مقالة منهجية

تصميم وبناء الاصطناعي خارج الخلية مصفوفة (aECM) والبروتينات من الإشريكية القولونية للبشرة هندسة الأنسجة

DOI:

10.3791/52845

⸱

يونيو 11, 2015

 ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
مكنت تقنيات

المؤتلفة مصممي المواد من إنشاء بروتينات اصطناعية جديدة بوظائف مخصصة لتطبيقات هندسة الأنسجة. على سبيل المثال ، يمكن تصميم بروتينات المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية لدمج المجالات الهيكلية والبيولوجية المشتقة من ECMs الأصلية. هنا ، نصف بناء وتنقية بروتينات aECM التي تحتوي على تكرارات تشبه الإيلاستين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية المؤتلف هي منصة متعددة الاستخدامات لإنشاء بروتينات اصطناعية جديدة بخصائص قابلة للضبط. على مدى العقد الماضي ، تم الإبلاغ عن العديد من البروتينات الاصطناعية التي تضمنت مجالات وظيفية مشتقة من الطبيعة (أو أنشأت دي نوفو). على وجه الخصوص ، تم تطوير بروتينات المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية (aECM). تتكون بروتينات aECM هذه من مجالات بيولوجية مأخوذة من الفيبرونكتين واللامينين والكولاجين ويتم دمجها مع المجالات الهيكلية بما في ذلك التكرارات الشبيهة بالإيلاستين وتكرارات الحرير والكولاجين. حتى الآن ، تم التحقيق في بروتينات aECM على نطاق واسع للتطبيقات في هندسة الأنسجة وإصلاح الجروح. في الآونة الأخيرة ، طور Tjin وزملاؤه بروتينات aECM خاصة بالإنتجرين مصممة لتعزيز ارتباط الخلايا الكيراتينية بجلد الإنسان وانتشارها. في عملهم ، تشتمل بروتينات aECM على مجالات ربط الخلايا المأخوذة من الفيبرونكتين واللامينين 5 والكولاجين الرابع ، بالإضافة إلى التكرارات الشبيهة بالإيلاستين. لقد أظهروا أن بروتينات aECM التي تم تطويرها في عملهم كانت مرشحة واعدة لاستخدامها كركائز في الجلد الاصطناعي. هنا ، نوضح تصميم وبناء بروتينات aECM بالإضافة إلى عملية تنقيتها باستخدام خصائص الإيلاستين المستجيبة للحرارة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لعدة عقود ، تم استكشاف كل من المواد الاصطناعية والطبيعية لاستخدامها كسقالات في هندسةالأنسجة 1،2. في حين أن المواد الاصطناعية مثل البوليمرات توفر سلامة هيكلية ممتازة وخصائص ميكانيكية قابلة للضبط ، إلا أنها غالبا ما تحتوي على نشاط حيوي غير كاف لتعزيز نمو الأنسجة وتسللها. من ناحية أخرى ، تتمتع المواد الطبيعية مثل بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) بنشاط بيولوجي ممتاز ، ولكن لها قيود مثل التباين من دفعة إلى أخرى ، والتدهور السريع ومشاكل المناعة. على هذا النحو ، فإن البروتينات المؤتلفة مرغوبة ، حيث يمكن تصميمها لتقليد الخصائص المرغوبة للبروتينات الأصليةفقط 3،4.

اكتسبت هندسة البروتين المؤتلف < p class = 'jove_content'> اهتمامات واسعة النطاق كمنصة متعددة الاستخدامات لتصميم وإنتاج البوليمرات الحيوية للبروتين الاصطناعي الجديد. من خلال التحكم في التسلسل الجيني ، يمكن تصميم وظائف البروتينات الاصطناعية لمجموعة متنوعة من التطبيقات5،6. على وجه الخصوص ، يمكن تصميم بروتينات المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية (aECM) ليكون لها وظائف متعددة للتطبيقات في هندسة الأنسجة والتجديد وإصلاح الجروح2،7. والأهم من ذلك ، أن التقدم في تقنيات الاستنساخ والتنقية أدى إلى زيادة قابلية التوسع وخفض تكلفة تصنيع البروتينات المؤتلفة بشكل كبير. من الممكن إنتاج كميات كبيرة من البروتينات المؤتلفة بتكاليف إنتاج منخفضة اقتصادية للاستخدام في العيادة5.

< p class = 'jove_content'>تم تطوير بروتينات المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية لتطبيقات هندسةالأنسجة 8-11. على سبيل المثال ، Tirrell et al. صمم طعما وعائيا صغيرا القطر باستخدام بروتينات اصطناعية تحتوي على تسلسل فيبرونيكتين CS5 وتكرارات تشبه الإيلاستين (ELP-CS5). أظهروا أن الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) كانت قادرة على الالتصاق والنمو على هذهالمواد 12. قام البعض الآخر أيضا بدمج تسلسلات قصيرة نشطة بيولوجيا مأخوذة من الفيبرونكتين والكولاجين واللامينين والفيبرينوجين والفيترونكتين بالإضافة إلى المجالات الهيكلية التي تحاكي الإيلاستين والحرير العنكبوتي والكولاجين لإنشاء مجموعة متنوعة من بروتينات الاندماج10. أظهرت الأفلام المتشابكة السائبة المصنوعة من بروتينات aECM القائمة على الإيلاستين أيضا خصائص ميكانيكية مشابهة لتلك الموجودة في الإيلاستين الأصلي (تتراوح المقاييس المرنة بين 0.3-0.6 ميجا باسكال) 13. بعد ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن بروتينات aECM التي تحتوي على شظايا فيبرونيكتين أطول لتسريع التئام الجروح في المختبر بسبب زيادة تقاربات ربط الإنتجرين8.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير بروتينات ECM الاصطناعية الخاصة بالإنتجرين بواسطة Tjin وزملاؤهفي العمل 14. يحتوي كل بروتين aECM على مجال ربط الخلايا النشط بيولوجيا المأخوذ من مكونات ECM لجلد الإنسانالأصلي 2،7،15 ، مثل laminin-5 و collagen-IV و fibronectin. على سبيل المثال ، ثبت أن الإنتجرين α3Β1 يربط تسلسل PPFLMLLKGSTR الموجود في المجال الكروي لسلسلة laminin-5 alpha-3 3 (LG3) 16،17. في تقريرهم ، أظهروا أن الخلايا الكيراتينية للبشرة الأولية في جلد الإنسان تشرك بشكل تفضيلي إنتجرينات مختلفة للارتباط بكل بروتين من بروتينات aECM ، اعتمادا على نوع مجال ربط الخلايا الموجود.

تحتوي بروتينات aECM التي تمت مناقشتها في العمل الذي قام به Tjin et al. على مجالات شبيهة بالإيلاستين {(VPGIG) 2VPGKG (VPGIG) 2}8 تمنح مرونة تحاكي الخصائص الميكانيكية لجلد الإنسان. بالإضافة إلى ذلك ، فإن دمج بقايا اللايسين في التكرارات الشبيهة بالإيلاستين يزيد أيضا من قابلية ذوبان البروتين الكلية في المذيبات المائية. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل بقايا اللايسين أيضا كمواقع تشابكية لتسهيل تكوين أفلام aECM المتشابكة12. يسمح إدراج التكرارات الشبيهة بالإيلاستين في تسلسل بروتين aECM بتنقية البروتينات بسهولة عبر دورة الانتقال العكسي (ITC) 14. يخضع الإيلاستين لانتقال طور حاد وقابل للانعكاس عند درجة حرارة محددة تعرف باسم درجة حرارة المحلول الحرجة المنخفضة (LCST) أو درجة حرارة الانتقال العكسي (Tt) 18-20. تعتمد الإيلاستين والتكرارات الشبيهة بالإيلاستين مطابقات ملف عشوائية محبة للماء أسفل LCST وتصبح قابلة للذوبان في الماء ، بينما فوق LCST ، تتجمع الإيلاستين بسرعة في جزيئات بحجم ميكرون. هذه التحولات الطورية قابلة للعكس ، وبالتالي ، يمكن استغلالها للسماح بتنقية بروتينات aECM القائمة على الإيلاستين بسهولة عبر تقنية ITC21.

في هذا العمل ، أبلغنا عن إجراء معمم لتصميم وبناء وتنقية بروتينات ECM الاصطناعية التي تحتوي على مجالات ربط الخلايا النشطة بيولوجيا ، والتي يتم دمجها في تكرارات تشبه الإيلاستين. تم وصف عملية تصميم واستنساخ البلازميدات التي تشفر لتسلسلات الأحماض الأمينية لبروتينات aECM. تم تحديد الخطوات المتبعة لتنقية بروتينات aECM باستخدام ITC. أخيرا ، تمت مناقشة طرق تحديد نقاء بروتينات aECM التي تم الحصول عليها باستخدام الرحلان الكهربائي SDS-PAGE و Western Blotting.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الاستنساخ المؤتلف البلازميدات ترميز لaECM البروتينات

  1. تصميم تسلسل الأحماض الأمينية في المجال الوظيفي (على سبيل المثال، مجال ملزم الخلية ويكرر مثل الإيلاستين). تقييد مواقع تصميم المرافقة ينتهي من المجالات الوظيفية لتسهيل استخدام البرمجيات الحرة وفقا لتعليمات برمجيات الاستنساخ الفرعية (على سبيل المثال، http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). هنا، حدد تقييد مواقع فريدة غير موجودة في المجال الوظيفي لحصر الهضم إلى المواقع المقصودة. اختيار تقييد مواقع التي تظهر في موقع استنساخ متعددة (MCS) من ناقلات المضيف (على سبيل المثال، pET22b (+)) لاستنساخ الفرعي.
  2. عكس ترجمة تسلسل الأحماض الأمينية في تسلسل النوكليوتيدات باستخدام مواقع مجانية وفقا لتعليمات البرنامج. (على سبيل المثال، http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). هي الأمثل ضمان الكودونات لE. تستضيف القولونية.
  3. الجينات في المصالح يمكن أن يكون الشرائيةأليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل إد تجاريا واحدة كما (أي إذا كان أليغنوكليوتيد] <100 زوج قاعدي (بي بي)) وأداء الصلب الحمض النووي (راجع الخطوة 1.4) للحد من التكاليف. على خلاف ذلك، لجينات أكبر من 100 سنة مضت، يمكن شراؤها من خلال الشركات التجارية.
  4. الصلب DNA من أليغنوكليوتيد]
    1. يصلب oligomers DNA للحصول على تسلسل الجين المطلوب. حل [أليغنوكليوتيد DNA في منطقة عازلة قليل وحدات الحمض النووي (10 ملي تريس: 2-الأمينية-2- (hydroxymethyl) -propan-1،3-ديول، ودرجة الحموضة 8.0 وتصفيتها) إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
    2. إضافة 4 ميكرولتر من كل قليل وحدات إلى 32 ميكرولتر من العازلة الصلب DNA (10 ملي تريس، 100 ملي كلوريد الصوديوم و 100 نانومتر MgCl 2) لتحقيق ما مجموعه 40 ميكرولتر خليط.
    3. غلي كوب من الماء باستخدام موقد وتزج الخليط لمدة 5 دقائق، 95 ° C. إزالة كوب ويبرد تدريجيا كامل أنشئت في مربع الستايروفوم O / N. تم مطوع وoligomers ونحن على استعداد لعملية الهضم.
  5. إضافة أنزيمات التقييد المقابلة لهضم oligomers صلب (أي، ويشار إلى إدراج) وناقل مضيف (أي pET22b (+)) بشكل منفصل. استخدام الوصفة التالية (1-2 ميكروغرام من الحمض النووي، 2 ميكرولتر من كل انزيم التقييد، 5 ميكرولتر من 10X تقييد عازلة الانزيم، والمياه تصل إلى ما مجموعه مزيج 50 ميكرولتر) لمدة 3-4 ساعة عند 37 ° C.
    ملاحظة: pET22b (+) ناقلات بلازميد هو الأمبيسلين المقاومة للمضادات الحيوية، ويحتوي على-6X صاحب العلامة في محطة سي. و6X-صاحب العلامة الموجودة في pET22b (+) يسمح لنا لاستخدام الموسومة صاحب الأجسام المضادة للتعرف على البروتين المستهدف عبر النشاف الغربي في الخطوة 7.
  6. إضافة 6X صبغ التحميل لكل خليط الهضم. تشغيل مخاليط الهضم بما في ذلك بشكل منفصل سلم DNA على 1،2٪ الاغاروز المواد الهلامية التي تحتوي على الحمض النووي DNA وصمة عار للأشعة فوق البنفسجية الفلورسنت لمدة 1 ساعة على 100 V. تصور 1.2٪ DNA agarose هلام مع إضاءة ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  7. شريحة هلام لاستخراج منتجات DNA هضم باستخدام أدوات تنقية جل التجاري. Elutالبريد باستخدام الحد الأدنى من حجم عمود لتحقيق تركيز الحمض النووي الحد الأدنى من 50-100 نانوغرام / ميكرولتر.
  8. الجمع بين هذا الجين من الاهتمام بالتسلسل ligating إدراج DNA هضمها (مثل الإيلاستين يكرر أو خلية ملزم المجالات التي حصلت عليها الصلب DNA) في ناقلات البلازميد باستخدام T4 يغاز استخدام الوصفة التالية: (2 ميكرولتر من ناقلات، 1 ميكرولتر من T4 يغاز، 1.5 ميكرولتر من T4 العازلة الربط، س ميكرولتر من إدراج، 10.5-X ميكرولتر الماء لمجموع مزيج 15 ميكرولتر). احتضان الخليط ربط في RT لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: التركيز المولي ناقلات لادخال ينبغي تعديلها لتحسين كفاءة الربط. حجم إدراج صفها بأنها x في صفة يعتمد على تركيز الحمض النووي مزال من الخطوة 1.7.
  9. ذوبان الجليد E. القولونية DH5α الخلايا المختصة كيميائيا (أو أي سلالة الاستنساخ) على الجليد. لوحات دافئ 2xYT أجار (الجدول 1) التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل) إلى 37 درجة مئوية.
  10. تحويل الخلايا باستخدامالحرارة صدمة:
    1. قسامة 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة في نظيفة، قبل المبردة أنابيب متناهية الصغر الطرد المركزي. ماصة 5 ميكرولتر (ما بين 100 إلى 100 خريج نانوغرام) من خليط ربط إلى الخلايا، pipetting بلطف صعودا وهبوطا لخلط. ترك الخليط على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    2. تزج الأنبوب الصغير الطرد المركزي التي تحتوي على خليط الخلية في 42 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة، وعاد إلى على الجليد لمدة 2 دقيقة. الزمنية مدة الغمر لتقليل الضرر الحرارة إلى الخلايا.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام SOC (الجدول 1) في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 1 ساعة.
    4. نشر 50 500 ميكرولتر من الخليط خلية / ربط على لوحة أجار 2xYT الذي تم قبل استعد لRT، التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل)، واحتضان لوحات رأسا على عقب عند 37 درجة CO / N (12-16 ساعة) .
  11. في اليوم التالي، واختيار المستعمرات DNA من لوحة أجار باستخدام نصائح ماصة نظيفة. تنمو المستعمرات في 5 مل من 2YT وسائل الإعلام (الجدول 1) التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل) O / N عند 37 درجة CO / N (12-16 ساعة) مع اهتزاز (225 دورة في الدقيقة).
  12. في اليوم التالي، واستخدام عدة البلازميد العزلة لاستخراج البلازميدات DNA لكل مستعمرة التقطت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل الحمض النووي مع 50 ميكرولتر من الماء.
  13. إجراء اختبار هضم مع الانزيمات تقييد استخدام الوصفة التالية: (DNA 5 ميكرولتر 0.2 ميكرولتر من كل انزيم التقييد، 1 ميكرولتر 10X تقييد العازلة انزيم وأعلى حتى الماء لمجموع مزيج 10 ميكرولتر)، واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية للكشف عن المستعمرات التي تحتوي على الأرجح إدراج وتعمل على 1،2٪ هلام الاغاروز DNA كما في الخطوة 1.6.
    ملاحظة: عند الهضم، وربط الناجح يجب النتائج في شريطين، واحد لكل من النواقل وإدراج والتي تتوافق مع الوزن الجزيئي لكل منهما (الشكل 1).
  14. إرسال المستعمرات المحتمل لتسلسل الحمض النووي باستخدام T7 المروج إلى الأمام والاشعال على التعاقب التجارية عكس.

معشوقة = "jove_title"> 2. التحول المؤتلف البلازميد إلى الجرثومي التعبير المضيف

  1. من النتيجة التسلسل، حدد مستعمرة الذي تم ligated بنجاح واستخدام البلازميد الحمض النووي للتحول إلى E. المضيف التعبير القولونية.
  2. ذوبان الجليد E. القولونية سلالة التعبير (BL21 (DE3) pLysS) على الجليد. وفي الوقت نفسه، لوحات أجار الحارة التي تحتوي على الأمبيسلين (25 ميكروغرام / مل)، والكلورامفينيكول (34 ميكروغرام / مل) إلى RT.
    ملاحظة: البلازميد pLysS موجودة في البكتيريا سلالة BL21 (DE3) pLysS يحتوي على الجينات المقاومة الكلورامفينيكول. يحتوي البلازميد pLysS على كاظمة الجينات T7 وهو ما يعبر عنه بشكل جوهري للحد من التعبير المتسرب من البروتين aECM. الكلورامفينيكول ضروري لتحديد للبكتيريا الخلايا التي تحتوي على pLysS خلال الثقافة.
  3. كرر الخطوة 1.10 للحصول على تحويل E. خلايا القولونية التي هي على استعداد للتعبير عن البروتينات الاصطناعية. التفاف لوحات أجار في Parafilm وتخزين رأسا على عقب في 4 6؛ C لمدة تصل إلى واحد.

3. التعبير البكتيرية من البروتينات aECM

  1. انظر الشكل 2، واختيار مستعمرة من لوحة أجار تحولت مع طرف ماصة وتطعيم إلى 10 مل من معقم رائع مرق (TB) وسائل الاعلام (الجدول 1) تحتوي على كل الأمبيسلين والمضادات الحيوية الكلورامفينيكول في أنبوب الاختبار. احتضان هذه الثقافة المبتدئين في 37 ° CO / N (12-16 ساعة) مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
  2. نقل 10 مل من ثقافة المبتدئين إلى 1 L سائل الإعلام TB جديدة ومعقمة تستكمل مع نفس المضادات الحيوية في قارورة 3 L مخروطي. احتضان الثقافة في 37 ° C مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 2-3 ساعة ومراعاة الكثافة البصرية للثقافة (OD 600) وصلت 0،6-0،8 قبل pipetting 1 مل من ثقافة إلى كوفيت فارغة للقراءة. حفظ 1 مل من ثقافة قبل الاستقراء لتوصيف SDS-PAGE.
    1. لقياس OD 600 من ثقافة الخلية، وإعداد 1 قنينة من وسائل الإعلام السل في كفيتلقياس فارغ. بشكل منفصل، ونقل 1 مل من ثقافة من قارورة الثقافة في كفيت جديدة فارغة. قياس الكثافة البصرية للثقافة استخدام الطيف ضد السيطرة فارغة في أحد الامتصاصية من 600 نانومتر.
    2. حفظ العينة (لاحقا تحليل SDS-PAGE) عن طريق نقل 1 مل من عينة الثقافة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 2 دقيقة، وصب طاف.
  3. حمل الثقافة مع الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى تركيز النهائي من 1 ملم واحتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 225 دورة في الدقيقة لساعة أخرى 4. حفظ 1 مل من ثقافة في نهاية الحث على 4 ساعات لتوصيف SDS-PAGE.
  4. حصاد الخلايا عن طريق تحويل الثقافة إلى 1 L زجاجات الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، تزن الكريات الخلايا و resuspend في TEN العازلة (1 M تريس، 0.01 M EDTA، 0.1 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة = 8.0) في 0.5 غرام / مل.

4. تحلل من الثقافات البكتيرية

  1. تجميد زراعة الخلايا إعادة علقت في -80 درجة CO / N. ذوبان الجليد في زراعة الخلايا المجمدة في حمام مائي عند RT أو على الجليد لليز الخلايا. إضافة 10 ميكروغرام / مل ديوكسي ريبونيوكلياز I (الدناز I)، 10 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A (ريبونوكلياز I)، و 50 ميكروغرام / مل phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF)، في حين الذوبان والتجانس الحل مع التحريك البطيء.
  2. بعد أن يتم إذابة جميع الخلايا معلق، وضبط حل لدرجة الحموضة 9.0 لزيادة ذوبانية البروتين في الماء 12. إضافة 6 قطرة N هيدروكسيد الصوديوم الحكمة مع التحريك على الجليد لتحقيق الاتساق متجانسة. ليز بسبب عرقلة بالموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة على الجليد باستخدام 2 مم طرف شقة، 5 ثانية النبض.
  3. أجهزة الطرد المركزي في حل الخلية في 12000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف لنقل نظيفة، وزجاجة فارغة وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تنقية في وقت لاحق.
  4. وفي الوقت نفسه، resuspend الكرية الخلية مرة أخرى مع TEN العازلة وإعادة التجميد في -80 ° C. إلىتحلل الخلية كاملة، تكرار تجميد / الذوبان وصوتنة العملية تصل إلى ثلاثة أضعاف. وفر 20 المحللة خلية ميكرولتر لتوصيف SDS-PAGE.

5. تنقية aECM البروتينات عن طريق معكوس الانتقال الدراجات

  1. جمع المحللة الخلية من الخطوة 4.3، والشروع في تنقية البروتينات aECM باستخدام ITC، مماثلة لتلك المستخدمة لتنقية البروتينات القائم على الإيلاستين 21. وسوف يتم دورات مع درجات حرارة مختلفة والتي هي 4 ° C (المشار إليها باسم "الباردة") و 37 ° C (المشار إليها باسم "الحارة") دورات على التوالي.
  2. تقسيم المحللة الخلية إلى 50 مل زجاجات الطرد المركزي، وأجهزة الطرد المركزي في 40000 x ج لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية. وينبغي أن يكون ظهور بيليه الخلية البني الداكن وتبدو سيلان.
  3. إزالة طاف بواسطة pipetting للحصول على فصل نظيف من بيليه. جمع طاف في زجاجات الطرد المركزي نظيفة وإضافة كلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 1 M (بحد أقصى 3 M). دافئالحل إلى 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع اهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: سيتم إضافة كلوريد الصوديوم تؤدي إلى الانتقال من عنصر الإيلاستين من دون التسبب تجميع aECM. وطاف تتحول العكرة. إذا كان تركيز بروتين عالية بما فيه الكفاية، يمكن أن ينظر البروتين رغوي الأبيض على الجانبين من القمقم أجهزة الطرد المركزي.
  4. أجهزة الطرد المركزي لطاف من الخطوة 5.3 في 40000 x ج لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. صب طاف. سحق بيليه باستخدام ملعقة معدنية و resuspend بت بيليه في الماء المقطر تعقيمها المثلج (50 ملغ / مل) مع التحريك القوي O / N عند 4 درجة مئوية باستخدام شريط مغناطيسي واللوحة. بيليه يجب أن تتفكك.
  5. كرر الخطوات من 5،2-5،4 لمدة ثلاث إلى خمس مرات أخرى للحصول على نقاء أعلى من البروتين.
  6. بعد دورة النهائية للتنقية، تحلية الحل البروتين dialyzing ضد الماء المقطر عند 4 درجات مئوية. Dialyze حل البروتين ضد الماء لمدة 2-3 أيام مع التغييرات في الماء كل 4ساعة أو 8 ساعات لO / N. وفر 20 ميكرولتر من البروتين النقي لSDS-PAGE ويجفد بقية البروتين النقي وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

6. توصيف aECM البروتينات عن طريق SDS-PAGE الكهربائي

  1. إعداد 12٪ هلام SDS-PAGE (إذا كان الوزن الجزيئي كبير، استخدم 8٪ الهلام SDS-PAGE للانفصال أفضل). إضافة 2X العازلة تحميل SDS على كل عينة، تسخين العينات لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية وتشغيل عينات على هلام لمدة 1 ساعة على 100 V أو حتى سلم البروتين الموافق الوزن الجزيئي للبروتين aECM تصل إلى منتصف هلام.
  2. استرداد جل من SDS-PAGE إعداد وإضافة Coomassie الأزرق اللامع وصمة عار (الجدول 2) مع وحدة لغمر هلام لمدة 1 ساعة في طبق بيتري. هلام شطف في حل destaining (الجدول 2) لمدة 5 دقائق على الكرسي الهزاز. تغيير الحل destaining، والاستمرار في يزيل اللون هلام مع هزاز حتى خلفية ركان جل يصبح واضحا. يجب أن تكون العصابات البروتين واضحة للعيان.
  3. مقارنة بين موقف البروتين المستهدف ضد السلم البروتين لتحديد الوزن الجزيئي للبروتين الهدف.
  4. لمزيد من تأكيد وجود البروتين المستهدف، نفذ النشاف الغربي كما في الخطوة 7.

7. توصيف aECM البروتينات عن طريق الغربية التنشيف

  1. تشغيل العينات على 12٪ هلام SDS-PAGE كما في القسم 6 مع أي تلطيخ.
  2. قطع غشاء النيتروسليلوز إلى حجم أكبر قليلا من هلام SDS-PAGE. قطع 4 قطع من ورق الترشيح لنفس الحجم.
  3. الرطب قطعة واحدة من ورق الترشيح مع نقل الغربي العازلة (20٪ ت / ت الميثانول، 25 ملي تريس، 190 ملي جليكاين، ودرجة الحموضة 8.3)، ووضع جل SDS-PAGE على رأس ورقة الترشيح، يليه آخر قطعة من ورق الترشيح ، ثم غشاء النيتروسليلوز والنهائية الأخرى قطعتين من ورق الترشيح. هي غارقة ضمان كامل مجموعة المتابعة مع كافية عازلة نقل الغربي.
    ملاحظة: يجب أن لا يكون جل وغشاء على اتصال في هذه المرحلة من الوقت والبروتينات يمكن ربط الغشاء عند الاتصال.
  4. نقل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز من خلال وضع ورقتين مرشح في وحدة نقل شبه الجافة الغربية، تليها غشاء النيتروسليلوز، ووضع بعناية جل SDS-PAGE داخل وعلى الغشاء، ضع أخيرا اثنين من ورقة الترشيح الرطب الأخيرة على هلام SDS-PAGE. تشغيل نقل الغربية في 45 مللي أمبير، 30 دقيقة. إضافة العازلة إذا الجهد هو أعلى من 30 V.
    ملاحظة: يفضل وضع جل SDS-PAGE على الغشاء مع محاولة واحدة وتجنب تحويل هلام لا داعي له على الغشاء كما بروتينات يمكن ربط الغشاء عند الاتصال.
  5. استرداد ومنع غشاء النيتروسليلوز مع عرقلة الحل (5٪ الحليب الخالي من الدسم في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة وتصفيتها مع ورقة فلتر) لمدة 2 ساعة على RT. التخلص من عازلة تمنع وإضافة PBS لشطف.
    ملاحظة: التغيير إلى قفازات جديدة لتجنب تلوث الغشاء مع المتواجد غير المرغوب فيهالإضافية.
  6. احتضان الأساسي لمكافحة صاحب الأجسام المضادة مع التخفيف في برنامج تلفزيوني في 1: 1000 في RT لمدة 1 ساعة مع هزاز. إعداد الخليط في حجم الذي يمكن أن يغرق الغشاء كله، على سبيل المثال، مع نسبة التخفيف 1: 1000، إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة (تركيز المخزون: 1 ملغ / مل) إلى 999 ميكرولتر PBS ل1 مل مجموع الخليط.
  7. شطف الغشاء مع 5 مل من PBST (PBS مع 0.1٪ Tween20).
  8. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى البيروكسيديز الحصان الفجل (HRP) مع التخفيف في برنامج تلفزيوني في 1: 5000 في RT لمدة 1 ساعة مع هزاز. إعداد الخليط في حجم الذي يمكن أن يغرق الغشاء كله، على سبيل المثال، مع نسبة التخفيف 1: 5000، إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة (تركيز المخزون: 1 ملغ / مل) إلى 4999 ميكرولتر PBS ل5 مل مجموع الخليط.
  9. يغسل الغشاء مع 5 مل من PBST وكرر مرتين.
  10. تطبيق الركيزة chemiluminescent إلى الغشاء مع حجم لتغطية الغشاء واحتضان باتباع الإرشادات لالركيزة المستخدمة.
    ملاحظة: حساسية الركيزة لكشف البروتين قد تختلف، ونحن نوصي ركيزة بأقصى قدر من الحساسية لإشارات منخفضة جدا في حالة زيادة تركيز الأجسام المضادة لا يزيد الإشارات.
  11. التقاط إشارات chemiluminescent باستخدام جهاز تصوير كاميرا CCD القائمة. ضبط نسبة الأجسام المضادة تخفيف الابتدائية والثانوية إذا إشارات ضعيفة وغير محددة. احتضان يعد في عرقلة الحل إذا إشارة الخلفية عالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في تصميم البروتينات الانصهار التي تحتوي على تكرار مثل الإيلاستين، فمن المهم للحفاظ على المحتوى الإيلاستين العام، جزء كبير بما فيه الكفاية من البروتين الانصهار 18. هذا هو التأكد من أن بناء البروتين الانصهار يحتفظ خصائص شبيهة الإيلاستين لها، من أجل استخدام ITC لتنقية. تم نقل aECM البروتينات تصميم وتسلسل وصفها في هذا القسم تحديدا من العمل من قبل Tjin وآخرون. (14). وفي هذا العمل، تم استنساخ ثلاثة بروتينات aECM بنجاح في pET22b (+) ناقلات التعبير. بدأت ربط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤتلف هندسة البروتينات هي تقنية متعددة لخلق مواد جديدة البروتين باستخدام نهج من أسفل إلى أعلى. ويمكن تصميم المواد القائمة على البروتين لديهم وظائف متعددة، مصممة خصيصا وفقا لطلب من الفائدة. نتيجة لزيادة التقدم في تقنيات الاستنساخ والبروتين التعبير، فقد أصبح من السهل نسبيا (وفعالة من حيث التكلفة) لخلق مجموعة متنوعة من البروتينات الاصطناعية بطريقة متكررة ومتدرجة. وقد أدرجت المجال مثل الإيلاستين في عدد من البروتينات الاصطناعية، لتكون بمثابة علامة التنقية، فضلا عن منح الخواص الميكاني...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أن نعترف التمويل من وزارة التربية والتعليم AcRF الفئة 1 (RG41) وبدء منحة من جامعة نانيانغ التكنولوجية. ويتم تمويل منخفضة وTjin من قبل منحة بحثية طالب (RSS) من جامعة نانيانغ التكنولوجية، سنغافورة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
pET22b (+)Novagen69744T7 مع مقاومة الأمبيسلين 
BL21(DE3)pLysS InvitrogenC6060-03مضادات حيوية إضافية - كلورامفينيكول
إيزوبروبيل بيتا دي ثيوغالاكتوسيد (IPTG)مخزون التكنولوجيا الحيوية الذهبيةI2481C1 M مع الماء المعقم ، يجعله طازجا قبل الحث.
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106طقم عزل البلازميد
T4 ligaseنيو إنجلاند بيولابسM0202S
أمبيسلينأفيميتريكس11259
كلورامفينيكولأفيميتريكس23660
Zymoclean & trade هلام طقم استعادة الحمض النوويZymo ResearchD4001
XL10-سلالةالذهبتقنيات Agilent200315
نواقل التعبير محلول

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Q., Liang, S., Thouas, G. A. Elastomeric biomaterials for tissue engineering. Prog Polym Sci. 38 (3-4), 584-671 (2013).
  2. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering - In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 352-366 (2011).
  3. Kushner, A. M., Guan, Z. Modular Design in Natural and Biomimetic Soft Materials. Angewandte Chemie International Edition. 50 (39), 9026-9057 (2011).
  4. Gagner, J. E., Kim, W., Chaikof, E. L. Designing protein-based biomaterials for medical applications. Acta Biomater. 10 (4), 1542-1557 (2014).
  5. Gomes, S., Leonor, I. B., Mano, J. F., Reis, R. L., Kaplan, D. L. Natural and genetically engineered proteins for tissue engineering. Prog Polym Sci. 37 (1), 1-17 (2012).
  6. Werkmeister, J. A., Ramshaw, J. A. M. Recombinant protein scaffolds for tissue engineering. Biomedical Materials. 7 (1), 012002(2012).
  7. MacNeil, S. Biomaterials for tissue engineering of skin. Materials Today. 11 (5), 26-35 (2008).
  8. Fong, E., Tirrell, D. A. Collective Cell Migration on Artificial Extracellular Matrix Proteins Containing Full-Length Fibronectin Domains. Advanced Materials. 22 (46), 5271-5275 (2010).
  9. Ratner, B. D., Bryant, S. J. BIOMATERIALS: Where We Have Been and Where We are Going. Annual Review of Biomedical Engineering. 6 (1), 41-75 (2004).
  10. Cai, L., Heilshorn, S. C. Designing ECM-mimetic materials using protein engineering. Acta Biomater. 10 (4), 1751-1760 (2014).
  11. Annabi, N., et al. Elastomeric recombinant protein-based biomaterials. Biochemical Engineering Journal. 77 (0), 110-118 (2013).
  12. Heilshorn, S. C., DiZio, K. A., Welsh, E. R., Tirrell, D. A. Endothelial cell adhesion to the fibronectin CS5 domain in artificial extracellular matrix proteins. Biomaterials. 24 (23), 4245-4252 (2003).
  13. Simnick, A. J., Lim, D. W., Chow, D., Chilkoti, A. Biomedical and Biotechnological Applications of Elastin-Like Polypeptides. Polymer Reviews. 47 (1), 121-154 (2007).
  14. Tjin, M. S., Chua, A. W. C., Ma, D. R., Lee, S. T., Fong, E. Human Epidermal Keratinocyte Cell Response on Integrin-Specific Artificial Extracellular Matrix Proteins. Macromolecular Bioscience. 14 (8), 1125-1134 (2014).
  15. MacNeil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
  16. Kariya, Y., et al. Differential regulation of cellular adhesion and migration by recombinant laminin-5 forms with partial deletion or mutation within the G3 domain of α3 chain. J Cell Biochem. 88 (3), 506-520 (2003).
  17. Shang, M., Koshikawa, N., Schenk, S., Quaranta, V. The LG3 module of laminin-5 harbors a binding site for integrin α3Β1 that promotes cell adhesion, spreading, and migration. J Biol Chem. 276 (35), 33045-33053 (2001).
  18. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Current Protocols in Protein Science. , 6.11.1-6.11.16 (2010).
  19. Keeley, F. Ch. 4. Evolution of Extracellular Matrix.Biology of Extracellular Matrix. , Springer. Berlin Heidelberg. 73-119 (2013).
  20. Le, D. H. T., et al. Self-Assembly of Elastin-Mimetic Double Hydrophobic Polypeptides. Biomacromolecules. 14 (4), 1028-1034 (2013).
  21. MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), e51583(2014).
  22. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS Page

مقالات ذات صلة