مقالة منهجية

عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان في المختبر

DOI:

10.3791/52779

⸱

يونيو 18, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم فحوصات عالية الإنتاجية توفر مجتمعة أدوات ممتازة لقياس إطلاق NET من العدلات البشرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> الخلايا الحبيبية العدلات هي أكثر الكريات البيض وفرة في دم الإنسان. العدلات هي أول من يصل إلى موقع الإصابة. طورت العدلات العديد من الآليات المضادة للميكروبات بما في ذلك البلعمة وتحلل وتشكيل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs). تتكون NETs من سقالة الحمض النووي المزينة بالهيستونات والعديد من علامات الحبيبات بما في ذلك مايلوبيروكسيداز (MPO) والإيلاستاز العدلات البشرية (HNE). إطلاق NET هو عملية نشطة تنطوي على تغييرات مورفولوجية مميزة للعدلات تؤدي إلى طرد الحمض النووي الخاص بها في الفضاء خارج الخلية. تعتبر NETs ضرورية لمحاربة الميكروبات ، ولكن الإطلاق غير المنضبط ل NETs ارتبط بالعديد من الاضطرابات. لمعرفة المزيد حول الأهمية السريرية وآلية تكوين NET ، هناك حاجة إلى أدوات موثوقة قادرة على تحديد كمية NET.

هنا يتم تقديم ثلاث طرق يمكنها تقييم إطلاق NET من العدلات البشرية في المختبر. الأول هو اختبار عالي الإنتاجية لقياس إطلاق الحمض النووي خارج الخلية من العدلات البشرية باستخدام صبغة غير منفذة للحمض النووي غير منفذة للغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف طريقتين أخريين قادرتين على تحديد تكوين NET عن طريق قياس مستويات مجمعات MPO-DNA و HNE-DNA الخاصة ب NET. توفر هذه الطرق القائمة على الصفيحة الدقيقة مجتمعة أدوات رائعة لدراسة آلية وتنظيم تكوين NET للعدلات البشرية بكفاءة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NET هو آلية جديدة تحارب من خلالها العدلات مسببات الأمراض. 1 جوهر NETs هو الحمض النووي النووي. 1 ترتبط شبكة الحمض النووي هذه ببروتينات حبيبات العدلات والهيستونات. 1 يتطلب الشكل الرئيسي لتكوين NET موت العدلات التي تتميز بإزالة تكثيف الكروماتين ، واختفاء الأغشية الحبيبية والنووية ، ونقل العدلات الإيلاستاز إلى النواة ، وإزالة الهيستونات ، وأخيرا انسكاب NETs القائمة على الحمض النووي. 2 تحبس NETs وتقتل مجموعة متنوعة من الميكروبات وهي جزء أساسي من ذخيرة الأسلحة المناعية الفطرية. ومع ذلك ، فقد تم ربط تكوين NET غير المنضبط بالعديد من الأمراض الالتهابية الذاتية. 3،4 على الرغم من أهميتها الراسخة بشكل متزايد ، لا يعرف سوى القليل عن آلية وتنظيم إطلاق NET.

تختلف العدلات التي تموت عن طريق إطلاق NETs عن العدلات المبرمجة أو النخرية. 3,5 تظهر العدلات التي تطلق NET العديد من الميزات المميزة لتكوين NET. ترتبط مكونات الحبيبات بالحمض النووي في NETs. 1 تم العثور على كل من مايلوبيروكسيداز (MPO) والإيلاستاز العدلات البشرية (HNE) في الحبيبات الأولية في الخلايا المريحة ولكن يتم نقلهما إلى النواة للارتباط بالحمض النووي في NETs. 1 مجمعات MPO-DNA و HNE-DNA خاصة ب NETs ، ولا تحدث في العدلات موت الخلايا المبرمج أو النخرية. 1،3،5 إزالة التكثيف من الكروماتين هي ميزة أخرى نموذجية ل NETosis. 2 يتطلب إطلاق NET أيضا تروسين الهستونات بواسطة الببتيديل أمينيداز 4 (PAD4). 6 الهستونات السترولينيتين هي السمات المميزة للعدلات التي خضعت لإطلاق NET. 6

هنا يتم تقديم ثلاث طرق توفر معا أدوات ممتازة لقياس NETs على نطاق إنتاجية عالية. تم استخدام الاختبار الأول في الميدان مع تغييرات مختلفة ويحدد كمية إطلاق الحمض النووي خارج الخلية بتنسيق صفيحة دقيقة. توفر المقايسات الثانية والثالثة تأكيدا على NETs عن طريق قياس مجمعات MPO-DNA و HNE-DNA الخاصة ب NET.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافق مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة جورجيا دراسة موضوع الإنسان لجمع الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء (أوغ # 2012-10769-06). وقعت 5،7،8 متطوعي شكل الموافقة المسبقة المطلوبة قبل سحب الدم. البحث المنجز في هذه المقالة هو في الامتثال للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للبحوث الطبية التي تجرى على البشر من إعلان هلسنكي.

1. عزل العدلات من الدم المحيطي الإنسان (الشكل 1)

ملاحظة: هناك عدة طرق لعزل العدلات من الدم المحيطي. وينص البروتوكول التالية احتمال واحد. هذا البروتوكول ينتج أعدادا كبيرة من العدلات غير المفعلة البشرية القادرة على إطلاق المستجدة على التحفيز الخارجي. استخدام 40 مل من الدم الكامل تم الحصول عليها من المتطوعين الأصحاء بواسطة بزل الوريد. 7،9

  1. قسامة 20 مل من الدم الى اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل. إضافة 10 مل 6٪ ديكستران. المزيج بلطف.
  2. بعد 20 دقيقة من نقل الكريات البيض-ريكح المرحلة العليا من دون أخذ أي خلايا الدم الحمراء مكعبات في نظيفة أنابيب مخروطية 50 مل، وملء مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج 10 دقيقة. Resuspend بيليه في 4 مل العقيمة برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد 5 خطوات Percoll التدرج من 85٪ -80٪ ​​-75٪ -70٪ -65٪ في غضون 15 مل أنابيب مخروطية وطبقة 2 مل تعليق الكريات البيض على رأس كل منهما التدرج.
  5. الطرد المركزي 800 x ج لمدة 30 دقيقة مع الفرامل خارج.
  6. جمع كل الخلايا (العدلات) في الطبقات في 75٪ / 80٪ و 70٪ واجهة / 75٪.
  7. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني (350 x ج، 10 دقيقة، RT) وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.

2. قياس حركية خارج الخلية DNA الإصدار باستخدام صفيحة مقياس التألق

ملاحظة: هذه الطريقة يمكن قياس التغيرات في مضان من غشاء كتيمة صبغ يدل على الافراج عن الحمض النووي على شكل صفيحة 96-جيدا ملزم الحمض النووي (الشكل 2).

  1. إعداد تعليق العدلات في المتوسط ​​فحص (HBSS +1٪ (ت / ت) ذاتي المصل + 5 الجلوكوز ملم) بتركيز 2 × 10 6 خلية / مل.
  2. إضافة 5 مكرومول / L للغشاء كتيمة صبغ الحمض النووي ملزم. المزيج بلطف.
  3. العدلات الإنسان قسامة (50 ميكرولتر / جيد) على 96-جيدا الأسود، أسفل شفافة microplates. تأكد من وسيلة فحص يغطي الجزء السفلي بأكمله من البئر. إن لم يكن، اضغط على لوحة بلطف على الجانب.
  4. الاحماء لوحة تحتوي العدلات لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. في هذه الأثناء إعداد الحلول من المحفزات في ضعف تركيزات النهائية لاستخدامها (في 37 ° C فحص الحار المتوسطة). كما تستخدم عنصر تحكم NET إيجابية العدلات الإنسان مع 100 نيوتن متر phorbol-ميريستيت خلات (سلطة النقد الفلسطينية) لمدة 4 ساعة لإطلاق سراح القصوى NET. 5،8 سلطة النقد الفلسطينية التحفيز لمدة 4 ساعة يضمن أقصى الإفراج NET في حين لا تزال عفوية تشكيل NET انخفاض 5،8.
  6. إعداد مقياس التألق صفيحة لقياس (4 ساعات، 37 درجة مئوية، 530 نانومتر لإثارة و 590 نانومتر للانبعاثات).
  7. تحفيز العدلات بإضافة 50 ميكرولتر حل حافزا ل50 تعليق العدلة ميكرولتر. استخدام 0.5 ميكروغرام / مل سابونين في بئر واحدة لقياس القصوى إشارة إطلاق الحمض النووي.
  8. وضع لوحة في القارئ وقياس التغيرات في مضان لمدة 4 ساعة في كل دقيقة 2 مع أي اهتزاز.
  9. لتحليل البيانات، وحساب الزيادات طبيعية في مضان مع مرور الوقت.
    1. مضان خط الأساس طرح من القيم نقطة النهاية لجميع الآبار بما في ذلك سابونين (الشكل 2A، B). وينبغي أن يكون الارتفاع في مضان سابونين أعلى إشارة. يشار إليها باسم "الافراج عن الحمض النووي القصوى" (الشكل 2A).
    2. حساب النسب المئوية لإطلاق الحمض النووي في العينات المجهولة بقسمة زيادات في مضان من العينات المجهولة من قبل الافراج عن الحمض النووي القصوى.
    3. النتائج متوسط ​​مكررات وتمثل هذه الاتهامات بأنها "٪ من إطلاق الحمض النووي القصوى" (الشكل 2C).

3. الكميات من نموذج NETأوجه من الخطة الرئيسية للعمليات الحمض النووي والحمض النووي HNE-ELISA فحوصات

ملاحظة: هذه المقايسات المعدلة (MPO-DNA) أو المنشأة (HNE-DNA) في المختبر لدينا quantitate تشكيل NET عن طريق قياس مستويات MPO-DNA والمجمعات HNE-DNA 5.

  1. معطف 96-جيدا قدرة لوحات ELISA بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة القبض على (50 ميكرولتر / جيد) ملزمة عالية: مكافحة MPO (1: 2000 تمييع) أو مكافحة HNE (1: 2000).
  2. لوحات غسل ELISA ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيد) ومنعها مع 5٪ BSA و 0.1٪ ألبومين المصل البشري لمدة 2 ساعة على RT (200 ميكرولتر / جيد). يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  3. العدلات البذور على 96-جيدا microplates في مناطق ذات كثافة من 100000 خلية / جيدا في 100 متوسطة ميكرولتر الفحص، وتحفيز تشكيل NET. احتضان الخلايا: 4 ساعات لمدة 37 درجة مئوية.
  4. إجراء عملية الهضم الدناز محدود بإضافة 2 U / الدناز ميليلتر supernatants العدلة، مزجها جيدا. الاحتفاظ بها في RT.
  5. وقف الدناز بعد 15 دقيقة وذلك بإضافة 11 ميكرولتر 25 ملي EGTA (تركيز النهائي 2.5 ملم). اخلط جيدا. جمع سوpernatants في أنابيب microfuge نظيفة. عينات تدور لتخلص من حطام خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نقل supernatants بهم في أنابيب microfuge نظيفة. الاحتفاظ بها على الجليد حتى جاهزة.
  6. استخدام قسامة من معدة مسبقا "المعيار NET".
    ملاحظة: المعايير NET هي مزيج من supernatants هضم الدناز العدلات حفز سلطة النقد الفلسطينية، تم الحصول عليها من لا يقل عن 5 مختلف الجهات المانحة الإنسان ومستقلة.
    1. لاستخدام نفس المعايير لفترة طويلة، وجمع وقسامة كمية كبيرة من supernatants العدلة من كل جهة مانحة فردية. وجمع على سبيل المثال 2 مل من supernatants هضم الدناز العدلات حفز سلطة النقد الفلسطينية، يؤدي في 200 قسامات (10 ميكرولتر لكل منهما) ما يكفي ل 200 لوحات ELISA. تم العثور على البيانات التي تميز مستوى NET في الشكل (5).
    2. تحفيز العدلات الإنسان مع 100 نيوتن متر سلطة النقد الفلسطينية لمدة 4 ساعة وتطبيق الدناز هضم لsupernatants وفقا خطوات 3،4-3،5.
    3. جمع وحمام سباحة، قسامة (10 ميكرولتر) ومجاناsupernatants زي (-20 درجة مئوية) العدلات.
    4. لإعداد "NET-المعيار"، ذوبان قسامة واحد / المانحة تم الحصول عليها من لا يقل عن خمسة المانحين منفصلة، ​​مزجها والاحتفاظ بها على الجليد.
    5. تجاهل عينات إذابة واستخدام الطازجة للتجربة القادمة.
    6. إعداد 1: التخفيف المتسلسل 2 للمستوى NET في برنامج تلفزيوني + EGTA.
  7. تمييع عينات هضمها DNase1 (معيار وsupernatants غير معروف) 20 ضعفا في برنامج تلفزيوني + EGTA وقسامة لهم على لوحات ELISA المغلفة مع الأجسام المضادة القبض عليه.
  8. احتضان لوحات ELISA أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية، وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  9. تطبيق حل الكشف عن الأجسام المضادة (100 ميكرولتر / جيد): الحصان الفجل البيروكسيداز مترافق الأجسام المضادة لمكافحة الحمض النووي (1: 500، والماوس). احتضان لمدة 1 ساعة في الظلام.
  10. بعد أربعة يغسل مع برنامج تلفزيوني إضافة تمب البيروكسيديز الركيزة: 100 ميكرولتر / جيد و 30 دقيقة. تلوين الأزرق هو مؤشر للنشاط البيروكسيديز (المستجدة الحالية).
  11. وقف رد الفعل من خلال إضافة 100 ميكرولتر / جيد 1 M حمض الهيدروكلوريك. السوف حلول الزرقاء تتحول الصفراء (الشكل 5A).
  12. قراءة الامتصاصية في 450 نانومتر باستخدام مضواء صفيحة.
  13. لتحليل البيانات، وحساب كمية MPO-DNA أو المجمعات HNE-DNA بالمقارنة مع مستوى NET.
    1. طرح الخلفية قيمة الكثافة الضوئية للوسط الفحص من جميع العينات.
    2. رسم القيم الامتصاصية (المحور السيني) من العينات القياسية مخففة ضد محتواها النسبي NET (Y-محور) (الشكل 5A).
    3. باستخدام مجموعة nonsaturated من هذا المنحنى القياسي إنشاء خط الاتجاه (استخدم تناسب أفضل الهائل من البرامج المستخدمة) (الشكل 5A). معادلة هذا الخط يحدد تحويل القيم OD من الكمية مبالغ المستجدة.
    4. إدراج القيم OD قياس من المجاهيل في المعادلة خط الاتجاه من 3.13.3 من شأنها أن تعطي كمية المستجدة في عينة مجهولة كنسبة مئوية من المعايير NET (الشكل 5A).
    5. حسابمتوسطات مكررات (يثلث) وتقديم البيانات النهائية بأنها "كمية MPO-DNA أو المجمعات HNE الحمض النووي (٪ من المعيار)" (الشكل 5C).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأرقام في هذه المخطوطة تصف طريقة العزلة العدلة والإجراءات التجريبية، ونتائج ممثل الحالية مع شرح لتحليل البيانات. يبين الشكل 1 في خطوات متتابعة من إعداد العدلات البشري. ويمثل هذا البروتوكول واحد فقط طريقة ممكنة من العزلة العدلة. انه يعطي كميات كبيرة من الراحة العدلات قادرة على إطلاق المستجدة على التحفيز. ويوضح الشكل 2 كيف يعمل الافراج عن الحمض النووي فحص القائم على مضان. باستخدام مضان حركية قارئ صفيحة الإفراج الحمض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل المستجدة آلية جديدة رائعة التي العدلات قتل مسببات الأمراض. 1 على الرغم من أن الأدب والمستجدة تم التوسع بشكل مستمر على مدى السنوات العشر الماضية منذ اكتشافهم، عدة أسئلة هامة تتعلق دورها في علم الأحياء، وآلية وتنظيم لا تزال غير واضحة. المنهجية المناسبة لابد من وضعها لقياس المستجدة، فإن هذه الآلية المضادة للميكروبات فريدة جدا. توضح هذه المقالة الطرق التي يمكن استخدامها ل quantitate المستجدة بطريقة إنتاجية عالية. الفحص الأول يتبع حركية مضان صبغة الحمض النووي ملزم غشاء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شكر خاص لموظفي مختبر المركز الصحي بجامعة جورجيا لدعمهم المستمر لعملنا في عزل العدلات البشرية. تم دعم هذا العمل من خلال صندوق بدء تشغيل الدكتور ردا المقدم من مكتب نائب الرئيس للأبحاث في UGA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
العدلات المضادة للإنسان Elastase  أرنب Ab كالبيوكيم4810011: 2،000x المغلفة
المضادة للمايلوبيروكسيداز أب (أرنب)ميليبور07-4961: 2،000x المغلفة
DNase-1روش10-104-159-0011 &# 181 ؛ جم / مل يستخدم للهضم
20 ملي متر EGTA / PBSسيجما ألدريتشE3889-25G
2.5 ملي متر EGTA / PBSسيجما-ألدريتشE3889-25G
كشف موت الخلايا ELISA المضاد للحمض النووي PODRoche115446750011: 500x & nbsp ؛
مقياس الطيف الضوئي Eon MicroplateBiotek
Gen5 الكل في واحد برنامج الصفيحةالدقيقة أداة Biotekالتحليلية (ELISA)
Sytox orangeLife TechnologyS113680.2٪ التركيز النهائي /
الحجم 1 M HepesCellgro25-060-Clاستخدم التركيز النهائي 10 مليمتر.
1 م جلوكوزسيجمااستخدم التركيز النهائي 5 مليمتر.
HBSSCorning21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3Thermoscientific
PMASigmaP 8139100 nM النهائي المستخدم
ELISA PlateGreiner bio-one655061
أنابيب مخروطية 15 ملعلمي الحرارة339650
أنابيب مخروطية 50 مل339652علمي الحرارة
بيركول (درجة الحموضة 8.5-9.5) سيجماP 1644كلوريد الصوديوم ، سيجما ، S7653-250G
DexterrnSpectrumD1004
RPMI 1640 وسائل الإعلامCorning Cellgro17-105-CV
96 لوحة فحص البئر لوحة سوداء قاع واضحCostar3603

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  2. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
  4. Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).
  5. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
  6. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
  7. Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
  8. Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
  9. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
  10. Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205(2013).
  11. Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
  12. Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
  13. Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
  14. Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MPO DNA ELISA HNE DNA ELISA SYTOX Orange Percoll

مقالات ذات صلة