Method Article

نظم هيلا خلية استنادا حرية التعبير للتعبير عن المتصورة المقيرع البروتينات

DOI:

10.3791/52772

⸱

June 10th, 2015

 , 
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير عن البروتينات ملاريا في نظم الخلايا استنادا يظل تحديا. علينا أن نبرهن خطوتين واحد IVT خطوة (في الترجمة المختبر) نظم خلايا حرية التعبير للتعبير عن الملاريا البروتينات المقيرع المؤتلف من خلايا هيلا. ونحن نستخدم نظام تنقية أساس ني راتنج تقارب لتنقية البروتينات المقيرع.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الملاريا يسبب الاعتلال عالمي كبير والوفيات. لا يوجد لقاح الروتيني هو متاح حاليا. واحدة من الأسباب الرئيسية لعدم وجود لقاح هو تحدي تحديد المرشحين لقاح مناسب. وأعرب البروتينات ملاريا باستخدام والغليكوزيلاتي نظم التعبير خلية بدائية النواة مقرها وحقيقية النواة سيئة، غير قابلة للذوبان بشكل عام، والخضوع للطي غير لائق مما أدى إلى انخفاض المناعة. تستخدم أنظمة حرية التعبير جنين القمح، المحللة أرنب الخلايا الشبكية والإشريكية القولونية الخلايا المحللة حاليا للتعبير عن البروتينات ملاريا. ومع ذلك، فإن طول الفترة الزمنية التعبير وبالغليكوزيل غير لائق من البروتينات لا يزال يشكل تحديا. علينا أن نظهر التعبير عن البروتينات المتصورة في المختبر باستخدام نظم حرية التعبير خلية مقرها هيلا، ووصف "في المختبر الخلية الحرة أنظمة التعبير الإنسان". نظم حرية التعبير خلية استنادا 2 هيلا نسخ مرنا في 75 دقيقة و 3 ميكرولتر من transcribإد مرنا غير كاف لترجمة البروتينات في 90 دقيقة. نظام التعبير 1-الخطوة هو النسخ والترجمة نظام التعبير مقترنة؛ يحدث النسخ وشارك في الترجمة في 3 ساعات. ويمكن أيضا أن تمتد عملية لمدة 6 ساعة خلال توفير طاقة إضافية. في نظام التعبير 2-الخطوة، هو كتب مرنا أولا ثم تضاف إلى مزيج ترجمة للتعبير البروتين. وصفنا كيفية التعبير عن بروتينات الملاريا؛ ومسعور شق PF3D7_0114100 ماورر - 2 الغشاء (PfMC-2TM) بروتين، بروتين PF3D7_0925900 ماء ويكرر أرماديلو تحتوي على البروتين PF3D7_1361800، وذلك باستخدام نظام حرية التعبير الخلية هيلا القائمة. يتم التعبير عن البروتينات بكميات صغيرة توظيف استراتيجيات التعبير 2-خطوة و1-الخطوة. طريقة تنقية تقارب لتنقية 25 ميكرولتر من البروتينات وأعرب باستخدام أيضا يوصف الخلية البشرية نظام حرية التعبير في المختبر. يتم تحديد العائد البروتين عن طريق فحص برادفورد وأعربتوتنقية البروتينات يمكن التأكد من خلال تحليل النشاف الغربي. البروتينات المؤتلف وأعرب يمكن استخدامها لالتحصينات، المناعية والتسلسل البروتين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في أبحاث الملاريا، التعبير عن البروتينات المناعية باستخدام نظم الخلايا أولية النواة أو حقيقية النواة تستند لا يزال يشكل تحديا. ثراء AT من الجينوم المتصورة والآليات آخر متعدية غير معروفة 14،7، والمساهمة في الصعوبات المرتبطة بالحصول على البروتينات مطوية ومناعة سليم للدراسات إنتاج الأجسام المضادة واللقاحات. نظم الكائنات الحية بدائية مثل الإشريكية القولونية استخدمت لالمؤتلف تعبير البروتين. أنظمة بدائية النواة هي منخفضة التكلفة، وفعالة، تنتج غلة عالية من البروتين المؤتلف ويكون ناقلات الاستنساخ متعددة. استضافة E. خلايا القولونية هي سهلة لتحويل والخلايا تنمو بسرعة. ومع ذلك، وأنظمة بدائية النواة لديها قيود مثل نقص حمض أميني تبديل أو تعديل آخر متعدية، خطر التلوث والمنتجات غير متجانسة وتراكم البروتينات المؤتلف ضمن الهيئات إدراج 24.

فيالدراسة التي Mehlin وآخرون (2006)، وأعرب عن 1000 إطارات القراءة المفتوحة (ORF). وكانت حوالي 7٪ من البروتينات القابلة للذوبان وأعرب 14. ويرجع ذلك إلى طبيعة منحازة للجينات وتيرة عالية من الكودونات التي يتم استخدامها بشكل مثالي من قبل المتصورة AT الجينوم الغني 14 الذوبان الملاحظة. وقد وضعت استراتيجية بديلة للتغلب على هذه المشكلة عن طريق استخدام البلازميدات أو الخلايا المضيفة التي تحتوي على tRNAs التي تعترف كودونات نادرة أو الكودونات التي تطابق الترددات 3. حتى بعد تنفيذ هذه التحسينات، يتم التعبير عن أجزاء صغيرة جدا من البروتينات كما قابل للذوبان، ونشط ومناعة 14. نظم التعبير خالية من الخلايا تحتوي على جميع العناصر الضرورية للالنسخ والترجمة مثل ريبوسوم، والعوامل بدء، عوامل استطالة (العوامل ترجمة)، الحمض الريبي النووي النقال وsynthetases أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال. تقترن كل من ردود الفعل النسخ والترجمة في خطوة واحدة الإجراء 11،29. وtranscriيتم تنفيذ رد فعل ption في أنبوب قبل المحتضنة كمية مناسبة من مرنا مع الآلات الترجمة في أنبوب 11،29 مختلفة. على الرغم من أن هذه الأساليب الناجحة في المتصورة ليرة سورية. البروتين التعبير، وهو العيب الرئيسي هو طول الوقت للتعبير البروتين، وهو ما يقرب من 22 ساعة 29. وبالإضافة إلى ذلك، وارتفاع تكلفة إمدادات لإدراجها في البروتوكولات 29، الاستعدادات كثيفة العمالة من الخلايا المحللة والتناقضات في الأعمال التحضيرية المكونة، وجعل هذه الأنظمة غير قابلة للتحقيق. التركيز الرئيسي من الباحثين عن تطوير نظام حرية التعبير الخلية يعتمد على عوامل مثل التعديل الوراثي السريع، عوائد سريعة مع تركيزات عالية ومباشرة الاستعدادات المحللة إلى الأمام 1.

نظم حقيقية النواة مثل الخميرة، وخطوط خلايا الثدييات، العصوي بوساطة نظام التعبير، رباعية الغشاء thermophilia، Dictyostelium discoideum ونظم التعبير الطفيلية سووقد استخدمت الفصل كما الليشمانيا للبروتين المؤتلف التعبير 7. نظم حقيقية النواة تتقاسم علاقة النشوء والتطور، وبالتالي تشترك أيضا خصائص مثل بالغليكوزيل، أسيلة، تشكيل السندات ثاني كبريتيد، والتفاعل كوصي، التحلل البروتيني والتقسيم الفرعي الخلوية. أحداث إفراز البروتين في حقيقيات النوى تمنع تراكم والنقصان سمية لأنظمة التعبير 13. ويفضل استخدام نظم الخميرة كما أنها مناسبة للتعبير البروتين في نطاق واسع والحصول على عوائد عالية 4. اثنين P. تم إنتاج البروتينات المنجلية PfCP-29 و Pvs25 باستخدام نظام الخميرة 4. ومع ذلك، كان العائق الرئيسي في تركيب معظم البروتينات غير النظامية N و O-بالغليكوزيل أنماط، قابلة للطي غير لائق والاقتطاع من البروتينات من النموذج الأصلي من 4.

استخدام خلايا الثدييات لتخليق البروتينات المؤتلف هو كثيفة العمالة وexpen ذلكSIVE للحفاظ على خطوط الخلايا المؤتلف مستقرة 4. وبالتالي، خلايا الثدييات كانت محدودة لتحليل الإشارات البروتين، وتفاعلات البروتين وتفاعلات الطفيلي المضيف وأيضا لاختبار لقاحات الحمض النووي (4). الحمض النووي البشري ومرنا في المختبر تعبير البروتين نظام خالية من الخلايا الموصوفة هنا هو نظام المستمدة من الخلايا هيلا أساس الثدييات التي تعبر عن البروتينات في 3 ساعات. وأعرب البروتينات باستخدام pT7CFE1-CHIS التعبير ناقلات وعلامة-C محطة تسهيل تحديد وتنقية. ويكمل النظام القائم هيلا مع العوامل ترجمة بدء ومنظم الترجمة، وبالتالي تعزيز كفاءة نظام الترجمة. البروتينات يمكن أن تترجم بسرعة، فحص، التحقق ومعالجتها لاستخدامها في مختلف التطبيقات المناعية والهيكلية 15.

وتستخدم حقيقية النواة نظم التعبير خالية من الخلايا مثل جرثومة القمح والأرانب الخلايا الشبكية حاليا للتعبير عن فاربروتينات حقيقية النواة] [إيووس] بما في ذلك البروتينات المتصورة 11،29. وبالإضافة إلى ذلك، E. ويعمل نظام خالية من الخلايا استنادا القولونية أيضا لحقيقيات النوى التعبير البروتين 11. ويلخص الجدول 1 مختلف النظم التعبير الخلية الحرة بمقارنة خصائص النظم فضلا عن سهولة استخدام أنظمة للتعبير البروتين. نظام خالية من الخلايا البشرية بالمقارنة مع الآخرين لديه القدرة على أداء وظيفة وشارك متعدية التعديلات وأقل تكلفة. كودون الأمثل هو ممكن، وجميع ردود الفعل لا يمكن أن يؤديها في 3 ساعات. نظام هيلا هو نظام ترجمة مثالية لتخليق البروتين في المعمل.

والميزة الرئيسية لنظم التعبير الخلية الحرة الإنسان على غيره من الأنظمة الحرة الخلية توافر عدة خطوط مختلفة من الخلايا المشتقة من أعضاء وأنسجة مختلفة. ويمكن تصميم عدة أنواع من الأنظمة الحرة خلية اعتمادا على خط الخلية. استخراجالصورة المشتقة من خلايا الثدييات لها كفاءة أعلى لتجميع البروتينات كبيرة من أي أنظمة أخرى التعبير الخلية الحرة. ويمكن أيضا أن هذه الأنظمة خلية حرية التعبير يمكن استخدامها في تطبيقات توصيف التشخيص والبروتين مثل المصفوفات الدقيقة 30. وتستخدم على نطاق واسع في خطوط الخلايا شعبية هيلا لتنفيذ التعبير عن البروتينات 33. الشبكة الإندوبلازمية في خطوط الخلايا هيلا متخلفة، مما يؤدي إلى عدم وجود ارتباط بالغليكوزيل آخر متعدية النشاط تعديل 33. ومع ذلك، يعتقد هذا النظام ليكون من المفيد لالمتصورة تخليق البروتين كما تفتقر أيضا المتصورة آخر بالغليكوزيل الترجمة تعديل 29. الحر بروتوكول النسخ والترجمة الخلية هيلا هو السهل القيام بها، وغير مكلفة ويمكن التعبير عن البروتينات في 90 دقيقة، وعلى استعداد لتنقية ومزيد من التطبيقات المصب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الطفيلي الثقافات الخليوي، جمع الطفيلي الكريات

  1. إعداد وسائل الاعلام RPMI-1640-HEPES عن طريق إضافة 10 غرام من مسحوق RPMI-1640، 66 ملغ من كبريتات الجنتاميسين، 2 غرام بيكربونات الصوديوم، 5.9 غرام HEPES العازلة، 50 ملغ هيبوزانتين و 3.8 غرام سكر العنب في 1 L درهم العقيمة 2 O. مزيج باستخدام الجدول مغناطيسي حتى جميع يذوب المسحوق في 1 لتر ماء مقطر. أداء الترشيح الجزئي من وسائل الإعلام باستخدام 0.22 ميكرون التصفية. تخزين وسائل الإعلام في زجاجات معقمة.
  2. غسل غير مصاب (الطازجة) اكتب A + كريات الدم الحمراء باستخدام RPMI. إعداد 5٪ الهيماتوكريت كرات الدم الحمراء (0.5 مل من الكريات الحمراء الطازجة غسلها في 9.5 مل 10٪ RPMI + المصل البشري).
  3. جعل المصل 15٪ البشري + RPMI (15 مل من الدم البشري و 85 مل من RPMI) لبدء زراعة الطفيليات. جعل المصل البشري 10٪ وRPMI (10 مل من الدم البشري و 90 مل من RPMI) لمواصلة زراعة الطفيليات في خلايا الدم الحمراء.
  4. ثقافة P. المنجلية (3D7 وFCR-3 سلالات) في نوعA + كريات الدم الحمراء البشرية على 5٪ الهيماتوكريت و 20٪ الطفيل في طبق بتري أو ثقافة قارورة 75 سم 3. الحفاظ على الثقافة في المختبر وفقا لطريقة Trager وجنسن شمعة جرة 26. بالتناوب، والحفاظ على الثقافات في الحاضنة عند 37 درجة مئوية الحفاظ 9.5٪ CO 2 و 3.4٪ N 2 الغاز. ثقافة P. المنجلية في RPMI 1640-HEPES وسائل الإعلام تستكمل مع المصل البشري 10٪.
  5. مزامنة P. ثقافة المنجلية وذلك بإضافة 65٪ percoll (65 مل من percoll + 35 مل من RPMI-1640 دون المصل البشري) إلى ثقافة تركز 27.
  6. أجهزة الطرد المركزي في التركيز الثقافة مع percoll في 2500 x ج لمدة 5 دقائق مما يؤدي الى 3 طبقات. بعناية، وذلك باستخدام ماصة نقل عزل schizonts من نقل الطبقة المتوسطة في أنبوب منفصل تحت ظروف معقمة 27.
  7. غسل الثقافات معزولة مع المصل البشري 10٪ + RPMI-1640 مرتين لإزالة percoll الزائد عن طريق الطرد المركزي في 7500 x ج لمدة 5 دقائق. ديscard طاف في كل مرة تحت ظروف معقمة 27.
  8. مواصلة زراعة وP. متزامنة schizonts المنجلية في مصل الدم البشري 10٪ + RPMI-1640 (27).
  9. جمع schizonts عن طريق التعامل المتصورة الكريات الحمراء -infected مع 10 ملي تريس درجة الحموضة 8.8 و الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 15 دقيقة و 23. الكريات مخزن الطفيلي في -70 ° C التالية إضافة 5 ميكرولتر من مثبطات الأنزيم البروتيني (أبروتينين) إلى الكريات. استخدام الكريات الطفيليات لاستخراج البروتين، وعزل الحمض النووي الجينومية وعزل الحمض النووي الريبي.

2. إعداد البلازميد المتجهات

  1. عزل الحمض النووي الجيني من P. الكريات المنجلية المتقسمة أعدت من ثقافات ما يقرب من 20٪ الطفيل.
  2. إضافة 600 ميكرولتر من 10MM تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 50 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0، 0.1٪ SDS و 1 ملغ / مل بروتين K، إلى الكريات في أنبوب microcentrifuge، التجانس بيليه باستخدام حقنة 1 مل تعلق على إبرة 26 G. بديل ملء الحقنةمع خليط بيليه ويصب في أنبوب microcentrifuge 20 مرة. احتضان الأنبوب الذي يحتوي جناسة O / N في 50 ° C حمام الماء.
  3. أداء الفينول - الكلوروفورم (P + C) استخراج بإضافة 600 ميكرولتر من P + C (300 ميكرولتر من الفينول و 300 ميكرولتر من كلوروفورم) لبيليه المتجانس. أنبوب الغطاء بإحكام ويهز الخليط بقوة بواسطة قلب أنبوب نهاية إلى نهاية. أنبوب الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 2 دقيقة وجمع محلول مائي العلوي باستخدام micropipette في أنبوب microcentrifuge جديد. كرر هذه الخطوة مرتين.
  4. إضافة 600 ميكرولتر من كلوروفورم للطبقة المائية في أنبوب جديد من الخطوة 2.1.2. دوامة الأنبوب لمدة 10 ثانية والطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 2 دقيقة. قياس الطبقة المائية العليا مع micropipette وتحويلها إلى أنبوب microcentrifuge جديد.
  5. إضافة 0.1 المجلد من 5 M الصوديوم خلات درجة الحموضة 5.5 و 1 المجلد من الأيزوبروبانول (إن الطبقة المائية 300 ميكرولتر إضافة 30 ميكرولتر من 5 M الصوديوم خلات درجة الحموضة 5.5 + 330 ميكرولتر من الأيزوبروبانول) لوضع مائيإيه من الخطوة 2.1.3. احتضان الأنبوب في RT لمدة 15 دقيقة.
  6. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 14000 x ج لمدة 10 دقيقة لترسيب الحمض النووي بيليه. تجاهل طاف ويغسل بيليه مع 100 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول (70 ميكرولتر من الايثانول و 30 ميكرولتر من درهم 2 O) لإزالة الملح الزائد من DNA. متجر الحمض النووي في 50 ميكرولتر من درهم 2 O في -20 ° C.
  7. تصميم الأمام وعكس الاشعال باستخدام برامج أو يدويا عن التضخيم من P. الجينات المنجلية PF3D7_1361800، PF3D7_0925900، PF3D7_1436300 وPF3D7_0114100 التي سبق تحديدها في الدراسات بروتيوم 16،18 مع تقييد مواقع مناسبة للسماح استنساخ تسلسل الجينات في مواقع الاستنساخ متعددة من التعبير البلازميد pT7CFE1-CHIS كما هو مبين في الجدول رقم 2.
  8. جعل خليط التفاعل 50 ميكرولتر بإضافة؛ 5 ميكرولتر من عزلة P. المنجلية الحمض النووي الجيني، 5 ميكرولتر من 10X العازلة، 5μl من MgCl 2، 1.5 ميكرولتر من التمهيدي إلى الأمام، 1.5 ميكرولتر منالتمهيدي العكسي، 0.5 ميكرولتر من T7 البلمرة DNA و 31.5 ميكرولتر من درهم 2 O وإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في 94 درجة مئوية لمدة 8 دقائق لتمسخ، 50 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية للتمديد و 72 درجة مئوية لمدة 9 دقيقة لالصلب واستعادة الطبيعة لتضخيم الجينات هو مبين في الجدول 1.
  9. المنتجات PCR منفصلتين في 1٪ agarose هلام (1 غرام من الاغاروز و 100 مل من تريس اسيتات EDTA (تاي) عازلة) 32.
  10. قطع العصابات DNA PCR تضخيمها من هلام الاغاروز، وضع شرائح هلام تحتوي على الحمض النووي DNA في هلام العمود استخراج تدور وتجميد في -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى شرائح هلام المجمدة وأجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 5 دقائق.
  11. قياس التدفق المائي من خلال تصفيتها في أنبوب جمع من الخطوة 2.5، باستخدام micropipette ونقل إلى أنبوب جديد. إضافة 0.1 المجلد من 5 M خلات الصوديوم وأجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وإضافة 10 ميكرولتر من 2 O درهم إلى thالبريد DNA بيليه.
  12. هضم pT7CFE1-CHIS ناقلات التعبير وشظايا الحمض النووي النقي (من 2.6) في أنبوبين منفصلة عن طريق إضافة 3 ميكرولتر من البلازميد و 5 ميكرولتر من المنتجات الجينات PCR إلى كل أنبوب. إضافة إلى كل أنبوب، 1 ميكرولتر من الانزيمات قيود محددة، 2 ميكرولتر من رد فعل العازلة و 14 ميكرولتر من 2 درهم O.
  13. إضافة 3 ميكرولتر من البلازميد هضمها، 5 ميكرولتر من شظايا الحمض النووي هضم، 2 ميكرولتر من 10X العازلة يغاز، 1 ميكرولتر من يغاز و 9 ميكرولتر من درهم 2 O في أنبوب microcentrifuge. احتضان عند 12 ° CO / N.
  14. إضافة 0.1 المجلد من 3 خلات الصوديوم M في درجة الحموضة 5.5 و 2 مجلدات من الإيثانول (إذا كان لديك حجم أنابيب ربط 20 ميكرولتر إضافة 2 ميكرولتر من 3 خلات الصوديوم M + 44 ميكرولتر من الإيثانول) لأنبوب من الخطوة 2.14. تخلط جيدا واحتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  15. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة. إزالة بعناية طاف باستخدام ماصة صغيرة من دون إزعاج بيليه.
  16. إضافة 100 ميكرولتر من الايثانول 70٪ رس بيليه من الخطوة 2.10. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 14000 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص من طاف. إضافة 10 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه لبيليه DNA.

3. التعبير عن طريق البروتين في المختبر خلية بشرية نظام حرية التعبير

  1. إعداد 20 ميكرولتر من خليط النسخ عن طريق قياس 2 ميكرولتر من المؤتلف pT7CFE1-CHIS DNA البلازميد، 4 ميكرولتر من العازلة 5X النسخ، 4 ميكرولتر من NTP المزيج، 2 ميكرولتر من T7 RNA البلمرة و 8 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه لمدة 2-خطوة البشرية في المختبر التعبير البروتين باستخدام قوالب DNA. خلط المكونات في أنبوب microcentrifuge واحتضان لمدة 75 دقيقة في 30 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. تأخذ 2 ميكرولتر من خليط النسخ وإضافته إلى 23 ميكرولتر من خليط الترجمة التي تحتوي 12.5 ميكرولتر من المحللة الخلية هيلا، 2.5 ميكرولتر من البروتينات الإكسسوارات، 1 ميكرولتر من محلول الملح A، 0.5 ميكرولتر من الأحماض الأمينية -Met، 0.5 ميكرولتر من الأحماض الأمينية -Leu، 181؛ ل من ريبونوكلياز المانع، 1.25 ميكرولتر من مزيج الطاقة و 3.75 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه.
  3. احتضان الخليط الترجمة من الخطوة 3.2 عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. متجر المنتجات ترجم عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  4. إعداد 25 ميكرولتر من النسخ وخليط الترجمة عن طريق إضافة 3 ميكرولتر من المؤتلف pT7CFE1-CHIS DNA البلازميد، 2 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه، 5 ميكرولتر من مزيج رد فعل، 12.5 ميكرولتر من هيلا المحللة و 2.5 ميكرولتر من البروتينات ملحق ل1-خطوة البشري إلى جانب التعبير البروتين IVT لقوالب DNA.
  5. احتضان خليط التفاعل من الخطوة 3.4 لمدة 90 دقيقة إلى 6 ساعات في 30 ° C. تخزين المنتجات الترجمة في -20 ° C.

4. تنقية أعربت عن البروتينات المؤتلف

  1. إضافة 75 ميكرولتر من 1X العازلة تنقية 25 ميكرولتر من الناتج ترجمة لجعل 100 ميكرولتر من خليط تنقية.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من الراتنج النيكل مخلبية إلى 100 ميكرولتر من mixt تنقيةلدى عودتهم. غسل ني الراتنج مرتين بإضافة 300 ميكرولتر من درهم 2 O و 300 ميكرولتر من العازلة ملزمة. إعادة تعليق الراتنج وأجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة الايثانول الزائد.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من خليط تنقية من الخطوة 4،2 حتي 100 ميكرولتر من النيكل راتنج خالب واحتضان الخليط لمدة 60 دقيقة في RT.
  4. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة وجمع طاف في أنبوب جديد وصفت بانها "تدفق من خلال".
  5. غسل الراتنج مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة 1X (20 ملي إميدازول 250 ملي ناه 2 PO 4 في الرقم الهيدروجيني 8، 2.5 M كلوريد الصوديوم ودرهم 2 O). أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة وجمع طاف في أنبوب جديد يسمى "غسل". كرر الخطوة 4.5 ضعف.
  6. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة 1X شطف (100 ملي إيميدازول، 250 ملي نا 2 PO 4 في الرقم الهيدروجيني 8.0، 2.5M كلوريد الصوديوم ودرهم 2 O) إلى الراتنج واحتضان لمدة 15 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة. هل الخطوة شطف مرتين. كلالوقت جمع طاف في أنابيب microcentrifuge الطازجة والتسمية باسم "شطافة".
  7. بعد شطف وغسل الراتنج مرتين كما هو موضح في الخطوة 4.5. متجر تتدفق من خلال، ويغسل والعينات شطف في -20 درجة مئوية أو أقل. يجب أن يتم تخزين الراتنج في 4 ° C. استخدام 30 ميكرولتر من كل عينة لSDS-PAGE وتحليل immunoblotting.

5. Coomassie (برادفورد) فحص البروتين 34

  1. إعداد معيار ألبومين المصل البقري (BSA) حلول مع تركيز 20 ميكروغرام / مل (خلط 10 ميكرولتر من BSA (2 ملغ / مل) و 90 ميكرولتر من درهم 2 O)، 40 ميكروغرام / مل (مزيج 20 ميكرولتر من BSA (2 ملغ / مل) و 80 ميكرولتر من درهم 2 O)، 60 ميكروغرام / مل (مزيج 30 ميكرولتر من BSA (2 ملغ / مل) و 70 ميكرولتر من درهم 2 O)، و 80 ميكروغرام / مل (مزيج 40 ميكرولتر من BSA (2 ملغ / مل) و 60 ميكرولتر من درهم 2 O)، و 100 ميكروغرام / مل (مزيج 50 ميكرولتر من BSA (2 ملغ / مل) و 50 ميكرولتر من درهم 2 O)، 160 ميكروغرام / مل (مزيج 80 ميكرولتر من BSA (2 ملغ / مل) و 20 ميكرولتر من درهم2 O) و 200 ميكروغرام / مل (100 ميكرولتر من BSA (2 ملغ / مل).
  2. قياس 5 ميكرولتر من التدفق من خلال، ويغسل وعينات شطافة من الخطوة 4.7. إضافة 95 ميكرولتر من 2 درهم O.
  3. إضافة 5 مل من كاشف Coomassie الأزرق لخليط من الخطوات 5.1 و 5.2. تغطية الأنابيب مع parafilm ودوامة لمدة 10 ثانية ثم احتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
  4. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، وقياس الكثافة الضوئية (OD) في الطول الموجي 650 نانومتر لأنابيب البروتين من الخطوة 5.3. تركيز مؤامرة مقابل القراءة OD لتحديد تركيزات البروتين 34.

6. الغربية التنشيف

  1. إضافة 5 ميكرولتر من مقتطفات المتقسمة من P. المنجلية، أعربت 2 ميكرولتر من القولونية المؤتلف Rhop-3 البروتينات 31، أعرب 5 ميكرولتر من البروتينات المؤتلف باستخدام 2-خطوة و1-خطوة في نظم التعبير الإنسان المختبر و 10 ميكرولتر من منتجات البروتين النقي باستخدام طريقة تقارب لفصل الأنابيب.
  2. إضافة الكهربائي عينة العازلة التي تحتوي على المركابتويثانول إلى كل أنبوب لالحجم النهائي من 20 ميكرولتر لجعل عينات البروتين solubilized. يغلي أنابيب لمدة 2 دقيقة.
  3. تحميل عينات البروتين solubilized على 10٪ والمواد الهلامية SDS-PAGE لفصل البروتينات.
  4. نقل البروتينات فصلها عن المواد الهلامية SDS-PAGE لنتروسليلوز رقة (NCP) من خلال electrophoresing في 35 مللي أمبير التيار في هلام في غرفة النشاف الغربية شبه الجافة لمدة 2 ساعة.
  5. كتلة نقاط الاتصال الوطنية التالية نقل مع 2٪ الحليب الخالي.
  6. احتضان منعت نقاط الاتصال الوطنية مع الأجسام المضادة بعد المخفف 1: 100 في حليب 2٪ لأداء الغربية النشاف. أرنب الضد # 676 21 محدد لP. rhoptries أقسومة المنجلية، والأجسام المضادة الماوس 20 محددة لP. yoelii وP. berghei rhoptries أقسومة، أمصال مضادة رقم 685 تحديدا للP. المنجلية البروتين فجوة parasitophorous، SERA (سيرين مستضد الغنية) 22 والأجسام المضادة محدد لمورير217؛ ق المشقوق البروتين PfMC-2TM 28.
  7. احتضان نقاط الاتصال الوطنية كما في 1: 100 فأر وأرنب المصل وطاف الثقافة أمضى (SCS) من خلايا المايلوما SP2 ضوابط السلبية بشكل طبيعي المخفف.
  8. احتضان نقاط الاتصال الوطنية مع الأجسام المضادة والضوابط في 4 درجة مئوية O / N.
  9. غسل نقاط الاتصال الوطنية 4X مع وصمة عار العازلة واحتضان نقاط الاتصال الوطنية مع أنواع الأجسام المضادة الثانوية مترافق محددة لالفجل البيروكسيديز (HRP) المخفف 1: 1000 في حليب 2٪.
  10. غسل نقاط الاتصال الوطنية 4X العازلة مع وصمة عار. احتضان غسلها نقاط الاتصال الوطنية مع حل تنمية اللون A + B (الحل A: إضافة 50ML من 1X وصمة عار العازلة و 30 ميكرولتر من H 2 O 2، B الحل: إضافة 10 مل من الميثانول و 30 ملغ من 3 كلورو-نفتول) لمدة 30 دقيقة في الظلام. تحليل النتائج لطخة غربية colorimetrically.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصادقة على البروتينات المؤتلف التعبير عنها من خلال التفاعل مع الأجسام المضادة المحددة هي خطوة أولى مهمة في تأكيد للطي السليم من البروتينات التي أعرب عنها. وأعرب عن البروتينات ملاريا المؤتلف باستخدام خطوة واحدة واثنين من خطوة في النظم حرية التعبير الخلية البشرية في المختبر. البروتينات المؤتلف هي المنقى طريقة تقارب ني مخلبية. ثم استخدمنا أمصال مضادة ضد rhoptries أقسومة كلها في النشاف الغربي من SDS-PAGE فصل البروتينات المؤتلف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الهامة للتعبير ناجحا للبروتينات باستخدام اثنين من خطوة في المختبر الخلية البشرية نظام حرية التعبير وتنقية هي: 1) التضخيم ناجحة واستنساخ الجينات إلى pT7CFE-CHIS البلازميد النواقل؛ 2) تدوين الحمض النووي الريبي في 30 درجة مئوية. 3) ترجمة البروتين عند 30 درجة مئوية في وجود ريبونوكلياز المانع؛ 4) تطوير تقارب القائمة على البروتوكول تنقية باستخدام الخرز الراتنج المغلفة مع النيكل و5) تحليل النتائج على لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة و. الخطوات الهامة ل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا أي مصالح مالية متنافسة في هذه الدراسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل صناديق تطوير أعضاء هيئة التدريس بجامعة ولاية كليفلاند.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-خطوة in vitro< / em> نظام التعبير الحر للخلايا البشريةThermo Fisher88856توقف. قم دائما بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية. لا تذوب في الماء الدافئ
خطوة واحدة in vitro < / em> نظام الترجمة المقترنThermo fischer88860يخزن دائما في -80 درجة مئوية. لا تذوب في الماء الدافئ
نظام تنقية ProBondInvitrogenK850-01قم بتخزينه في RT
Probond Nickel-Chelating ResinInvitrogenR801-01Store في 4oC.
بنكبين الولايات للدم البشري A +عند 4 درجات مئوية.
مخزن الدم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alexandrov, K., et al. Leishmania. cell-free expression system. Methods. 55 (1), 58-64 (2011).
  2. Alexandrov, K., et al. Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system. PLOS One. 5 (12), e14388(2010).
  3. Baca, A. M., Hol, W. G. J. Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
  4. Birkholtz, L. M., et al. Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation. Malar. J. 7, 197(2008).
  5. Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays. Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).
  6. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).
  7. Fernández-Robledo, J. A., Vasta, G. R. Production of recombinant proteins from protozoan parasites. Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).
  8. Gowda, D. C., Davidson, E. A. Protein glycosylation in the malaria parasite. Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).
  9. Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).
  10. Hinnebusch, A. Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.W. 185-243 (2000).
  11. Hino, M., et al. Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes. Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).
  12. Le Roch, K. G., et al. Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle. Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).
  13. Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).
  14. Mehlin, C., et al. Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).
  15. Mikami, S., et al. A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins. Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).
  16. Sam-Yellowe, T. Y., et al. Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites. Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).
  17. Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. Plasmodium falciparum. protein located in Maurer’s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes. Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).
  18. Sam-Yellowe, T. Y., et al. A Plasmodium. gene family encoding Maurer’s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling. Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).
  19. Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria. Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).
  20. Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies. Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).
  21. Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries. J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).
  22. Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA. J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).
  23. Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes. J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).
  24. Sundaresh, S., et al. Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques. Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).
  25. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  26. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193 (4254), 673-675 (1976).
  27. Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer’s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer’s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network. Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).
  28. Tsuboi, T., et al. Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates. Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).
  29. Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite. Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).
  30. Wang, J., et al. A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins. Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).
  31. Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. Rhop-3 protein conservation among Plasmodium. species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).
  32. Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins. Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).
  33. Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells. Intech. , (2012).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

HeLa Cell Free ExpressionPlasmodium Protein ExpressionIn Vitro TranslationOne Step Expression SystemTwo Step Expression SystemAffinity Purification MethodWestern Blotting AnalysisBradford AssayMicrovolume Protein PurificationRecombinant Plasmid Preparation

Related Articles