Method Article

الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة في الموقع التهجين

DOI:

10.3791/52799

⸱

June 17th, 2015

 ,  ,  , 
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
يتيح تهجين

RNA في الموقع (ISH) تصور الحمض النووي الريبي في الخلايا والأنسجة. نوضح هنا كيف يمكن استخدام مزيج من RNAscope ISH مع الكيمياء المناعية أو الأصباغ النسيجية بنجاح للكشف عن mRNAs الموضعية في المحاور في أقسام من أدمغة الفئران والإنسان.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في كثير من الأحيان يتم ترجمة من mRNAs إلى محاور الفقارية ومطلوب ترجمة المحلية لالاستطلاعية محور عصبي أو المتفرعة خلال تطوير وصيانة وإصلاح أو التنكس العصبي في فترات تال للنماء. وقد كشفت التحاليل إنتاجية عالية مؤخرا أن محاور لها Transcriptome على أكثر ديناميكية وتعقيدا مما كان متوقعا في السابق. هذه التحليلات، ومع ذلك تم القيام به في الغالب في الخلايا العصبية مثقف حيث المحاور يمكن عزلها من مقصورات somato شجيري. يكاد يكون من المستحيل لتحقيق مثل هذه العزلة في الأنسجة كلها في الجسم الحي. وبالتالي، من أجل التحقق من تجنيد من mRNAs وأهميتها الوظيفية في الحيوان كله، ينبغي من الناحية المثالية يمكن الجمع بين التحليلات Transcriptome على مع التقنيات التي تسمح تصور من mRNAs في الموقع. مؤخرا، تم تطوير تكنولوجيات جديدة ISH التي تكشف عن الرنا على مستوى واحد جزيء. هذا مهم بشكل خاص عند تحليل توطين التحت خلوية من مرنا، وعادة ما وجدت الرنا المترجمة منذ عند مستويات منخفضة. نحن هنا وصف بروتوكولين للكشف عن من mRNAs المترجمة axonally-باستخدام تكنولوجيا فائقة الحساسية RNA ISH الرواية. جمعنا بين RNAscope ISH مع مباين المحاور باستخدام المناعية مضان أو الأصباغ النسيجية للتحقق من تجنيد Atf4 مرنا إلى المحاور في الجسم الحي في الماوس ناضجة والعقول البشرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التوظيف مرنا محور عصبي والترجمة المحلية تمكن المحاور كي تستجيب للمثيرات خارج الخلية بطريقة زمنيا ومكانيا الحادة 1. وأفضل طريقة لفهم تخليق البروتين داخل محور عصبي في سياق النمو العصبي حيث أنه يلعب دورا حاسما في نمو السلوك مخروط 08/02، 11/09 ومحور عصبي الاستطلاعية إلى الوراء مما يشير إلى 12،13. ولكن أقل بكثير من المعروف عن أهمية وظيفية من تخليق البروتين في الخلايا العصبية محور عصبي بعد التنموية عندما يتم تخفيض مستويات مرنا والريبوسوم محور عصبي إلى حد كبير 14،15. منذ فترة طويلة كان يعتقد المحاور الفقارية ناضجة لتكون خاملة translationally 16. ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة إلى أن الترجمة المحلية وإعادة تنشيطها في محاور عصبية ناضجة في ظل ظروف مرضية. على سبيل المثال، تم تجنيد مجموعة فرعية من المحاور من mRNAs لتجديد التالية مطلوبة إصابة العصب وتخليق البروتين داخل محور عصبي لتجديد الصحيح لهذه المحاور 17. بالإضافة إلى ذلك، لدينا مجموعة هكتارأظهرت الصورة التي يتم تجنيدهم من mRNAs محددة لمحاور عصبية بعد مطلوب التعرض المحلي لمرض الزهايمر الببتيد Aβ 1-42، والترجمة المحلية للعامل النسخ ATF4 لنشر آثار العصبية من Aβ 1-42 من العصبونات إلى سوما الخلايا العصبية (18). أخيرا، كشفت التحليلات الإنتاجية العالية التي محاور عصبية ناضجة لديها Transcriptome على أكثر تعقيدا وديناميكية من المتوقع 18-21، خاصة في ظل الظروف المرضية. في ضوء هذه الدراسات، وهي طريقة حساسة للغاية ومحددة للكشف عن الحاجة من mRNAs محلية axonally في الجهاز العصبي الكبار.

وقد تم تنفيذ الكثير من العمل على تجنيد مرنا والترجمة المحلية في محاور عصبية ناضجة على الخلايا العصبية مثقف. هذا ينطبق بشكل خاص لTranscriptome على تحليلات منذ أساليب زراعة المتخصصة موجودة التي تسمح للعزلة محاور من-somato شجيري مقصورة 18-20. على الرغم من أن أعطت هذه الدراسات الإضافية القيمةآيت إلى دور الترجمة المحلية في محاور عصبية ناضجة، مسألة ما إذا كانت الخلايا العصبية مثقف تمثل بصدق الوضع في الجسم الحي أو إذا التوظيف مرنا هو استجابة تكيفية من المحاور لظروف زراعة لا يزال مفتوحا. وقد وفرت دراسات قليلة أدلة على تجنيد مرنا حتى تنضج المحاور في الجسم الحي. على سبيل المثال، تم الكشف عن نص الترميز للبروتين علامة حاسة الشم في محاور الخلايا العصبية الحسية في البالغين 22. ويتم نقل A التحوير الذي يحتوي على 'UTR 3 من-β أكتين مرنا لمحاور الخلايا العصبية في الجهاز العصبي الطرفية والمركزية في الفئران ويترجم محليا بعد فترات التنموية 23. المترجمة امين B2 مرنا إلى المحاور الشبكية في Xenopues المورق الضفادع الصغيرة ويؤثر نضوبها صيانة محور عصبي بعد تطوير محور عصبي 21. التدخل في نقل محور عصبي من الترميز مرنا لالسيتوكروم C أوكسيديز IV يغير سلوك الماوس 24. أخيرا، وجدت Atf4 مرنا في الكبار لxons من الفئران والعقول البشرية في سياق Aβ 1-42 يسببها التنكس العصبي 18.

وقد أثبتت التحليلات Transcriptome على الإنتاجية العالية ليكون من المفيد تحديد ملامح مرنا في المحاور معزولة في المختبر ولكن لديها قيود عليها في الدراسات المجراة منذ ذلك الحين في الأنسجة كلها تم العثور على محاور عصبية أبدا في عزلة بل تتداخل مع أجسام الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية وأنواع الخلايا الأخرى. وبالتالي، فإن هذه التحليلات يجب أن تكون جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير التي تؤكد توطين التحت خلوية من من mRNAs. RNA التهجين الموضعي (RNA ISH) في يتيح الكشف والتصور من تسلسل الحمض النووي الريبي محددة في الخلايا والأنسجة. ومع ذلك، كانت الأصلي فحوصات الحمض النووي الريبي ISH مناسبة فقط لتحديد الرنا وفيرة للغاية 25، وهو الحال بالنسبة ل mRNAs المترجمة axonally نادرا. على مدى العقود الماضية زيادة الجهود قد وضعت في تطوير تقنيات جديدة تسمح للكشف عن من mRNAs في مستوى واحد جزيء 25،26. على سبيل المثال، وضعت المغنية والزملاء تحقيقات ISH للكشف عن من mRNAs في زنازين انفرادية، ويتألف في 5 غير المتداخلة fluorescently المسمى 50 السائدة (لمزيد من التفاصيل تشير إلى 27). والفرق الرئيسي بين التقنيات المذكورة أعلاه، واحدة هنا وصفها هو أن يستخدم في وقت لاحق 20 مزدوج Z-هيكل (وليس الخطية) تحقيقات التي تستهدف عادة ~ 1 كيلوبايت المنطقة من الحمض النووي الريبي لضمان خصوصية الفائدة ومستويات خلفية منخفضة. ثم يتم تهجين تحقيقات مع المضخم ومكبر للصوت متواليات التي يتم أخيرا fluorescently المسمى أو مترافق مع الانزيمات التي تسمح ردود الفعل اللونية. هذه الخطوات التضخيم تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء بالمقارنة مع التكنولوجيات ISH أخرى 28. نحن هنا وصف بروتوكولين باستخدام RNAscope جنبا إلى جنب إما مع مضان مناعية أو مع الأصباغ النسيجية السماح counterstaining المحاور. كلا البروتوكولين هي مناسبة لتصور توطين محور عصبي من Atf4 مرنا في شهر الكباراستخدام والعقول البشرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي IACUC من جامعة كولومبيا والمبادئ التوجيهية المطبقة على رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتلت. ملاحظة: تحضير جميع المخازن المستخدمة في إجراءات ISH في الماء ريبونوكلياز خالية أو المعالجة DEPC. هذه التوصية ليست ضرورية تماما بعد انتهائه ISH لكن يقترح أن مخازن لا تزال على استعداد في الماء المقطر المزدوج تعقيمها و / أو تعقيمها من خلال تصفية.

1. الكشف عن Atf4 مرنا المترجمة إلى الكوليني محاور عصبية في الدماغ باستخدام الماوس الكبار الإسفار في الموقع التهجين (FISH) تلاه المناعية

  1. إعداد نموذج لشرائح الدماغ المجمدة الثابتة امتصاص العرق
    1. على سبيل المثال التالي، وإعداد شرائح من أدمغة فئران المجمدة الثابتة.
      1. لفترة وجيزة، التضحية الفئران من العمر 9 أشهر قبل التخدير مع الكيتامين (100 ملغم كغم -1 وزن الجسم) وزيلازين (10 ملغ كغم -1 وزن الجسمحزب التحرير)، يليه ضخ transcardial من 4٪ لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4).
      2. إزالة العقول وبعد الإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
      3. بعد التثبيت، وغسل العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وcryoprotect في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
      4. أدمغة تغرس في أكتوبر تجميد مجمع، قسم متسلسل في 20 ميكرون على ناظم البرد وجبل على بولي-D-يسين تعامل شرائح المجهر. الحفاظ على شرائح الدماغ عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. إزالة شرائح الدماغ ثابتة امتصاص العرق من الفريزر والهواء الجاف لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
    4. في غطاء الدخان، وإعادة الإصلاح في الدماغ شرائح 20 دقيقة مع 4٪ لامتصاص العرق في RT.
      ملاحظة: تحذير: 4٪ امتصاص العرق هي سامة ويجب التعامل معها والتخلص منها بشكل مناسب التالية بروتوكولات السلامة.
    5. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
    6. يذوى شرائح الدماغ.
      1. تجهيز 50٪، 75٪ و 100٪حلول الايثانول.
      2. تزج الشرائح في 50٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق على RT.
      3. تزج الشرائح في الايثانول 75٪ لمدة 5 دقائق على RT.
      4. تزج الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق على RT.
      5. تزج الشرائح في الطازجة الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق على RT. ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن تخزين الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ عند درجة حرارة -20 درجة مئوية تصل إلى 1 في الشهر.
  2. وجاء FISH فحص من قبل المناعية باستخدام الناجم عن الحرارة مستضد / RNA إماطة اللثام
    1. قبل البدء في إعداد جميع المواد المطلوبة:
      1. تسخين الفرن التهجين إلى 40 درجة مئوية ووضع علبة تحتوي على الماء المقطر في الفرن لخلق بيئة مرطب.
      2. اتخاذ مربع الشريحة ووضع المناشف الورقية غارقة في الماء المقطر داخل لترطيب مربع الشريحة. وضع مربع الشريحة في الفرن التهجين.
      3. إزالة المسابير (كلا تحقيقات السلبية والهدف) من الثلاجة وتسخينها في فرن التهجين لمدة 10 دقيقة. السماح للتحقيقات بارد داون في RT.
      4. تتوازن الكواشف التضخيم AMP 1-4 (المدرجة في أدوات نيون متعددة الكاشف) في RT.
      5. إعداد مستضد حل استرجاع: 10 ملي سيترات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6)، 0.05٪ توين 20. ملاحظة: يمكن تخزين الحل في RT لأجل غير مسمى ويمكن استخدامها لتلطيخ المستقبل.
      6. يعد غسل العازلة 1X تمييع الحل 50X الأسهم (المدرجة في أدوات نيون متعددة الكاشف) في الماء ريبونوكلياز خالية أو المعالجة DEPC.
        ملاحظة: غسل العازلة 1X يمكن تخزينها في RT لمدة 1 شهر و تستعمل لأجل تلطيخ المستقبل. 50X غسل العازلة قد يعجل. إذا كان الأمر كذلك، الحرارة 50X غسل العازلة في 40 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل إعداد حل 1X.
    2. إزالة الشرائح من الإيثانول بنسبة 100٪ والهواء الجاف لمدة 5 دقائق على RT.
    3. إعداد جرة coplin التي تحتوي على 50 مل من محلول استرجاع مستضد. تزج الشرائح في مستضد حل استرجاعها وسلقها لمدة 10 دقيقة في فرن الميكروويف.
      ملاحظة: بدلا من مكان الشرائح أفقيا في 100 ممصحن قطره الزجاج المستديرة التي تحتوي على 100 مل من محلول استرجاع.
      1. ملء كوب 1 L مع الماء المقطر ووضعه في الميكروويف.
        ملاحظة: إن المياه "العازلة" الحرارة عند تنفيذ إماطة اللثام.
      2. وضع الشرائح في حل مستضد استرجاع داخل الميكروويف. يغلي الشرائح في عالية الطاقة لمدة 5 دقائق. على الفور بعد أن توقف عينات المغلي، والشرائح الحرارة مرة أخرى في عالية الطاقة لمدة 5 دقائق إضافية.
      3. تهدئة الشرائح في RT.
        ملاحظة: يجب أن تحدد مدة الغليان والإجراءات من قبل المستخدم، وهذا يتوقف على خصائص الموجات الدقيقة: حرجة STEP. يبدأ أسرع الغليان وارتفاع فرص حل التبخر. في هذه الحالة فمن المستحسن أن العينات المغلي لفترات زمنية أقصر أكثر من مرتين لإكمال مجموع وقت إماطة اللثام عن 10 دقيقة. على العكس من ذلك، إذا تم تنفيذ التدفئة في قوة متوسطة أو منخفضة، وإماطة اللثام يمكن أن يؤديها مرة واحدة لمدة 10 دقيقة. ومع ذلك، إذا العينات لا تغلي continuouslY ليصبح المجموع حوالي 10 دقيقة، وهذا قد يؤدي إلى فضح الجزئي لكل من RNA والبروتين المستهدف أن يتم الكشف عنها.
    4. غسل الشرائح ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
    5. إضافة 2-3 قطرات (~ 100 ميكرولتر) لجنة التحقيق dapB المقرر أن تلك شرائح المخ تستخدم لتقييم تلوين الخلفية. ملاحظة: لجنة التحقيق مجموعة dapB يستهدف الجينات البكتيرية، وينبغي ألا تعترف بأي RNA الثدييات.
    6. إضافة 2-3 قطرات من التحقيق استهداف المقرر أن تلك شرائح المخ تستخدم للكشف عن الحمض النووي الريبي في المصالح. ملاحظة: مجموعة التحقيق تستهدف بقايا 20 - 1381 من الفأرة يستخدم Atf4 مرنا في هذا المثال.
    7. الشرائح غطاء مع parafilm لتجنب التحقيق التبخر، ووضعها في خانة الشريحة مرطب داخل الفرن التهجين واحتضان لهم عند 40 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: اختياري: يمكن تهجين شرائح الدماغ إضافية مع مجموعة التحقيق التي تستهدف الماوس Polr2A واستخدامها كأداة الضوابط الإيجابية.
    8. غسل سليدي مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
    9. إضافة 2-3 قطرات من التضخيم كاشف AMP 1-FL إلى كل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الفرن التهجين.
    10. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
    11. إضافة 2-3 قطرات من التضخيم كاشف AMP 2-FL إلى كل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الفرن التهجين.
    12. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
    13. إضافة 2-3 قطرات من التضخيم كاشف AMP 3-FL إلى كل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الفرن التهجين.
    14. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
    15. إضافة 2-3 قطرات من التضخيم كاشف AMP 4-FL إلى كل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها فيمربع الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الفرن التهجين.
    16. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT ومرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
    17. إضافة 100-200 ميكرولتر (أو حجم ما يكفي لتغطية كامل شرائح) لعرقلة الحل تحتوي على 3 ملغ / مل BSA، و 100 ملي الجلايسين و 0.25٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى الشرائح، وتغطيتها مع parafilm و احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    18. إضافة 100-200 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة دردشة مخففة في عرقلة الحل (1/100) إلى الشرائح، وتغطيتها مع parafilm واحتضان لمدة 2 أيام في 4 درجة مئوية. تأكد من أن شرائح الدماغ لا تجف. إذا لزم الأمر، وإعادة تطبيق حل الأجسام المضادة لمكافحة دردشة لشرائح الدماغ 24 ساعة بعد الحضانة.
    19. غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق على RT.
    20. إضافة 100-200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية اليكسا مترافق المناسب (. على سبيل المثال، اليكسا-594 حمار المضادة للماعز لهذا المثال بالذات) إلى شرائح، وتغطي مع parafilm وincubأكل لمدة 1 ساعة على RT.
    21. غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق على RT.
    22. غسل الشرائح مرة واحدة مع الماء المقطر.
    23. جبل الشرائح مع المحتوية على دابي المتوسطة المتزايدة.
    24. تصور شرائح الدماغ تحت المجهر مضان.

2. الكشف عن Atf4 مرنا المترجمة إلى محاور عصبية في الدماغ البشري باستخدام العينات اللونية في الموقع التهجين (CISH) تلاه Luxol سريع الأزرق والبنفسجي الكريزيل Counterstaining

  1. إعداد نموذج للعينات الدماغ البشري جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين
    1. شرائح الخبز في الفرن الجاف في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. شرائح الدماغ Deparaffinize في غطاء الدخان.
      ملاحظة: تنبيه: الكواشف سامة ويجب التعامل والتخلص منها باتباع الإرشادات الأمنية المناسبة
      1. تزج الشرائح في الزيلين وكيل المقاصة البديل مرتين لمدة 10 دقيقة.
      2. تزج الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ مرتين لمدة 1 دقيقة.
      3. Aالأشعة تحت الحمراء الجافة شرائح 5 دقائق على RT. ملاحظة: يمكن أن تجفف العينات بدلا من ذلك في RT O / N ولكن يجب استخدامه في غضون 24 ساعة.
  2. Diaminobenzidine (DAB) القائم مولد اللون فحص ISH تليها luxol سريعة زرقاء وبنفسجية الكريزيل وصمة عار باستخدام الناجم عن الحرارة والبروتياز التي يسببها RNA إماطة اللثام
    1. قبل البدء في إعداد المواد المطلوبة:
      1. تسخين الفرن التهجين إلى 40 درجة مئوية ووضع علبة تحتوي على الماء المقطر لخلق بيئة مرطب.
      2. اتخاذ مربع الشريحة ووضع المناشف الورقية غارقة في الماء المقطر داخل لترطيب مربع الشريحة. وضع مربع الشريحة في الفرن التهجين.
      3. إعداد 1X يمهد للمعالجة 2 عن طريق تمييع الحل 10X الأسهم (المدرجة في أدوات CISH الكاشف) في الماء ريبونوكلياز خالية أو المعالجة DEPC. إذا يتم تنفيذ المعالجة على طبق ساخن، إضافة 100 مل من محلول يمهد للمعالجة إلى 100 ملم صحن من الزجاج قطر لزيادة سطح التماس بين طبق وطبق ساخن (إن المعالجةيتم تنفيذ في الميكروويف، جرة coplin يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك على النحو المحدد في 1.2.3). الحل الحرارة إلى 100 ​​درجة مئوية والحفاظ على أنه لم يعد من 30 دقيقة المغلي قبل غمر العينات.
      4. الحرارة تحقيقات السلبية والإيجابية مدة 10 دقيقة في 40 درجة مئوية ويبرد في RT.
      5. تتوازن الكواشف التضخيم AMP 1-6 (المدرجة في أدوات CISH الكاشف) في RT.
      6. يعد غسل العازلة 1X تمييع الحل 50X الأسهم (المدرجة في CISH الكاشف كيت) في الماء المقطر. ملاحظة: يمكن تخزين 1X غسل العازلة في RT لمدة 1 شهر و تستعمل لأجل تلطيخ المستقبل.
    2. إضافة 4 قطرات ~ (~ 120 ميكرولتر) من يمهد للمعالجة من 1 إلى كل شريحة الدماغ، وتغطي مع parafilm واحتضان في RT لمدة 10 دقيقة.
    3. يغسل 3-5 مرات في الماء المقطر النقي.
    4. أداء الناجم عن الحرارة إماطة اللثام:
      1. الشرائح نقل إلى حار يمهد للمعالجة 2 (المدرجة في CISH الكاشف كيت) حل ويغلي لمدة 15 دقيقة. ملاحظة: الغليان لا يمكن أن يؤديها على طبق ساخن ضماناستمرار الغليان أو في الميكروويف التالية الخطوات الحاسمة المحددة في 1.2.3).
    5. نقل على الفور إلى الشرائح الماء المقطر، ويغسل 3-5 مرات.
    6. غسل الشرائح 3-5 مرات في جديدة الإيثانول بنسبة 100٪.
    7. شرائح الهواء الجاف 5 دقائق على RT. ملاحظة: O بدلا من شرائح يمكن أن تجفف / N.
    8. أداء الناجم عن البروتيني إماطة اللثام:
      1. إضافة 4 قطرات من يمهد للمعالجة 3 (المدرجة في CISH الكاشف كيت)، وتغطي مع parafilm واحتضان 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في الفرن التهجين.
    9. غسل الشرائح 3-5 مرات في الماء المقطر النقي.
    10. إضافة 4 قطرات من التحقيق dapB المقرر أن تلك شرائح المخ تستخدم لتقييم تلوين الخلفية.
    11. إضافة 4 قطرات من لجنة التحقيق التي تستهدف المقرر أن تلك شرائح المخ تستخدم للكشف عن الحمض النووي الريبي في المصالح.
      يستخدم 1256 من ATF4 مرنا البشري في هذا المثال - مجموعة التحقيق التي تستهدف بقايا 15: ملاحظة. اختياري: يمكن شرائح الدماغ إضافية تكون HYBridized مع مجموعة التحقيق التي تستهدف PPIB البشري وتستخدم الضوابط الإيجابية.
    12. وضع الشرائح في مربع الشريحة واحتضان لمدة 2 ساعة. في 40 درجة مئوية في الفرن التهجين.
    13. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
    14. إضافة 4 قطرات من AMP 1 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الفرن التهجين.
    15. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
    16. إضافة 4 قطرات من AMP 2 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الفرن التهجين.
    17. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
    18. إضافة 4 قطرات من AMP 3 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الفرن التهجين.
    19. غسل الشرائح مرتين مع و1Xح عازلة لمدة 2 دقيقة في RT.
    20. إضافة 4 قطرات من AMP 4 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm، ووضعها في خانة الشريحة واحتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الفرن التهجين.
    21. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
    22. إضافة 4 قطرات من AMP 5 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm واحتضان 30 دقيقة في RT.
    23. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
    24. إضافة 4 قطرات من AMP 6 كاشف لكل شريحة الدماغ، تغطية الشرائح مع parafilm واحتضان 15 دقيقة في RT.
    25. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT.
    26. مزيج حجم مساو من BROWN-1 وBROWN-2 الكواشف (المدرجة في CISH الكاشف كيت)، إضافة ~ 120 ميكرولتر من حل كل شريحة الدماغ، وتغطي مع parafilm واحتضان 10 دقيقة في RT.
    27. غسل الشرائح مرتين مع 1X العازلة يغسل لمدة 2 دقيقة في RT وشطف مرة واحدة في الماء المقطر.
      ملاحظة: الخطوات الحاسمة: الخطوات التالية حاسمة لالحصول على مباين المحاور الأمثل دون إخفاء وجود حبيبات RNA.
    28. قبل تنفيذ مباين تحقق من وجود مرنا من الفائدة تحت المجهر brightfield. تحديد المناطق المرجعية في عينات الدماغ الذي لرصد وجود نقاط وجميع أنحاء الداخلي مباين.
    29. luxol سخن بسرعة حل الأزرق في 60 درجة مئوية.
    30. مكان الشرائح في luxol الأزرق سريع واحتضان 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية.
    31. شطف عدة مرات في الماء المقطر.
    32. تراجع الشرائح عدة مرات في 0.05٪ محلول كربونات الليثيوم لبدء التمايز.
    33. تراجع الشرائح مرتين في جديدة الايثانول 75٪.
    34. شطف في الماء المقطر.
    35. تحقق شرائح الدماغ تحت المجهر brightfield. لاحظ أن المادة الرمادية والبيضاء وينبغي أن تبدأ لتكون حبيبات مميزة وRNA لا تزال مرئية كما الأزرق الداكن / نقاط وسوداء. تحقق من المحاور تبدأ في الظهور كما الألياف اللون الأزرق الفاتح.
    36. كرر الخطوات من 2.2.28 الى 2.2.32. ادائهام حضانات مع luxol حل سريع الأزرق في 10-20 دقيقة الخطوات، ومراقبة بعناية مباين وجود حبيبات RNA. ملاحظة: عادة، يتم الحصول عليها مباين الأمثل في 60-90 دقيقة (مجموع فترة حضانة) ولكن الوقت يمكن اختصارها إذا كان يشتبه في أن حبيبات RNA يمكن أن تقنع من خلال luxol وصمة عار الزرقاء السريعة (انظر الشكل 2 للحصول على أمثلة).
    37. احتضان الشرائح في الكريزيل حل البنفسجي لمدة 10 دقيقة في RT.
    38. شطف الشرائح في الماء المقطر.
    39. تراجع الشرائح 5 إلى 10 مرات في 70٪ من الإيثانول.
    40. يذوى شرائح الدماغ خلال 3 تغييرات سريعة من الإيثانول بنسبة 100٪.
    41. في غطاء الدخان، شرائح الدماغ واضحة التي يحتضنها مرتين في زيلين كيل المقاصة بديل لمدة 2 دقيقة ومرة ​​ثالثة لمدة 5 دقائق على RT.
    42. شرائح جبل الدماغ في القائم زيلين دائم المتوسطة المتزايدة.
    43. تحليل العينات تحت المجهر brightfield.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد ملخص موجز للإجراءات المذكورة أعلاه في الشكل 1.

كشف الأمثل للAtf4 مرنا حبيبات في المحاور كوليني باستخدام الناجم عن الحرارة إماطة اللثام

عند تقييم توطين محور عصبي من mRNAs، فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على تحديد المحاور وأن تكون قادرة على تصور الرنا وفيرة منخفضة. التكنولوجيا RNA ISH الموصوفة هنا يمكن من اكتشاف الر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا التقرير وصفنا استخدام التكنولوجيا ISH عالية الدقة في الكشف عن مترجم axonally Atf4 مرنا. تظهر هذه والسابقة الدراسات المنشورة أن هذه التقنية متوافقة مع القائم على الأجسام المضادة الكشف عن البروتين في الأنسجة أو حتى الأجنة كلها 33. الأهم من ذلك أنها استخدمت مؤخرا للكشف عن قوس مرنا في التشعبات من الخلايا العصبية الحصين 34. ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع الأصباغ النسيجية لتلطيخ الأنسجة. أخيرا، وهي مناسبة للكشف في وقت واحد من الهدف متعد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل جمعية الزهايمر (NIRG-10-171721 ؛ إلى جامعة هامبشاير) ، والمعهد الوطني للصحة العقلية (MH096702 ؛ إلى جامعة هامبشاير) ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NS081333 ؛ إلى CMT) ، وجوائز الدراسة التجريبية من مركز أبحاث مرض الزهايمر الممول من المعهد الوطني للشيخوخة في جامعة كولومبيا (AG008702 ؛ إلى JB و YJ) الذي يدعم أيضا بنك الدماغ في نيويورك. نشكر أعضاء مختبر Hengst على التعليقات والمناقشات

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مسبار مخصص يستهدف بقايا 20-1،381 من الماوس Atf4< / i> mRNA (NM_009716)مسبارلتشخيص الخلايا
المتقدم يستهدف المخلفات 15-1،256 من مسبار mRNA البشري ATF4< / i> (NM_001675.2)الخلايا المتقدمة
مسبار
310043 تشخيص الخلايا المتقدمة DapBمسبار التحكم الإيجابي الماوس Polr2A (اختياري)الخلاياالمتقدم 312471مسبار
التحكم الإيجابي لمسبار PPIB البشري (اختياري)الخلايا المتقدمة313901مسبار
RNAمنظار مجموعة الكاشف المتعدد الفلورسنت (للكشف عن التألق)الخلايا المتقدمة320850in الموقع < / i > طقم
التهجينمجموعة كاشف RNAscope 2.0 HD - بني (للكشف عن الكروموجينيك)الخلايا المتقدمة310035in الموقع < / i> طقم التهجين
الماعز متعدد النسيلة المضاد للجسم المضاد لChAT MilliporeAB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet StainAmerican MasterTechKTLFB
Clearify عامل المقاصة (بديل الزيلين)American MasterTechCACLEGAL
الذهب  متوسط مع DAPILife TechnologiesP36935
DPX متوسطتركيب Sigma6522
مخصص مسبار التحكم السلبي لتشخيص - تشخيص تشخيص تشخيص تشخيص Kit تركيب طويل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506(2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079(2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55(2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Situ HybridizationRNAscope TechnologyAxonal mRNA DetectionBrain Section AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryAntigen UnmaskingProbe HybridizationSignal AmplificationCholine Acetyltransferase StainingLuxol Fast Blue Counterstain

Related Articles