يتم تقديم فحوصات عالية الإنتاجية توفر مجتمعة أدوات ممتازة لقياس إطلاق NET من العدلات البشرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
< p class = 'jove_content'> الخلايا الحبيبية العدلات هي أكثر الكريات البيض وفرة في دم الإنسان. العدلات هي أول من يصل إلى موقع الإصابة. طورت العدلات العديد من الآليات المضادة للميكروبات بما في ذلك البلعمة وتحلل وتشكيل مصائد العدلات خارج الخلية (NETs). تتكون NETs من سقالة الحمض النووي المزينة بالهيستونات والعديد من علامات الحبيبات بما في ذلك مايلوبيروكسيداز (MPO) والإيلاستاز العدلات البشرية (HNE). إطلاق NET هو عملية نشطة تنطوي على تغييرات مورفولوجية مميزة للعدلات تؤدي إلى طرد الحمض النووي الخاص بها في الفضاء خارج الخلية. تعتبر NETs ضرورية لمحاربة الميكروبات ، ولكن الإطلاق غير المنضبط ل NETs ارتبط بالعديد من الاضطرابات. لمعرفة المزيد حول الأهمية السريرية وآلية تكوين NET ، هناك حاجة إلى أدوات موثوقة قادرة على تحديد كمية NET.
هنا يتم تقديم ثلاث طرق يمكنها تقييم إطلاق NET من العدلات البشرية في المختبر. الأول هو اختبار عالي الإنتاجية لقياس إطلاق الحمض النووي خارج الخلية من العدلات البشرية باستخدام صبغة غير منفذة للحمض النووي غير منفذة للغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف طريقتين أخريين قادرتين على تحديد تكوين NET عن طريق قياس مستويات مجمعات MPO-DNA و HNE-DNA الخاصة ب NET. توفر هذه الطرق القائمة على الصفيحة الدقيقة مجتمعة أدوات رائعة لدراسة آلية وتنظيم تكوين NET للعدلات البشرية بكفاءة.
المقدمة
NET هو آلية جديدة تحارب من خلالها العدلات مسببات الأمراض. 1 جوهر NETs هو الحمض النووي النووي. 1 ترتبط شبكة الحمض النووي هذه ببروتينات حبيبات العدلات والهيستونات. 1 يتطلب الشكل الرئيسي لتكوين NET موت العدلات التي تتميز بإزالة تكثيف الكروماتين ، واختفاء الأغشية الحبيبية والنووية ، ونقل العدلات الإيلاستاز إلى النواة ، وإزالة الهيستونات ، وأخيرا انسكاب NETs القائمة على الحمض النووي. 2 تحبس NETs وتقتل مجموعة متنوعة من الميكروبات وهي جزء أساسي من ذخيرة الأسلحة المناعية الفطرية. ومع ذلك ، فقد تم ربط تكوين NET غير المنضبط بالعديد من الأمراض الالتهابية الذاتية. 3،4 على الرغم من أهميتها الراسخة بشكل متزايد ، لا يعرف سوى ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافق مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة جورجيا دراسة موضوع الإنسان لجمع الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء (أوغ # 2012-10769-06). وقعت 5،7،8 متطوعي شكل الموافقة المسبقة المطلوبة قبل سحب الدم. البحث المنجز في هذه المقالة هو في الامتثال للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للبحوث الطبية التي تجرى على البشر من إعلان هلسنكي.
1. عزل العدلات من الدم المحيطي الإنسان (الشكل 1)
ملاحظة: هناك عدة طرق لعزل العدلات من الدم المحيطي. وينص البروتوكول التالية احتمال واحد. هذا البروتوكول ينتج أعدادا كبيرة من العدلات غير المفعلة البشرية القادرة على إطلاق ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الأرقام في هذه المخطوطة تصف طريقة العزلة العدلة والإجراءات التجريبية، ونتائج ممثل الحالية مع شرح لتحليل البيانات. يبين الشكل 1 في خطوات متتابعة من إعداد العدلات البشري. ويمثل هذا البروتوكول واحد فقط طريقة ممكنة من العزلة العدلة. انه يعطي كميات كبيرة من الراحة العدلات قادرة على إطلاق المستجدة على التحفيز. ويوضح الشكل 2 كيف يعمل الافراج عن الحمض النووي فحص القائم على مضان. باستخدام مضان حركية قارئ صفيحة الإفراج الحمض.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تمثل المستجدة آلية جديدة رائعة التي العدلات قتل مسببات الأمراض. 1 على الرغم من أن الأدب والمستجدة تم التوسع بشكل مستمر على مدى السنوات العشر الماضية منذ اكتشافهم، عدة أسئلة هامة تتعلق دورها في علم الأحياء، وآلية وتنظيم لا تزال غير واضحة. المنهجية المناسبة لابد من وضعها لقياس المستجدة، فإن هذه الآلية المضادة للميكروبات فريدة جدا. توضح هذه المقالة الطرق التي يمكن استخدامها ل quantitate المستجدة بطريقة إنتاجية عالية. الفحص الأول يتبع حركية مضان صبغة الحمض النووي ملزم غشاء .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
شكر خاص لموظفي مختبر المركز الصحي بجامعة جورجيا لدعمهم المستمر لعملنا في عزل العدلات البشرية. تم دعم هذا العمل من خلال صندوق بدء تشغيل الدكتور ردا المقدم من مكتب نائب الرئيس للأبحاث في UGA.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| العدلات المضادة للإنسان Elastase أرنب Ab | كالبيوكيم | 481001 | 1: 2،000x المغلفة |
| المضادة للمايلوبيروكسيداز أب (أرنب) | ميليبور | 07-496 | 1: 2،000x المغلفة |
| DNase-1 | روش | 10-104-159-001 | 1 &# 181 ؛ جم / مل يستخدم للهضم |
| 20 ملي متر EGTA / PBS | سيجما ألدريتش | E3889-25G | |
| 2.5 ملي متر EGTA / PBS | سيجما-ألدريتش | E3889-25G | |
| كشف موت الخلايا ELISA المضاد للحمض النووي POD | Roche | 11544675001 | 1: 500x & nbsp ؛ |
| مقياس الطيف الضوئي Eon Microplate | Biotek | ||
| Gen5 الكل في واحد برنامج الصفيحة | الدقيقة أداة Biotek | التحليلية (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2٪ التركيز النهائي / |
| الحجم 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | استخدم التركيز النهائي 10 مليمتر. |
| 1 م جلوكوز | سيجما | استخدم التركيز النهائي 5 مليمتر. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM النهائي المستخدم |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| أنابيب مخروطية 15 مل | علمي الحرارة | 339650 | |
| أنابيب مخروطية 50 مل | 339652 | علمي الحرارة | |
| بيركول (درجة الحموضة 8.5-9.5) | سيجما | P 1644 | كلوريد الصوديوم ، سيجما ، S7653-250G |
| Dexterrn | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 وسائل الإعلام | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 لوحة فحص البئر لوحة سوداء قاع واضح | Costar | 3603 |
المراجع
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
