خلايا CD8 + T مع T-مستقبلات الخلايا (TCR) محدد لSIINFEKL (بالتعاون مع H-2K ب). من هذه الفئران OT-I / لوك، معربا عن luciferase المراسل، خلايا OT-I CD8 + T يمكن أن تكون معزولة وعلى استعداد لنقل بالتبني في ساذجة C57BL / 6 الفئران. مرة واحدة المصنف، والتحصين الناجح مع النانوية التي تحتوي على OVA يؤدي إلى توسيع الخلايا T نقل، والتي يمكن تتبعها من خلال رصد إشارة تلألؤ بيولوجي مع كامل 9،10 نظام التصوير الحيوانية. وقد استخدمت هذه التقنية التصوير كامل الجسم غير الغازية مع غيرها من المضادات الفيروسية أو ورم في الماضي 18-20، العمليات التي ينطوي عليها توسيع الخلايا التائية في الأنسجة اللمفاوية وتوزيعها على الأنسجة الطرفية بطريقة طولية يكشف.

مكملة لتحليل adoptively CD8 + T الخلايا مستضد معين نقلها، endogenoاستجابات الخلايا لنا T وظيفة يمكن أن يتم فحص التطعيم مع مجمع الببتيد رئيسي التوافق النسيجي (MHC) tetramer فحص 21، الذي مجمع tetramer الببتيد MHC، التي تتألف من أربعة الموسومة fluorophore MHC من الدرجة I جزيئات محملة الحواتم الببتيد، يعمل لربط TCR والتسمية CD8 + T الخلايا بطريقة مستضد معين. وtetramer مقايسة الببتيد MHC لا يمكن أن يؤديها إما في الدراسات التشريح النهائية لتحديد CD8 + T الخلايا مستضد معين في اللمفاوية والأنسجة الطرفية أو في الدراسات الطولية مع الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) تم الحصول عليها من توجه الدم التسلسلي. بعد تلطيخ الخلايا الليمفاوية مع الببتيد MHC tetramer، تحليل التدفق الخلوي يتم تنفيذ للتحليلات مفصلة عن النمط الظاهري من CTLs أو الكمي من وتيرتها بين خلايا CD8 + T.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الجامعة على استخدام ورعاية الحيوانات (UCUCA) في جامعة ميشيغان وتنفيذ وفقا للسياسات والمبادئ التوجيهية الموضوعة.

1. تحضير وتوصيف ICMVs شركة محملة بروتين مستضد ويؤجل الجزيئات

  1. خلط نسبة 1: 1 المولي من 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DOPC) و1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (ص -maleimidophenyl) butyramide] (MPB) في الكلوروفورم، والحفاظ على المبلغ الإجمالي للدهون في 1.26 ميكرومول لكل دفعة (أي 500 ميكروغرام من DOPC و 630 ميكروغرام من MPB) في قنينة زجاجية 20 مل (القطر = 28 ملم والارتفاع = 61 مم).
  2. إضافة المخدرات محبة للدهون، مثل monophosphoryl الدهون A (MPLA) أو الأصباغ محبة للدهون (على سبيل المثال، لم)، إلى حل الدهون في التركيز المطلوب. تماما إزالة المذيبات العضوية من خلال تطهير مع nitroge الجاف اضافيةن الغاز ووضع العينات تحت فراغ O / N.
  3. هيدرات الفيلم الدهون عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 10 ملي مكرر تريس البروبان (BTP، ودرجة الحموضة 7.0) تحتوي على عقاقير للذوبان في الماء (على سبيل المثال، مستضدات البروتين). دوامة لمدة 10 ثانية كل 10 دقيقة لمدة 1 ساعة على RT.
  4. نقل المحتويات من زجاج القارورة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وعينات من مكان في حمام الماء المثلج، ويصوتن بشكل مستمر لمدة 5 دقائق باستخدام كثافة 40٪ وضع على 125 W / 20 كيلو هرتز التحقيق طرف sonicator.
  5. إضافة 4 ميكرولتر من 150 ملي dithiothreitol (DTT) على كل دفعة (العمل تركيز 2.4 ملم)، الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة باستخدام microcentrifuge لالطاولة.
  6. إضافة 40 ميكرولتر من 200 ملي CaCl 2 وتخلط مع ماصة (العمل تركيز 33 ملم). احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح لليشابك من MPB التي تحتوي على طبقات الدهون مع DTT.
  7. عينات الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 15 دقيقة، وإزالة طاف، و resuspend في 200 ميكرولتر من ddiH 2 O.
  8. كرر الخطوة 1.7 وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى بعد الثاني ddiH 2 O تغسل لإزالة CaCl 2، غير المتفاعل DTT، والمواد البضائع unencapsulated من طاف.
  9. إعداد 10 ملغ / مل من 2 كيلو دالتون البولي ايثيلين جلايكول-ثيول (PEG-SH) في ddiH 2 O. resuspend كل عينة ICMV في 100 ميكرولتر من حل PEG-SH واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  10. إجراء عمليتين ddiH 2 O يغسل (الخطوة 1.7) و resuspend بيليه ICMV النهائي في برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 ° C. قبل الاستخدام، وخلط تعليق ICMV، أو جسيمات قد تترسب في القاع بعد التخزين لفترات طويلة.
  11. لتوصيف جزيئات، إزالة قسامة صغيرة (~ 10٪) من ICMVs من كل دفعة وتمييع بشكل فردي في إجمالي حجم 1 مل من ddiH 2 O. ضع عينة واحدة في Zetasizer حجم الخلية وقياس الجسيمات، مؤشر التشتت المتعدد، وإمكانات زيتا من العينات باستخدام DLS ونظام قياس المحتملة زيتا (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة).

2. فحص العقدة الليمفاوية تجفيف ICMVs الإسفار الموسومة مع متحد البؤر المجهر

  1. إعداد ICMVs محملة-fluorophore الموسومة مستضد وصبغة الفلورسنت محبة للدهون
    1. إعداد الموسومة fluorophore البروتين، مثل ردة فعل ألبومين البيض مع فلور اليكسا 555 succinimidyl استر، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. لإعداد ICMVs الموسومة ب fluorophore في وعاء الدهون، إضافة للدهون صبغة الفلورسنت، (على سبيل المثال، 1،1'-Dioctadecyl-3،3،3 "، 3'-Tetramethylindodicarbocyanine، (لم)) أثناء إعداد الفيلم الدهون (الخطوة 1.2) في 0.05٪ كمية الدهون المولي. لدهن ترطيب فيلم (الخطوة 1.3)، واستخدام العازلة التي تحتوي على fluorophore الموسومة مستضد، والتوليف ICMV الكامل على النحو المبين في الخطوات 1،4-1،11.
  2. الادارة تحت الجلد من الجسيمات النانوية في قاعدة الذيل
    1. تخدير الماوس باستخدام المرذاذ تدفق تسيطر مجهزة غرفة الاستقراء شtilizing 3٪ الأيزوفلورين و 1.5 لتر / دقيقة من تدفق الأكسجين وفقا لIACUC المعتمدة بروتوكول الحيوان. وبمجرد أن الفأر هو فاقد الوعي، قم بالخطوات التالية بسرعة قبل التخدير الخفوت للسماح بالوصول الأمثل لموقع الحقن وقدر من الراحة للحيوان. بدلا من ذلك، استخدم مخروط الأنف السليم المناسب للحفاظ على التخدير. إذا تم تخدير الفئران لفترة أطول من 5 دقائق، وتطبيق التشحيم العين ضروري لتقليل تهيج بعد العملية.
    2. رش قاعدة الذيل مع 70٪ من الإيثانول لتطهير وترطيب الجزء الفراء الشعر الرطب لفضح قطعة صغيرة من الجلد واضحة، والتي يمكن استخدامها لتصور إبرة تحت الجلد.
    3. إعداد الجسيمات حقن تعليق يحتوي على المبلغ المطلوب من مستضد ومساعد لكل 100 ميكرولتر من جرعة التطعيم في برنامج تلفزيوني (على سبيل المثال، تم استخدام 10 ميكروغرام OVA و 0.3 ميكروغرام MPLA لكل 100 ميكرولتر من جرعة الحقن في الماضي 6،9).
    4. لفت الباحث الجسيمات تعليقالزراعة العضوية المحاقن مع إبرة G 27-29 وادخال الإبرة في قاعدة الذيل (~ 5 ملم من منبت الشعر) مع شطبة تواجه صعودا وحقن 50 ميكرولتر من تعليق الجسيمات 22.
    5. انتظر بضع ثوان للضغط لتحقيق التعادل لمنع الإفراط في عودة تدفق وسحب الإبرة. تكرار الحقن على الجانب الآخر من قاعدة الذيل لاستهداف كل من استنزاف LNS الأربية.
  3. إعداد الليمفاوية cryosections عقدة والفحص المجهري مع متحد البؤر.
    1. الموت ببطء الفأر مع CO 2 الاختناق، تليها استرواح الصدر التي يسببها وفقا لوافق على IACUC بروتوكول الحيوان. استخراج LNS الأربية وفقا لبروتوكول موضح في بيدويا 23 وتغسل الدم عن طريق وضع الأنسجة في 1 مل من 4 ° C PBS.
    2. استيعاب PBS من الأنسجة مع الأنسجة ووضع الأنسجة في cryomolds الأنسجة (10 × 10 × 5 مم 3) معبأة سلفا إلى الأعلى مع أكتوبر تجميد المتوسطة 24. المفاجئة تجميد تيسرفع دعوى قضائية ضد كتلة في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية. بدلا من ذلك، وضع كتلة الأنسجة على الجليد الجاف لمدة 30 دقيقة. تخزين الأنسجة المجمدة في الفريزر -80 درجة مئوية.
    3. قطع أقسام الأنسجة 5-10 ميكرون سميكة في ناظم البرد وضعت في -20 ° C 24.
    4. إذا لزم الأمر، نفذ الوسم المناعي، وفحص الأنسجة مع المجهر متحد البؤر كما هو موضح سابقا 24.

3. رصد توسيع مستضد معين، luciferase المراسل في التعبير عن CD8 + T الخلايا بعد الجسيمات النانوية التطعيم مع الجامعة التصوير الحيوانية

  1. عزل OVA 257-264 -specific، CD8 + T الخلايا، معربا عن luciferase المراسل من OT-I / لوك الفئران المعدلة وراثيا
    1. الموت ببطء الماوس المعدلة وراثيا OT-I / لوك مع CO 2 الخنق وإحداث استرواح الصدر وفقا لIACUC الموافقة على بروتوكول الحيوان. حصاد الطحال بطريقة معقمة عن طريق الوصول إلى التجويف البريتوني وفصل أنسجة من البنكرياس 23 بعناية، ومكان في 5 مل من 4 ° C PBS + 2٪ FBS لنقلها إلى غطاء نسيج الثقافة.
    2. وضع الطحال على 70 ميكرومتر النايلون مصفاة أكثر من 50 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي (تصل إلى 3 الطحال في كل مرة). باستخدام المكبس من حقنة 3 مل، طحن الخلايا من خلال مصفاة.
    3. غسل الغطاس ومصفاة مع PBS + 2٪ FBS وتجاهل. جلب الحجم الإجمالي إلى 10 مل / الطحال في أنبوب 50 مل، أخذ عينة صغيرة من تعليق خلية العد مع عدادة الكريات، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 ز س.
    4. باستخدام المغناطيسية مجموعة مختارة السلبية المتاحة تجاريا، عزل السكان خلية CD8 + T باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    5. بعد غسل الخلايا مع PBS، عد عدد الخلايا CD8 + T معزولة. لتقييم نقاء من الخلايا CD8 + T معزولة، واحتضان ~ 20،000-30،000 الخلايا في 20 ميكرولتر من الماوس CD16 / 32 الأضداد (0.025 ملغ / مل) لمدة 10 دقيقة، ثم إضافة 20 ميكرولتر من αCD8-APC الأجسام المضادة (0.005 ملغ / مل) واحتضان لمدة 30 دقيقة. المؤسسة العامةrform جميع حضانات في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني + 1٪ ث / ت BSA. أداء تدفق تحليل cytometric 25.
  2. نقل بالتبني من خلايا CD8 + T معزولة والتصور التطعيم آخر توسعها
    1. أداء نقل بالتبني من خلايا معزولة OT-I / لوك CD8 + T إلى السذاجة C57BL / 6 الفئران عن طريق إدارة 10/01 × 10 5 الخلايا في حجم 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عبر الذيل الوريد الوريد حقن 22 (يوم -1). وبالنظر إلى أن الفراء والجلد الأسود بقع في C57BL / 6 الفئران قد تتداخل مع إشارة للإضاءة الحيوية، البيضاء حلق C57BL / 6 الفئران هي مثالية لهذه الدراسات.
    2. بعد يوم واحد (يوم 0)، إدارة اللقاح كما هو موضح سابقا (القسم 2.2).
    3. إدارة 150 ملغ من وسيفيرين لكل كيلوغرام من وزن جسم الفأر البريتونى في حجم 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد 10 دقيقة، تخدير الفئران مع isoflurane (كما في الخطوة 2.2.1) وتصور الخلايا OT-I / لوك CD8 + T من خلال الحصول على إشارة تلألؤ بيولوجي لمدة 5-10 دقيقة ثإيث نظام تصوير كل الحيوانات (IVIS، تشير إلى ويلسون 26 للتعليمات مفصلة). كرر حسب الضرورة للدراسات طولية.

4. خلايا الببتيد-MHC تلطيخ tetramer من PBMCs لتحليل مستضد محددة CD8 + T

ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا الإجراء بروتوكول التالية باستخدام إما C57BL / 6 الفئران نقل adoptively مع الخلايا OT-I / لوك CD8 + T أو C57BL / 6 الفئران دون نقل بالتبني.

  1. في نقطة الوقت المطلوب بعد التطعيم، وجمع ما يقرب من 100 ميكرولتر من الدم (4-6 قطرات) من الفئران عبر تقنية نزيف تحت الفك السفلي 27 في أنبوب المغلفة مع K 2 EDTA وعكس عدة مرات لمنع التخثر.
  2. نقل 100 ميكرولتر من الدم إلى أنبوب microcentrifuge، إضافة 1 مل من تحلل العازلة، واحتضان لمدة 2-3 دقيقة من أجل إزالة خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). عينات الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1500 x ج وإزالة طاف. إذا كان بيليه يزالppears الحمراء (تشير إزالة غير كاملة من كرات الدم الحمراء)، كرر الخطوة تحلل مع حضانة قصيرة (<1 دقيقة) من تحلل العازلة.
  3. غسل PBMCs المتبقية مع 1 مل من العازلة FACS (PBS + 1٪ ث / ت BSA) وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. نضح طاف و resuspend العينة في 20 ميكرولتر من الماوس CD16 / 32 الأضداد (0.025 ملغ / مل) لمنع الأجسام المضادة غير محددة وFCR بوساطة ملزمة. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  5. نقل الخلايا من أنابيب microcentrifuge في 4 مل أنابيب FACS أسفل الجولة. إضافة 20 ميكرولتر من H-2K ب حل OVA Tetramer-SIINFEKL-PE وفقا لمواصفات الشركة الصانعة لكل عينة واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  6. تحضير الكوكتيل الأضداد (على سبيل المثال، αCD8-APC، αCD44-FITC، وαCD62L-PECy7 الأجسام المضادة (0.005، 0.005، و 0.002 ملغ / مل تركيز على التوالي)). إضافة 20 ميكرولتر من كل عينة تجريبية، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد. إعداد الضوابط fluorophore واحدة بواسطة labeling الخلايا مع بعضها tetramer الموسومة fluorophore أو الأجسام المضادة في تركيز المشار إليها أعلاه.
  7. غسل 2 مرات مع العازلة FACS و resuspend بيليه النهائي في FACS العازلة التي تحتوي على 2 ميكروغرام / مل من دابي. الخلايا هي الآن جاهزة للتحليل التدفق الخلوي (التفاصيل والأمثلة يمكن العثور عليها في Scheffold 25).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويوضح الخطوات المتبعة في تركيب ICMVs في الشكل 1 6. باختصار، هو رطب فيلم الدهون التي تحتوي على أية عقاقير محبة للدهون أو الأصباغ الفلورية في وجود المخدرات ماء. الكاتيونات ثنائي التكافؤ، مثل الكالسيوم 2+، تضاف لدفع مزيج من الجسيمات الشحمية أنيوني إلى الحويصلات عديد الصفاحات. تطفأ ثنائي الثيول crosslinker، مثل DTT، يضاف إلى "الأساسية" الدهون-functionalized maleimide على apposing طبقات الدهون، وأخيرا مجموعة maleimide الخارجية المتبقية ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف بروتوكول المنصوص عليها في هذه المادة توليف وتوصيف نظام جديد جسيمات متناهية الصغر القائم على دهون، ووصف ICMVs، ويوفر عملية التحقق من صحة فعالية تركيبات لقاح القائم على جسيمات متناهية الصغر للحث على CD8 + T استجابات الخلايا مستضد معين. اكتمال ICMV التوليف في كل حالة المائية، وهي ميزة كبيرة مقارنة مع النظم الأخرى المستخدمة عادة البوليمرية جسيمات متناهية الصغر (على سبيل المثال، بولي (lactide-CO-glycolide) جزيئات الحمض)، والتي تتطلب عادة المذيبات العضوية لإعداد، مما أدى إل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

قدمت بيركن إلمر تكلفة الإنتاج المتكبدة خلال نشر هذا المقال.

شكر وتقدير

وأيد هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للصحة منح 1K22AI097291-01 والمركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم من المعاهد الوطنية للصحة في إطار جائزة عدد UL1TR000433. علينا أيضا أن نعترف الأستاذ داريل ايرفين في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا والبروفيسور ماتياس ستيفان في مركز فريد هاتشينسون للسرطان لمساهمتهم في الأعمال الأولية على لقاح النانوية وOT-I / لوك الفئران المعدلة وراثيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

4. تلطيخ رباعي الببتيد-معقد التوافق النسيجي الكبير لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) لتحليل التدفق الخلوي لخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد < / قوية >
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>1. تخليق وتوصيف ICMVs المحملة بمستضد البروتين والجزيئات المساعدة < / قوية >
1،2-dioleoyl-sn< / em>-glycero-3-phosphoethanolamine-N< em>-[4- (p< / em>-maleimidophenyl)butyramide] (ملح الصوديوم) (MPB)Avanti Polar Lipids، INC.870012
1،2-dioleoyl-sn< / em>-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids، INC.850375
أحادي الفوسفوريل ليبيد أ (اصطناعي) (PHAD™) (MPLA)Avanti Polar Lipids، INC.699800
20 مل قوارير زجاجيةWheaton0334125D
Symphny Vacuum OvenVWR414004-580
Ovalbumin (OVA)Worthington3054
Bis-Tris Propane (BTP)FisherBP2943
Q125 Sonicator (125   W / 20   ؛ كيلو هرتز)QsonicaQ125-110
Dithiothreitol (DTT) فيشرBP172
2 كيلو دالتون ثيوليد بولي إيثيلين جلايكول (PEG-SH)Laysan BioMPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP & nbsp ؛Malvern
ZetaSizer CuvettesMalvernDTS1070
2. فحص تصريف العقدة الليمفاوية ل ICMVs الموسومة بالفلورة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر < / قوي >
1،1 '-ديوكتاديسيل -3،3،3 '، 3 '-تتراميثيلإندوديكاربوسيانين ، 4-ملح كلوروبنزين سلفونات (DID) LifeTechnologiesD-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) LifeTechnologiesA37571
Tissue-Tek OCT التجميد المتوسط VWR25608-930
قوالب الأنسجة المبردةVWR25608-922
3. مراقبة توسع خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد والتي تعبر عن اللوسيفيراز بعد التطعيم بالجسيمات النانوية بتصوير كامل < / قوي >
C57BL / 6 فئرانجاكسون000664
ألبينو C57BL / 6 فئرانجاكسون000058
OT-1 C57BL / 6 فئرانجاكسون003831
70 & mu ؛ م مصفاة نايلونديناربحريني 352350
EasySep & trade; طقم عزل الخلايا التائية CD8 + StemCell19853
IVIS & reg ؛ نظام تصوير بالكاملPerkin Elmer
K 2< / sub>EDTA أنابيبBD365974
ACK تحلل عازلةLife TechnologiesA10492-01   ؛
Anti-CD16 / 32 Fc BlockEbioscience14-0161-86
H-2K < sup >b < / sup> OVA TetramerMBLTS-5001-1C
Anti-CD8-APCBD553031
Anti-CD44-FITCBD553133
Anti-CD62L-PECy7Ebioscience25-0621-82
4 &prime ؛ 6- Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)SIGMAD8417-10MG
CyAn CyAn Flow CellularBeckman Coulter
FlowJo SoftwareFlowJo
< td colspan = "4" >

المراجع

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130(2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771(2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765(2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. , 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740(2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465(2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105(2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627(2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

T CD8

مقالات ذات صلة