مقالة منهجية

التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة

DOI:

10.3791/52823

⸱

مايو 14, 2015

 , 
1Division of Cancer Research, College of Medicine, Dentistry and Nursing, University of Dundee

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة توليد الأسلاف العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام طريقة أحادية الطبقة الخالية من المصل. يمكن استخدام هذه الأسلاف لاشتقاق أنواع الخلايا العصبية الناضجة أو لدراسة عملية المواصفات العصبية وهي قابلة لتحجيم تنسيق متعدد الآبار للفحص المركب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على تمييز الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) إلى الأسلاف العصبية تسمح دراسة آليات السيطرة على مواصفات العصبية فضلا عن جيل من أنواع الخلايا العصبية الناضجة لمزيد من الدراسة. في هذا البروتوكول وصفنا طريقة لتمايز ESC إلى الأسلاف العصبية باستخدام المصل خالية والثقافة أحادي الطبقة. هذه الطريقة قابلة للوكفاءة ويؤدي إلى إنتاج ~ 70٪ الخلايا الاصلية العصبية داخل 4-6 أيام. ويمكن تطبيقه على ESC من مختلف السلالات التى تزرع في إطار مجموعة من الشروط. يمكن السماح الأسلاف العصبية إلى مزيد من التفريق في الخلايا العصبية الوظيفية والدبقية أو تحليلها بواسطة المجهر، وتدفق تقنيات الخلوي أو الجزيئية. عملية التمايز هو قابل للالوقت الفاصل بين المجهر ويمكن الجمع مع استخدام خطوط مراسل لمراقبة عملية مواصفات العصبية. نحن نقدم تعليمات مفصلة حول إعداد وسائل الاعلام وكثافة الخلايا الأمثل للسماح للعملية بالبريد تطبيقها على معظم خطوط ESC ومجموعة متنوعة من السفن ثقافة الخلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الجنينية هي الخلايا المحفزة المستمدة من الجنين في وقت مبكر لديها القدرة على التكاثر إلى أجل غير مسمى في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا الكبار بعد إعادة إلى الجنين مرحلة المناسب (خلال تشكيل كايميرا)، والحقن في مسانج أو نقص المناعة المضيفين (من خلال تشكيل مسخي) أو في المختبر تخضع لمنبهات المناسبة 1. وكان أول وصف التمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية في الأنساب العصبية في عام 1995 وشملت تشكيل المجاميع تعليق الخلايا (الهيئات مضغي، EBS) في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل تستكمل مع حمض الريتينويك محدثة التخلق 2-4. ومنذ ذلك الحين تم تطوير مجموعة متنوعة من البروتوكولات للسماح التمايز العصبي 5. لا يزال كثير من الاستفادة من التجميع، شارك في ثقافة الآخرين مع إحداث أنواع الخلايا وعدد تنطوي على استخدام المصل خالية سائل الإعلام. جميع البروتوكولات لديها مزايا علىالثانية عيوب والطبيعة المحددة لالعصبية أو الخلايا العصبية تنتج أيضا يختلف وفقا لبروتوكول المستخدمة.

وأضاف أن البروتوكول المثالي هو أن يكون قويا، للتحجيم والاستفادة من وسائل الإعلام وركائز محددة تماما، تكون قابلة للرصد غير الغازية لعملية التمايز ويؤدي إلى توليد السكان نقية من الأسلاف العصبية قادرة على أن تكون منقوشة بواسطة منبهات الخارجية والتفريق في جميع أنواع فرعية العصبية والدبقية مع الكفاءة العالية والعائد في وقت قصير نسبيا. في اثني عشر عاما الماضية لقد تم استخدام طريقة لتوليد الأسلاف العصبية والخلايا العصبية من الماوس ESC في منخفض الكثافة، والثقافة أحادي الطبقة ملتصقة خالية من المصل 10/06. هذا البروتوكول يحقق العديد من المعايير الواردة أعلاه: في أيدينا فإن كفاءة التمايز يتسق تماما على مدى سنوات عديدة ومتنوعة من خطوط الخلايا، فإنه يمكن زيادتها إلى أعلى أو أسفل (التي نستخدمها بنجاح السفن من لوحات 96-جيدا ل 15 سم القطر ديشيس) وسائل الإعلام المستخدمة هي واضحة المعالم. هذه العملية هي قابلة للالمجهر timelapse لرصد التمايز ومجموعة متنوعة من العظة الزخرفة ويمكن أن يضاف للحث على توليد أنواع متميزة من الأنواع الفرعية العصبية (على سبيل المثال، Shh على وFgf8 عن الخلايا العصبية الدوبامين 6).

ومع ذلك، هناك بعض التحديات التي تواجه التطبيق الناجح لهذا البروتوكول. أحد الجوانب الرئيسية لإعداد دقيق وسائل الإعلام. نحن دائما بتحضير وسائل الإعلام في المنزل على الرغم من توافر البدائل التجارية. واحدة من المكملات الغذائية المستخدمة (N2؛ انظر البروتوكول) لديها تعديلات على مستوى الإصدارات المتوفرة تجاريا. أخيرا، واحدة من أهم الخطوات لنجاح تطبيق هذا الأسلوب هو كثافة الخلية المثلى في الطلاء. هذا هو السبب الرئيسي في حين تتطلب طبيعة autocrine واحدة من الإشارات المحفزة (Fgf4 11) أن خلايا كافية موجودة للسماح viabil الأمثلهو ضعف إيتي والتمايز، بكثافات عالية جدا التمايز (ربما يرجع ذلك جزئيا إلى إنتاج autocrine من LIF 12). ولذلك فمن المهم أن إعداد كل من وسائل الإعلام وطلاء الخلية تتم بعناية وباستمرار لضمان أفضل النتائج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد وسائل الإعلام

ملاحظة: بروتوكول يعتمد على استخدام مزيج من اثنين منفصلة وسائل الإعلام: DMEM / F12 تستكمل مع تعديل الملحق N2 وNeurobasal تستكمل مع B27 الملحق، وعادة في نسبة 1: 1.

  1. إعداد N2 ملحق تعديل عن طريق خلط المكونات في أنبوب 15 مل. لا الدوامة أو تصفية هذا؛ مزيج من قبل قلب الأنبوب حتى حل واضح.
    1. بدء بواسطة pipetting 7.2 مل من DMEM / F12، ثم يضاف 1 مل من 25 ملغ / مل الأنسولين (تتكون في 0.01 M حمض الهيدروكلوريك) ومزيج جيد من قبل قلب الأنبوب. يستغرق بضع دقائق حتى حل واضح.
    2. إضافة 1 مل من 100 ملغ / مل APO-ترانسفيرين (تتكون في الماء)، 33 ميكرولتر من 0.6 ملغ / مل progesternone (تتكون في الإيثانول)، و 100 ميكرولتر من 160 ملغ / مل (1 M) بوتريسين (تتكون في الماء )، و 10 ميكرولتر من 3 ملي سيلينات الصوديوم (تتكون في الماء) و 666 ميكرولتر من 7.5٪ ألبومين المصل البقري وتخلط الأنبوب جيدا. قسامة إلى 2.5 مل وتخزينها في -20 °C لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  2. إعداد وسائل الإعلام.
    1. 250 مل من DMEM / F12 إضافة 2.5 مل من N2. تخلط جيدا ولكن لا تهزه أو التصفية.
    2. 250 مل من Neurobasal وسائل الإعلام إضافة 5 مل من B27 الملحق. تخلط جيدا ولكن لا تهزه أو التصفية.
    3. خلط وسائل الإعلام من خطوات 1.2.1 و 1.2.2 في نسبة 1: 1. في بعض الحالات 1: قد تكون هناك حاجة مزيج 3 (تستكمل مثل 1: مزيج 1 في الخطوة 1.2.4).
    4. إلى المزيج إضافة 0.5 مل من L-الجلوتامين (تركيز النهائي 0.2 ملم) و 3.5 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول (تركيز النهائي 0.1 ملم) وتخلط جيدا دون أن تهتز. تخزين وسائل الإعلام في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع، وتجنب تعريض للضوء. ويسمى هذا المزيج النهائي N2B27.
  3. تحضير محلول الجيلاتين.
    1. إعداد محلول الجيلاتين 1٪ في الماء عالى النقاء والتعقيم في 121 ° C، 15 رطل، لمدة 15 دقيقة. من المهم أن الزجاجة المستخدمة لهذا نظيفة تماما من المنظفات أو المطهرات، لذلك فمن المستحسن أن زجاجة الجديدةتستخدم لهذا وفقط من أي وقت مضى تشطف في الماء عالى النقاء بين الاستخدامات. قسامة الحل 1٪ إلى 50 مل قسامات والحفاظ على 4 درجات مئوية لمدة أشهر.
    2. تدفئة قسامة من 1٪ الجيلاتين في 37 ° C حمام الماء حتى يذوب وإضافة إلى 500 مل من الفوسفات مخزنة المالحة الدافئة (PBS). تخلط جيدا والماصة بما يكفي لتغطية الجزء السفلي من كل بئر أو لوحة. السماح الجيلاتين إلى معطف السطح لمدة 30 دقيقة على الأقل.

2. طلاء الخلايا

ملاحظة: ينطبق هذا البروتوكول أيضا على الماوس ESC تزرع في 10٪ مصل مع عامل مثبط سرطان الدم (LIF)، واستبدال المصل مع LIF أو وسائل الإعلام خالية من المصل مع LIF ومخلق العظام البروتين 4 (BMP4) أو منظمة مجاهدي خلق وGSK3 مثبطات (وسائل الإعلام 2I) مع أو بدون LIF. ومع ذلك، فإن توقيت وكفاءة التمايز قد تختلف اعتمادا على وسائل الإعلام والخلايا (انظر المناقشة). لالتجارب هو موضح هنا استخدمنا خط 46C الماوس ESC (الذي لديه طرقت مراسل EGFP إلى سشمال شرق من الأليلات Sox1 الذاتية)، ونمت في GMEM مع 10٪ مصل وLIF. لأفضل النتائج من المهم أن الخلايا فصلها وreplated في وسائل الإعلام N2B27. ببساطة تغيير وسائل الإعلام من GMEM / المصل / LIF إلى N2B27 يؤدي دائما في انخفاض الكفاءة التمايز مقارنة replating الخلايا.

  1. تنمو الخلايا في GMEM مع المصل 10٪، 1 ملي البيروفات الصوديوم، والأحماض الأمينية غير الأساسية 1X و 0.1 M 2-المركابتويثانول، و 100 وحدة / مل LIF 13. للحصول على الثقافة subconfluent من الماوس ESC، لوحة 1 × 10 6 الخلايا في قارورة الثقافة T25 والتي سوف تتخذ 2-3 أيام.
  2. مراقبة الخلايا تحت المجهر مشرق الميدان. عندما كانت الخلايا subconfluent وعلى استعداد للمرور، شطف لهم مرتين في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من خلية تفارق كاشف والعودة إلى الحاضنة لمدة 2-5 دقيقة. على الرغم من التربسين والأنزيمات الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا لتفكك خلية، فإنها يمكن أن يكون لها تأثير سلبي على مرفق الخلية وبالتالي فإن كثافة الطلاء سوف تحتاج إلى أن تكون adjuSTED.
  3. وبمجرد أن الخلايا هي بداية لرفع من لوحة، والاستفادة من السفينة إلى إخراجهم إلى تعليق خلية واحدة. جمع الخلايا في ما مجموعه 10 مل من وسائل الإعلام والتفكك خلية الكاشف والماصة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
  4. تدور الخلايا في 300 x ج لمدة 3 دقائق على RT.
  5. نضح بعناية طاف و resuspend بيليه في 10 مل من قبل تحسنت N2B27 pipetting صعودا وهبوطا 3-5 مرات. عندما pipetting لتعليق أسفل، الماصة ضد الجانب من الأنبوب لتجنب خلق فقاعات. عد الخلايا مع عداد خلية الآلي أو haemocytometer وتسجيل التركيز.
  6. إعداد تعليق الخلية التي تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا لكل وحدة من وحدة التخزين إلى أن مطلي لكل بئر في درجة حرارة ما قبل N2B27. A كثافة 10500 خلية لكل سم 2 في صحن 6 جيدا (أي 1 × 10 5 خلايا لكل بئر من صحن 6 جيدا) هو الأمثل. انظر الجدول رقم 1 لالعدد المقترح من الخلايا لكل سم 2 وجيش التحرير الشعبى الصينىوحدات التخزين وسائل الإعلام تينغ لمجموعة متنوعة من السفن ثقافة الخلية.
  7. نضح الجيلاتين من سفينة الثقافة وصفيحة تعليق الخلية وفقا للكثافة المقترحة وحجم في الجدول 1. لا يدوم لوحات حيث سيؤدي ذلك إلى تركيز الخلايا إلى المركز. وضع الثقافات في حاضنة الرطبة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  8. تغيير وسائل الاعلام كل 1-2 أيام عن طريق استبدال جميع وسائل الإعلام مع N2B27 الطازجة. ماصة بلطف كما بيغ الخلايا قد يؤثر على كثافة ويقلل من كفاءة التمايز في الأيام التالية. حيث الجدوى الأولية بعد الطلاء رديئة، لوحة الخلايا في 1: مزيج 3 من N2 و B27 تستكمل وسائل الإعلام وتغيير هذا إلى N2B27 بعد اليومين الأولين. وسوف تبدأ الخلايا للتمييز ويجب أن تظهر التعبير Sox1 (مرئية من قبل مخضر لمراسل في خط الخلية 46C المستخدمة هنا) ضمن 4-6 أيام.

3. مناعي تلطيخ

لاTE: بروتوكول يمكن تطبيقها على أي نوع السفينة. يوصف حجم كل كاشف لكل بئر من لوحة 6 جيدا ويمكن زيادتها إلى أي مساحة السطح. لا ينصح Replating نظرا لقابلية منخفضة بعد ذلك.

  1. إزالة التمايز المتوسطة وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 4٪ (ت / ت) لامتصاص العرق، وترك لمدة 15 دقيقة.
  2. غسل وpermeabilize الخلايا مع 2 مل من PBS-T (الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.5٪ (V / V) توين-20) مرتين. يمكن أن تبقى الخلايا في برنامج تلفزيوني-T لمدة تصل إلى 2 أشهر في 4 ° C.
  3. استبدال PBS-T مع 1 مل من برنامج تلفزيوني-T مع 10٪ (V / V) مصل (من نفس النوع كما الأجسام المضادة الثانوية). احتضان 1 ساعة على الكرسي الهزاز لوحة في RT لمنع أي غير محددة وملزمة.
  4. بعد 1 ساعة، وغسل الخلايا مرتين مع 2 مل من PBS-T، واحتضان في 500 ميكرولتر الماوس مفتش ضد βIII تويولين (المخفف 1: 1000 في برنامج تلفزيوني-T مع 10٪ مصل). وضعت على لوحة الروك، وترك O / N عند 4 درجات مئوية.
  5. من هذه الخطوة، دائما حماية السفينةبعيدا عن الضوء. غسل الخلايا مرتين مع PBS-T، ثم يضاف 500 ميكرولتر من المسمى مضان المضادة للماوس مفتش الأضداد (مخفف إلى 2 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-T مع 10٪ مصل). وضعه على لوحة الروك لمدة 1 ساعة على RT.
  6. شطف الخلايا مرتين مع PBS-T، ثم يضاف 500 ميكرولتر من دابي (مخفف إلى 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني-T) ويترك لمدة 5 دقائق.
  7. غسل الخلايا مرة أخرى والاحتفاظ بها في برنامج تلفزيوني-T. الخلايا جاهزة لتصويرها، ويمكن أن تبقى لمدة تصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية. لاحظ أن يتلاشى إشارة GFP مع مرور الوقت لذلك فإنه من غير المناسب مقارنة كثافة GFP الخلايا الثابتة والحية أو الخلايا الثابتة في أوقات مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه التجربة، استخدمنا خط خلية 46C 14، الخلايا الجذعية الجنينية مع مراسل Sox1-GFP الذاتية، لتعقب التمايز العصبي. باستخدام هذا الخط الخلية، تعبيرا عن Sox1، وهي علامة للحصول على السلف العصبي، ويمكن الكشف عنها بواسطة مخضر. تصفيح كثافة يشكل عاملا حاسما لتحقيق تمايز الخلايا العصبية. كانت مطلية الخلايا الجذعية الجنينية في لوحة 6 جيدا بكثافات مختلفة تتراوح بين 10500 إلى 88500 خلية / سم 2. ويبين الشكل 1A الكفاءة التمايز التي كتبها كثافة الطلاء المخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان بروتوكول التمايز العصبي أحادي الطبقة في استخدام لأكثر من عقد 6. البروتوكول هو ذات كفاءة عالية، ويتألف من متوسطة محددة، وذلك في ظل نظام أحادي الطبقة مما يجعل النظام أكثر قابلية للتطبيق لما قبل السريرية (على سبيل المثال، فحص المخدرات) يستخدم. ومع ذلك، هناك بعض العوامل الحاسمة التي تحدد كفاءة التمايز. وتشير هذه المادة من تلك العوامل والحل لكل عقبة.

كثافة الخلايا بعد الطلاء في حالة التمايز ورب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل العمل من خلال منحة دراسية لتطوير وتعزيز العلوم والتكنولوجيا من وزارة التعليم التايلاندية إلى WW ومنح من Tenovus و Anonymous Trust إلى M.P.S.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مصل الأبقار الجنينيتقنيات الحياة10270-106
DMEM / F12Life Technologies11320-074
تقنيات الحياةالمتوسطة العصبية القاعدية21103-049
تقنيات كاشف تفكك الخلايا StemPro Accutaseتقنيات الحياةA11105-01
B-27 ، تقنيات الحياة الخالية من المصل17504-044
الأنسولينSigmaI6634إعادة التكوين مع معقم 0.01 M HCl
Apo-transferrinSigmaT1147إعادة التكوين بالماء المعقم
البروجسترونSigmaP8783إعادة التكوين مع الإيثانول
PutrescineSigmaP5780إعادة التكوين بالماء المعقم
سيلينيت الصوديومSigmaS5261إعادة التكوين بالماء المعقم
جزء الألبومين البقري VLife Technologies15260-037
L-GlutamineLife Technologies25030-081تأكد من إذابته تماما قبل الاستخدام لأن الجلوتامين عادة ما يكون مترسب
الجيلاتينSigmaG1890
طبق زراعة الأنسجة ذو 6 آبارThermo Scientific140675
طبق زراعة الأنسجة 24 بئراThermo 142475
طبق زراعة الأنسجة 96 بئرThermo Scientific167008
GMEMLife Technologies11710-035
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسيةLifeTechnologies 11140-050
Sodium PyruvateLifeTechnologies 11360-070
2-mercaptoethanolSigmaM7522
عامل مثبط لسرطان الدمأعدت في المنزل كما هو الحال في سميث 1991 مجلة طرق
Tween-20SigmaP1379
4 & prime ;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)SigmaD9542حماية من ضوء
الفأر المضاد & بيتا; III التوبولين IgG الجسم المضادCovanceMMS-435P
الأجسام المضادة للفأر IgG ذات العلامات الفلوريةتقنيات الحياةA31571الحماية من الضوء
25 سم 2< / sup> قارورة ثقافة الأنسجةThermo Scientific156367
العلميزراعة الأنسجة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
  2. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  3. Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
  4. Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
  5. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
  6. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
  7. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  8. Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
  9. Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
  10. Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
  11. Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
  12. Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
  13. Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
  14. Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
  15. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
  16. Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SOX1 GFP 3

مقالات ذات صلة