RNA في الموقع (ISH) تصور الحمض النووي الريبي في الخلايا والأنسجة. نوضح هنا كيف يمكن استخدام مزيج من RNAscope ISH مع الكيمياء المناعية أو الأصباغ النسيجية بنجاح للكشف عن mRNAs الموضعية في المحاور في أقسام من أدمغة الفئران والإنسان.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة
في هذه المقالة
ملخص
يتيح تهجين
الملخص
في كثير من الأحيان يتم ترجمة من mRNAs إلى محاور الفقارية ومطلوب ترجمة المحلية لالاستطلاعية محور عصبي أو المتفرعة خلال تطوير وصيانة وإصلاح أو التنكس العصبي في فترات تال للنماء. وقد كشفت التحاليل إنتاجية عالية مؤخرا أن محاور لها Transcriptome على أكثر ديناميكية وتعقيدا مما كان متوقعا في السابق. هذه التحليلات، ومع ذلك تم القيام به في الغالب في الخلايا العصبية مثقف حيث المحاور يمكن عزلها من مقصورات somato شجيري. يكاد يكون من المستحيل لتحقيق مثل هذه العزلة في الأنسجة كلها في الجسم الحي. وبالتالي، من أجل التحقق من تجنيد من mRNAs وأهميتها الوظيفية في الحيوان كله، ينبغي من الناحية المثالية يمكن الجمع بين التحليلات Transcriptome على مع التقنيات التي تسمح تصور من mRNAs في الموقع. مؤخرا، تم تطوير تكنولوجيات جديدة ISH التي تكشف عن الرنا على مستوى واحد جزيء. هذا مهم بشكل خاص عند تحليل توطين التحت خلوية من مرنا، وعادة ما وجدت الرنا المترجمة منذ عند مستويات منخفضة. نحن هنا وصف بروتوكولين للكشف عن من mRNAs المترجمة axonally-باستخدام تكنولوجيا فائقة الحساسية RNA ISH الرواية. جمعنا بين RNAscope ISH مع مباين المحاور باستخدام المناعية مضان أو الأصباغ النسيجية للتحقق من تجنيد Atf4 مرنا إلى المحاور في الجسم الحي في الماوس ناضجة والعقول البشرية.
المقدمة
التوظيف مرنا محور عصبي والترجمة المحلية تمكن المحاور كي تستجيب للمثيرات خارج الخلية بطريقة زمنيا ومكانيا الحادة 1. وأفضل طريقة لفهم تخليق البروتين داخل محور عصبي في سياق النمو العصبي حيث أنه يلعب دورا حاسما في نمو السلوك مخروط 08/02، 11/09 ومحور عصبي الاستطلاعية إلى الوراء مما يشير إلى 12،13. ولكن أقل بكثير من المعروف عن أهمية وظيفية من تخليق البروتين في الخلايا العصبية محور عصبي بعد التنموية عندما يتم تخفيض مستويات مرنا والريبوسوم محور عصبي إلى حد كبير 14،15. منذ فترة طويلة كان يعتقد المحاور الفقارية ناضجة لتكون خاملة translationally 16. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن الترجمة المحلية وإ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي IACUC من جامعة كولومبيا والمبادئ التوجيهية المطبقة على رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتلت. ملاحظة: تحضير جميع المخازن المستخدمة في إجراءات ISH في الماء ريبونوكلياز خالية أو المعالجة DEPC. هذه التوصية ليست ضرورية تماما بعد انتهائه ISH لكن يقترح أن مخازن لا تزال على استعداد في الماء المقطر المزدوج تعقيمها و / أو تعقيمها من خلال تصفية.
1. الكشف عن Atf4 مرنا المترجمة إلى الكوليني محاور عصبية في الدماغ باستخدام الماوس الكبار الإسفار في الموقع التهجين (FISH) تلاه المناعية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد ملخص موجز للإجراءات المذكورة أعلاه في الشكل 1.
كشف الأمثل للAtf4 مرنا حبيبات في المحاور كوليني باستخدام الناجم عن الحرارة إماطة اللثام
عند تقييم توطين محور عصبي من mRNAs، فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على تحديد المحاور وأن تكون قادرة على تصور الرنا وفيرة منخفضة. التكنولوجيا RNA ISH الموصوفة هنا يمكن من اكتشاف الر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا التقرير وصفنا استخدام التكنولوجيا ISH عالية الدقة في الكشف عن مترجم axonally Atf4 مرنا. تظهر هذه والسابقة الدراسات المنشورة أن هذه التقنية متوافقة مع القائم على الأجسام المضادة الكشف عن البروتين في الأنسجة أو حتى الأجنة كلها 33. الأهم من ذلك أنها استخدمت مؤخرا للكشف عن قوس مرنا في التشعبات من الخلايا العصبية الحصين 34. ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع الأصباغ النسيجية لتلطيخ الأنسجة. أخيرا، وهي مناسبة للكشف في وقت واحد من الهدف متعد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل جمعية الزهايمر (NIRG-10-171721 ؛ إلى جامعة هامبشاير) ، والمعهد الوطني للصحة العقلية (MH096702 ؛ إلى جامعة هامبشاير) ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NS081333 ؛ إلى CMT) ، وجوائز الدراسة التجريبية من مركز أبحاث مرض الزهايمر الممول من المعهد الوطني للشيخوخة في جامعة كولومبيا (AG008702 ؛ إلى JB و YJ) الذي يدعم أيضا بنك الدماغ في نيويورك. نشكر أعضاء مختبر Hengst على التعليقات والمناقشات
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مسبار مخصص يستهدف بقايا 20-1،381 من الماوس Atf4< / i> mRNA (NM_009716) | مسبار | لتشخيص الخلايا | |
| المتقدم يستهدف المخلفات 15-1،256 من مسبار mRNA البشري ATF4< / i> (NM_001675.2) | الخلايا المتقدمة | ||
| مسبار | |||
| 310043 تشخيص الخلايا المتقدمة DapBمسبار التحكم الإيجابي الماوس Polr2A (اختياري) | الخلايا | المتقدم 312471 | مسبار |
| التحكم الإيجابي لمسبار PPIB البشري (اختياري) | الخلايا المتقدمة | 313901 | مسبار |
| RNAمنظار مجموعة الكاشف المتعدد الفلورسنت (للكشف عن التألق) | الخلايا المتقدمة | 320850 | in الموقع < / i > طقم |
| التهجينمجموعة كاشف RNAscope 2.0 HD - بني (للكشف عن الكروموجينيك) | الخلايا المتقدمة | 310035 | in الموقع < / i> طقم التهجين |
| الماعز متعدد النسيلة المضاد للجسم المضاد ل | ChAT Millipore | AB144P | |
| Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain | American MasterTech | KTLFB | |
| Clearify عامل المقاصة (بديل الزيلين) | American MasterTech | CACLEGAL | |
| الذهب متوسط مع DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| DPX متوسط | تركيب Sigma | 6522 |
المراجع
- Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
