Method Article

تتبع الزمني للتقدم دورة الخلية باستخدام التدفق الخلوي دون الحاجة إلى مزامنة

DOI:

10.3791/52840

⸱

August 16th, 2015

 , 
1Centre for Cancer Research, Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول استخدام bromodeoxyuridine (BrdU) امتصاص للسماح تتبع الزمني للخلايا التي كانت في المرحلة S في نقطة محددة في الوقت المناسب. إضافة الأصباغ الحمض النووي ووضع العلامات الأجسام المضادة تسهل تحليل مفصل لمصير الخلايا مرحلة S في أوقات لاحقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة للسماح بتتبع الخلايا خلال دورة الخلية دون الحاجة إلى مزامنة الخلايا. قد يكون تحقيق تزامن الخلايا أمرا صعبا للعديد من أنظمة الخلايا. تتمثل الممارسة القياسية في منع تقدم دورة الخلية في مرحلة معينة ثم إطلاق الخلايا المتراكمة التي تنتج موجة من الخلايا التي تتقدم خلال الدورة في انسجام تام. ومع ذلك ، تجد بعض أنواع الخلايا أن هذه الكتلة سامة مما يؤدي إلى دورة الخلايا غير الطبيعية ، أو حتى الموت الجماعي. يمكن استخدام امتصاص برومودوكسيوريدين (BrdU) لتتبع مرحلة دورة الخلية للخلايا الفردية. تتضمن الخلايا هذا التناظرية الثايميدين الاصطناعية ، أثناء تصنيع الحمض النووي الجديد خلال المرحلة S. من خلال توفير BrdU لفترة وجيزة ، من الممكن تحديد مجموعة من الخلايا التي كانت في المرحلة S أثناء وجود BrdU. يمكن بعد ذلك تتبع هذه الخلايا خلال الفترة المتبقية من دورة الخلية وفي الجولة التالية من النسخ المتماثل ، مما يسمح بتحديد مدة مراحل دورة الخلية دون الحاجة إلى إحداث كتلة دورة خلية يحتمل أن تكون سامة. من الممكن أيضا تحديد وربط التعبير عن البروتينات الداخلية والخارجية خلال المراحل اللاحقة من دورة الخلية. يمكن استخدامها لزيادة تحسين تعيين مرحلة دورة الخلية أو تقييم التأثيرات على الوظائف الخلوية الأخرى مثل تنشيط نقطة التفتيش أو موت الخلية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم ميزات دورة الخلية والتغيرات التي تحدث في الخلايا أثناء تقدم دورة الخلية هو أمر أساسي لفهم جوانب كثيرة من الأحياء، لا سيما بيولوجيا السرطان. العديد من وكلاء في التنمية لعلاج الأورام الخبيثة يكون لها آثار عميقة على تقدم دورة الخلية أو لحث على موت الخلايا عبر دورة الخلية الآليات التي تعتمد على. من أجل دراسة ديناميات دورة الخلية أو الخلايا في مرحلة معينة من مراحل دورة الخلية، ومن المعتاد لمزامنة الخلايا. ومع ذلك أساليب التزامن يمكن أن يكون لها آثار ضارة على خلايا التي تجري دراستها، يحتمل أن يفند النتائج التي تم الحصول عليها. 1 تحليل الآونة الأخيرة استخدام البروتينات الموسومة fluorescently التي تكون موجودة إلا في مر....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم الليمفاوي خط خلية سرطان الدم الحاد NALM6 لكن يمكن تطبيقها على أنواع الخلايا الأخرى.

1. حلول والكواشف

  1. كامل RPMI
    1. إضافة 56 مل مصل العجل الجنين (FCS) و 5.5 مل من 200 ملي L-الجلوتامين لزجاجة 500 مل من المتوسط ​​RPMI-1640.
  2. BrdU محلول المخزون

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ويمكن استخدام هذه المنهجية للحصول على مجموعة من المعلومات. وترد عدد قليل من الطلبات هنا.

    تقييم مدة دورة الخلية

    لتحديد الوقت اللازم للخلايا إلى المرور عبر دورة الخلية، ويتم حصاد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة بعد نبض BrdU. الفواصل بين التقييمات يمكن تكييفها لخلايا معينة يجري تحليلها. كانت خطوط الخلايا المكونة للدم تقييم كل ساعة على مدى فترة 24 ساعة.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    القدرة على تحليل دورة الخلية هي مهمة لفهم بيولوجيا السرطان وآلية عمل كل من المخدرات والجينات التي تؤثر على تكاثر الخلايا والنمو. في حين أن هناك العديد من المقايسات التي يقال قياس تكاثر الخلايا، فإن الغالبية لا توفر سوى مقياس يشير إلى خلايا العدد الحالي. وتشمل هذه المقايسات التي تقيس عدد الخلايا التي تصور المباشر والعد، والنشاط الأيضي أو تركيز ATP. والميزة الرئيسية لكثير من هذه الأساليب هي أنها سهلة نسبيا لأداء وقابلة للصيغ صفيحة ميكروسكوبية والأتمتة، مما يجعلها مفيدة لفحص أعداد كب.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    تم تمويل العمل من قبل جمعية سرطان الدم والأورام اللمفاوية في الولايات المتحدة الأمريكية (6105-08) ، ومنحة مجلس السرطان في نيو ساوث ويلز (13-02) ، وزمالة NHMRC البحثية العليا (LJB) (1042305) ومنحة المشروع (1041614).

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    يحتوي 552598 APC BrdU FlowBD Biosciencesعلى أجسام مضادة BrdU و 7-AAD و BD Cytofix / Cytoperm
    Buffer (يشار إليها باسم Fixation Buffer)
    Cytoperm Permeabilization Buffer PlusBD Biosciences561651يشار إليها باسم المخزن المؤقت
    BD Perm / WashBD Biosciences554723يشار إليها باسم Wash buffer
    DNaseSigmaD-4513
    BD Falcon 12 × 75   مم أنابيب FACSBD Biosciences352008
    BD Pharmingen Stain BufferBD Biosciences554656
    BD LSR FORTESSA مقياس التدفق الخلويBD BiosciencesFORTESSA
    PipetmanGilsonP2 ، P20 ، P100 ، P1000
    RPMI 1،640 w / o L-Gln 500 ملLonza12-167F
    DPBSLonza17-512F
    مصل الأبقارالجنينبيوتيكFBS-7100113
    L-GlutamineSigmaG7513-100ML
    5-Bromo-2 & prime ؛ -deoxyuridineSigmaB5002-1G
    Falcon TC 150  ؛ سم2 قوارير تنفيسBD Biosciences355001
    Pipettes 25  ملGreiner760180
    Aersol Pipettes 200  ومايكرو. لInterpath24700
    ماصات Aersol 1   ؛ ملInterpath24800
    جهاز طرد مركزيSpintronGT-175R
    CO2< / sub> حاضنةBinderC 150
    AF488 مضاد للهيستون H3 Phospho (Ser10) إشارات خلايا الأجسام المضادة9708S
    Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) إشاراتخليةmAb 2197S
    Phospho-Chk1 (Ser345) ( 133D3)خليةmAb 2348S
    NALM6 & nbsp ؛DSMZACC-128
    Kit BD Buffer الأرانب إشارات الأرنب

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
    2. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
    3. Harper, J. W., Elledge, S. J.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Cell Cycle ProgressionFlow CytometryBrdU UptakeS Phase TrackingCell Cycle AnalysisDNA SynthesisCell SynchronizationProtein ExpressionCheckpoint ActivationCell Death

    Related Articles