مقالة منهجية

A طريقة لإسكات العصبية عن بعد آخر في القوارض وخلال مراحل متقطعة التعلم

DOI:

10.3791/52859

⸱

يونيو 22, 2015

 , 
1Department of Neuroscience, Oberlin College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية إسكات النشاط العصبي مؤقتا وعن بعد في مناطق الدماغ المنفصلة أثناء مشاركة الفئران في مهام التعلم والذاكرة. يجمع النهج بين علم الوراثة الدوائية (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) مع النموذج السلوكي (التكييف الحسي) المصمم للتمييز بين المكونات المختلفة للتعلم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيف مؤقتا وبعد لإسكات نشاط الخلايا العصبية في مناطق الدماغ منفصلة في حين تشارك الحيوانات في مهام التعلم والذاكرة. يجمع بين النهج الدوائي (مصمم-مستقبلات حصريا المنشط تلو مصمم المخدرات) مع النموذج السلوكي (شروط مسبقة الحسي) التي تم تصميمها للتمييز بين أشكال مختلفة من التعلم. على وجه التحديد، ويستخدم تسليم الفيروسية التي تتوسط للتعبير عن مستقبلات المعدلة وراثيا المثبطة G-البروتين يقترن (مصمم مستقبلات) إلى منطقة الدماغ منفصلة في القوارض. بعد ثلاثة أسابيع، عندما تكون مستويات التعبير مصمم مستقبلات مرتفعة، ويدير وكيل الدوائي (مصمم المخدرات) بشكل منتظم 30 دقيقة قبل جلسة سلوكية محددة. المخدرات قد تقارب لمستقبلات مصمم وبالتالي يؤدي إلى تثبيط الخلايا العصبية التي تعبر عن مستقبلات مصمم، بل هي على خلاف ذلك خاملة بيولوجيا. منطقة الدماغ لا يزال إسكات لمدة 2-5 ساعة (depenقرع على الجرعة وطريقة التعاطي). عند الانتهاء من النموذج السلوكي، ويتم تقييم أنسجة المخ لوضع الصحيح ومستقبلات التعبير. هذا النهج هو مفيدة بشكل خاص لتحديد مساهمة من مناطق الدماغ الفردية لعناصر محددة من السلوك، ويمكن استخدامها عبر أي عدد من النماذج السلوكية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديا مثيرا في مجال علم الأعصاب السلوكي هو تحديد ركائز العصبية من السلوكيات المعقدة. وقد تم استخدام عدد من التقنيات مثل الآفات دائمة، تعطيل الدماغ مؤقت عن طريق زرع حقنة عادية وoptogenetics للتعرف على مساهمات من مناطق الدماغ منفصلة لفرعية من السلوكيات المعقدة. في حين أن هذه النهج إبلاغ فهمنا لخصوصية الإقليمية خلال التعلم، كل تقنية ليست دون قيود. على وجه التحديد، وعادة ما تجرى الآفات دائمة قبل الاختبار السلوكي، وبالتالي آثارها موجودة طوال مدة النموذج. دراسات كيفية تركيب الكانيولا التي تنطوي على عرض لinactivator العصبي على المدى القصير (على سبيل المثال، سم الأسماك الرباعية الأسنان) يمكن أن تنتج أضرار كبيرة في أنسجة المخ ويمكن أن تحدث التوتر في المواضيع فقط قبل الاختبار السلوكي. وعلاوة على ذلك، من خلال تعطيل إقناء؛ إدخال القنية يقتصر على المنطقة من الأنسجة التي تحيطغيض من حقنة عادية. وأخيرا، في حين optogenetics يقدم مجموعة من المرونة من أجل السيطرة الزمنية للنشاط في مناطق محددة في الدماغ، فمن باهظة التكلفة وتطلبا من الناحية الفنية.

هذه القيود يمكن التغلب عليها باستخدام نهج pharmacogenetic (مصمم-مستقبلات المنشط حصريا على حدة مصمم المخدرات، DREADDs) 1،2. الأهم من ذلك، في حين أن مفهوم علم الوراثة الدوائي هو متطورة، وتنفيذ أسلوب واضح ومباشر. على غرار الأساليب الجراحية التجسيمي التقليدية التي تنطوي على ضخ السم (على سبيل المثال، NMDA، حمض ibotenic) في مناطق الدماغ منفصلة، ​​وهذا الأسلوب ينطوي على غرس فيروس الغدة المرتبطة (AAV) الذي يحتوي على جزء DNA لمستقبلات تعديل المثبطة G-البروتين يقترن (hM4Di، ومستقبلات مصمم) في المنطقة من اهتمام من القوارض المختبرية القياسية (انظر الشكل 1). يحتوي على ناقلات فيروسية أيضا مراسل فلوري (mcitrine). مرة واحدة مسجلة فيإلى الخلايا، ومستقبلات مصمم (والبروتين مراسل) يتم التعبير عن الحد الأقصى ~ 3 أسابيع بعد الحقن ويمكن تفعيلها بشكل انتقائي لمدة 2-5 ساعة من قبل الإدارة الشاملة للمصمم المخدرات غير ذلك خاملة بيولوجيا، كلوزابين-N-أكسيد (CNO) 1 (3). لأن وهبت المجرب مع دقيقة، بعد جهاز التحكم عن بعد الزمنية على النشاط العصبي في مناطق محددة في الدماغ، علم الوراثة الدوائي يجمع بشكل جيد مع النماذج السلوكية التي تجرى على مراحل متعددة. في هذا المثال، مساهمة من القشرة خلف الطحال (RSC) إلى التحفيز التحفيز تتم مقارنة التعليمية لدورها في التعلم بافلوف، ولكن هذا الجمع بين النهج مناسب تماما إلى أي عدد من الأسئلة التي تسعى إلى تحديد كيفية معينة تساهم مناطق الدماغ ل سلوك معقد.

بالإضافة إلى ذلك، في حين لم توصف في هذا البروتوكول، والنهج الفيروسية والمعدلة وراثيا يمكن استخدامها لتحقيق الخلية نوع معين DREADD التعبير 2. بما انيالصورة الكامنة في النماذج السلوكية التي تنطوي على أنواع الدوائية و / أو غيرها من التلاعب التجريبية، دراسة متأنية من التصميم التجريبي والتحليل الكمي لاحق مطلوب عند إستخدام أسلوب DREADD. ويشار إلى المجربون جديد إلى نهج DREADD إلى مراجعة شاملة لتكنولوجيا DREADD الحالية 2.

كل يوم، الكائنات تعلم حول المحفزات وأحداث جديدة وعلاقاتهم مع بعضهم البعض. حتى في بيئة مألوفة، مثل المنزل، هو واحد سريع للكشف عن تغيرات في العلاقات بين المثيرات لأن هذه التغيرات قد تكون التنبؤية للأحداث ذات مغزى. هذا التحفيز التحفيز (أي العلائقية) التعلم ينطوي على نحفظ من المحفزات متعددة وتقليديا يرتبط الحصين، الذي يقيم مركزيا في الفص الصدغي وسطي 4. ومع ذلك، لا توجد الحصين ولا تعمل في عزلة. المناطق القشرية داخل وخارج على حد سواءجانب من الفص الصدغي وسطي توفير المعلومات الحسية حاسمة لتشكيل الحصين 5-7. وتوفر دراسات التقليدية الآفة دائمة أدلة دامغة على تورط عدد من المناطق القشرية (مثل القشور خلف الطحال، postrhinal والمخية الأنفية الداخلية) في التعلم المعتمد على الحصين لكنها محدودة في قدرتها على تمييز دور منطقة معينة خلال مراحل منفصلة من تعلم 10/08.

هذا البروتوكول باختبار فرضية أن RSC من الضروري للتعلم التحفيز التحفيز بإسكات RSC خلال مرحلة واحدة من 3 مراحل شروط مسبقة الحسي النموذج 11،12. لفترة وجيزة، الفئران تتلقى دفعات من AAV التي تحتوي على مستقبلات مصمم و~ 3 أسابيع في وقت لاحق تدار المصمم المخدرات (CNO) 30 دقيقة قبل بدء الاختبار السلوكي. في هذا البروتوكول، فئران التجارب تتلقى CNO خلال المرحلة الأولى من اختبار (عندما لير التحفيز التحفيزنينغ يحدث) وأنها تتلقى السيارة خلال المراحل القادمة 2 من الاختبار. للسيطرة على الآثار غير المقصودة من CNO على السلوك، ولبث الفئران مع المصمم مستقبلات (hM4Di) وحقن مع السيارة بدلا من CNO. لحساب الآثار العامة من ضخ الفيروسي ومستقبلات التعبير، ولبث فيروس التحكم التي لا تحتوي على مستقبلات مصمم وإدارة CNO.

ويستخدم عدد من الأنماط المصلية مختلفة من AAV لتقديم المادة الوراثية. المبادئ التوجيهية الحالية NIH للبحوث إشراك المؤتلف أو الجزيئات الاصطناعية تؤكد أن AAV (جميع الأنماط المصلية) ويبني AAV المؤتلف أو الاصطناعية، والتي التحوير لا ترميز إما منتج جيني يحتمل أن يكون مكون للأورام أو جزيء السموم وتنتج في حالة عدم وجود فيروس المساعد، تتطلب BSL-1 الاحتياطات (مجموعة الملحق B-1. المخاطر 1 (RG1) وكلاء) 13. تتوفر 14،15 عدد من الاستعراضات المتعلقة بنية AAV، والمرافق والسلامة. والجدير بالذكر، على الرغم من، بسبب مخاوف تتعلق الممكنة والمحتملة 16،17 الآليات المسببة للسرطان الإنجابية 18-20 في القوارض وبعض المؤسسات تتطلب استخدام BSL-2 الاحتياطات عند العمل مع AAV. التحقق من BSL المناسب قبل استخدامها من خلال التشاور مع لجان الرقابة في المؤسسات الفردية حيث سيتم إجراء البحوث، ومراكز السيطرة على الأمراض والمبادئ التوجيهية NIH للبحوث إشراك المؤتلف DNA الجزيئات 13 عند استخدام ناقلات فيروسية للتلاعب الجيني في الولايات المتحدة. يتم تحديد الحماية الشخصية، والتدريب محقق، ناقلات الاحتواء، وإزالة التلوث، والتخلص من المواد تطهيرها، وبعد حقن الحيوان متطلبات السكن من خلال هذه المبادئ التوجيهية. وبالإضافة إلى ذلك، يجب استشارة والمتابعة المناسبة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية لجنة أو المبادئ التوجيهية لجنة الرقابة المؤسسية تعادل لضمان سلامة التعامل والإدارة والتخلص من AAV.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على استخدام الحيوانات من قبل كلية أوبرلين رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم اللجنة، وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية 21.

1. إعداد لتسريب الفيروسي

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول BSL-1 الاحتياطات. عندما توظف BSL-2 الاحتياطات، معطف المختبر القابل للتصرف، والقفازات، ويغطي الحذاء، حماية العين وجهاز تنفس الجسيمات (نوع N95) مطلوبة. يجب أن تناسب جميع الأفراد التعامل مع BSL-2 مركبات اخضعت للاختبار للجهاز للتنفس الصناعي الجسيمات من قبل وكالة الصحة العامة المحلية. الرجوع إلى لوري وMajewska (2010) 22 للحصول على تفاصيل إضافية عن مناولة وتخزين ناقلات فيروسية.

  1. عند الاستخدام الأول، قسامة وتخزين الفيروس غير المستخدمة في 20 أنابيب microcentrifuge ميكرولتر لتجنب تكرار التجميد والذوبان.
  2. إعداد سطح العمل عن طريق إزالة أية كائنات غير الضرورية وتعقيم السطح مع 70٪ من الإيثانول. إعداد 10٪ محلول التبييض لإزالة التلوث من النفايات AAV. وضع كوب كامل من محلول التبييض ومعقمة 10 ميكرولتر حقنة على سطح العمل. وضع أنبوب microcentrifuge مع AAV في وعاء مع الثلج المجروش أثناء الإعداد.
  3. وضع أنبوب microcentrifuge مع الفيروس في مقعد نائب القياسية. تحميل حقنة 10 ميكرولتر مع لا يقل عن 4 ميكرولتر من AAV. الحرص على عدم ثني غيض من حقنة ضد الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge أثناء التحميل. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في 4 ميكرولتر من محلول AAV في المحقنة.
  4. التخلص من الأنبوب فيروس فارغة في دورق يحتوي على 10٪ مواد التبييض. تخزين الأجزاء غير المستخدمة من الفيروس كما هو محدد من قبل المورد.
  5. إضافة إضافية التبييض 10٪ إلى حاوية النفايات، والسماح النفايات على الجلوس لمدة 30 دقيقة قبل التخلص من المخلفات السائلة تطهير.
  6. التخلص من جميع معدات الوقاية والنفايات البلاستيكية في حاوية واقية وفقا لتعليمات المبادئ التوجيهية المؤسسية. ديكوntaminate أي معدات أو الأسطح التي جاءت في اتصال مع الفيروس باستخدام المبيض بنسبة 10٪.

2. جراحة

  1. إعداد المنطقة الجراحية عن طريق وضع ورقة ماصة مقاعد البدلاء تحت جهاز التجسيمي وعلى مساحة مجاورة تسمى منطقة معالجة فيروس مخصصة.
    1. وضع حاوية النفايات التبييض 10٪ في مجال التعامل مع فيروس مخصصة بالقرب من جهاز جراحي.
  2. لحث على مستوى ثابت من التخدير وإعداد الفئران لإجراء عملية جراحية.
    1. وضع الفئران في غرفة الاستقراء التي تحتوي على خليط من الغاز الأيزوفلورين (مجموعة من 1-3٪) والأكسجين (100٪ في حوالي 1 لتر / دقيقة) حتى يكون هناك فقدان الوعي وقلة الحركة هادفة الإجمالية. الحفاظ على التخدير الأيزوفلورين طوال العملية الجراحية.
    2. بعد تحقيقه 6 التخدير العميق، حلق الفئران من بين العينين إلى قليلا خلف الأذنين.
    3. وضع الفئران مرة أخرى إلى غرفة الاستقراء ل1-3 دقيقة إضافية.
    4. تأكد من توصيل النظام التخدير الأيزوفلورين إلى مخروط الأنف من جراحة التجسيمي. فتح محبس على أنابيب الأيزوفلورين لبدء تدفق الأيزوفلورين إلى stereotax. الحفاظ على الأيزوفلورين والأوكسجين في المستويات المحددة أعلاه.
    5. وضع الفئران في جهاز التجسيمي من خلال تأمين الفم على شريط لدغة وتأمين القضبان الأذن.
    6. تطبيق مواد التشحيم العين للعيون وbetadine إلى موقع الجراحية قبل شق.
  3. جعل 2.4 سم خط الوسط شق الجلد على السطح الظهري للجمجمة بدءا حوالي 2 ملم الذيلية للعيون. سحب الجلد لفضح الجمجمة. دوري غرس العقيمة المالحة عقيمة 0.9٪ على هامش موقع الجراحية لمنع الأنسجة من التجفيف.
  4. نسيج غشائي واضحة من الجمجمة حتى bregma وامدا هي واضحة للعيان.
  5. تأكد من أن الجمجمة هو مستوى خلال قياس الإحداثيات الظهري البطني فيbregma وعلى امدا. ضبط الجهاز التجسيمي وفقا لذلك حتى الإحداثيات الظهري البطني في bregma وامدا تختلف بما لا يزيد عن 0.04 مم.
  6. في هذا الوقت، والحد من الغاز الأيزوفلورين إلى ما بين 2 و 2.5٪.
  7. عودة التدريبات إلى bregma، rezero الإحداثيات ومن ثم نقل الحفر إلى المطلوب وسطي-الجانبي والأمامي الخلفي تنسيق.
  8. حفر حفرة في تنسيق باستخدام 0.9 مم مثقاب كما أنها تنتج ثقب الحجم المناسب ل28 G ضخ حقنة.
  9. ضبط مضخة التسريب لتسليم فيروس بمعدل 0.2 ميكرولتر / دقيقة. وضع حقنة في الذراع ضخ الجهاز التجسيمي وخفض الحقنة في المطلوب تنسيق. تسليم المبلغ المطلوب من فيروس (تتراوح 0،1-0،8 ميكرولتر). على سبيل المثال، تقديم 0.8 ميكرولتر من AAV أكثر من 4 دقيقة.
    ملاحظة: إجراء دراسات تجريبية لتحديد حجم ضخ مثالي ونموذجي انتشار الفيروس في كل منطقة من الفائدة.
    1. بعد تسليم الفيروس المشتركmplete ترك الحقنة في مكان لمدة 10 دقيقة لمنع ارتجاع في المسالك الإبرة. رفع ببطء الحقنة بمعدل حوالي 5 مم / دقيقة. كرر حتى تم غرست جميع الإحداثيات مع AAV.
  10. إغلاق الجرح باستخدام الدبابيس الجراحية ومعطف الجرح مع مرهم مضاد حيوي موضعي.
  11. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية لإدارة الألم بعد العمليات الجراحية.
  12. وضع الفئران في قفص مع الفراش، وغطاء واللافتات المناسبة والعودة الفئران على منشأة الحيوان.
    1. إذا كان يعمل تحت BSL-2 الاحتياطات، وجمع الفراش لفترة من الوقت (عادة 48-72 ساعة) المحدد من قبل الإرشادات المؤسسية. وضع الفراش في وعاء نفايات بيولوجية.
    2. التخلص من كل المواد الملوثة AAV كما هو محدد من قبل الإرشادات للتخلص الآمن منها.

3. جهاز السلوكي

ملاحظة: يتكون الجهاز الحسي شروط مسبقة من معيار هواء فعال تكييف شامنوفمبر (12 "ل س 9.5" W X 11.5 "H) مع المقاوم للصدأ الطابق شبكة الصلب، 2 الجوانب زجاجي و 2 الجدران المعدنية.

  1. جبل الضوء 2.8 W على أحد الجدران الألومنيوم لتكون بمثابة ضوء البيت وكما التحفيز البصري عندما تومض في 2 هرتز. جبل أحد المتحدثين في الغرفة لتقديم المحفزات السمعية (10 ثانية و 1500 هرتز، 78 ديسيبل لهجة نقية و 10 ثانية 78 ديسيبل من الضوضاء البيضاء).
    1. استخدام قادوس الغذاء لتسليم 45 الكريات الغذائية ملغ في كوب الغذاء. داخل كوب الغذائية، الخلايا الضوئية بالأشعة تحت الحمراء للكشف عن إجمالي الوقت الذي يقضيه في كوب الطعام قبل وأثناء وبعد العروض من المحفزات والمكافآت الغذاء.
    2. بيت الدوائر في خزانات-تخفيف الصوت (22 "W × 22" H × 16 "D) مزودة مراوح العادم (~ 68 ديسيبل).
    3. استخدام الكمبيوتر PC مع ميد أسوشيتس برنامج للسيطرة على غرفة استثابي والحصول على البيانات. خلال جلسات تكييف، وجمع بيانات عن إجمالي الوقت الذي يقضيه مع الرأس في كأس الغذائية خلال سيقدم العرضنشوئها من (ثانية الحقبة 5) التحفيز الخفيفة وخلال عرض مكافأة الغذائية (5 ثانية العصر). خلال الدورة اختبار، وجمع بيانات عن إجمالي الوقت الذي يقضيه في الكأس الغذاء في الاستجابة لعروض من المنبهات السمعية (10 ثانية عصر البداية عندما يتم إنهاء المنبهات السمعية).

4. لمحة عامة عن الحسية شروط مسبقة بارادايم

  1. بعد التعافي من الجراحة، تدريجيا الطعام تحد من الفئران إلى 85٪ من وزن الجسم فراغهم التغذية. استشارة الموظفين البيطريين لنموذج تقييد الغذاء المناسب.
    ملاحظة: يتم توضيح 3-مرحلة شروط مسبقة الحسي النموذج في الشكل 2.
  2. شروط مسبقة جلسات (المرحلة 1؛ دورات تدريبية 64 دقيقة يوميا أجرت عبر 4 أيام متتالية):
    1. الفئران الحالية مع 12 المحاكمات اختلط التي تتكون من تسليم المنبهات السمعية والبصرية. تشمل فترات بين المحاكمة أن متوسط ​​4.5 للدقيقة (مجموعة 4،0-5،0 دقيقة) بعد كل لعرض uditory.
    2. في 6 من التجارب والحاضر لهجة (التحفيز شروطا مسبقة) لمدة 10 ثانية، يليه مباشرة عرض 5 ثانية للضوء وامض التحفيز.
    3. من جهة أخرى 6 المحاكمات، تقديم الضوضاء البيضاء (التحفيز المفردة) وحدها لمدة 10 ثانية.
  3. (؛ دورات تدريبية 64 دقيقة يوميا أجريت عبر 5 أيام متتالية المرحلة 2) جلسات تكييف:
    1. وجاءت الفئران الحالية مع 8 المحاكمات التي تتكون من تسليم التحفيز البصري (وميض ضوء التحفيز) لمدة 5 ثوان على الفور بتسليم اثنين من 45 ملغ كريات الغذاء. تشمل فترات بين المحاكمة أن متوسط ​​7 دقيقة (مجموعة 6،0-8،0 دقيقة) بعد كل محاكمة. أحيانا الفئران تتطلب أكثر من 5 جلسات تكييف لتعلم جمعية الغذائية الخفيفة.
  4. دورة اختبار (المرحلة 3، واحدة جلسة 78 دقيقة):
    1. تقديم الفئران مع 12 المحاكمات اختلط التي تتكون من تسليم المنبهات السمعية وحدها. تشمل فترات بين المحاكمة التي افيالغضب 4.5 دقيقة (مجموعة 4،0-5،0 دقيقة) بعد كل عرض السمعي.
    2. على 6 من المحاكمات، تقديم الحوافز لهجة (التحفيز شروطا مسبقة) وحدها لمدة 10 ثانية.
    3. من جهة أخرى 6 المحاكمات، تقديم الضوضاء البيضاء (التحفيز المفردة) وحدها لمدة 10 ثانية.
  5. موازنة المحفزات من خلال استكمال الدراسة مع مجموعة ثانية من الفئران التي تتلقى الضوضاء البيضاء بوصفها حافزا شروطا مسبقة والنغمة مثل التحفيز المفردة.

5. الدوائي والسلوكي الداخلي

  1. تشغيل الطاقة إلى جهاز السلوكي وتحميل رمز MED-PC للدورة السلوكية المناسبة. الأسلاك وبرنامج الجهاز السلوكي مثل أن المشجعين التي شنت على خزائن الصوت المخففة تشغيل عند تشغيل الطاقة.
  2. لإعداد 1 ملغ / مل حل للكلوزابين N-أكسيد (CNO)، ويزن 5.0 ملغ من CNO إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وإضافة 5 مل من الماء المعقم أو 5 مل من معقم 0.9٪ ساليشمال شرق. دوامة حتى حل واضح.
    1. إذا CNO لا تذوب في حل أو إذا رغبت في حلول أكثر تركيزا من CNO إضافة كيل الانحلال، مثل DMSO 23. على وجه التحديد، لإعداد محلول 1 ملغ / مل من CNO مع 0.5٪ DMSO، تزن 5.0 ملغ من CNO وإضافة 25 ميكرولتر من DMSO إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. نفض الغبار ضمان بلطف أن محتويات تبقى في قاعدة الأنبوب. عندما يصبح حل واضح، إضافة 5 مل من الماء المعقم أو 5 مل من العقيمة 0.9٪ المالحة. متوفرة على صفحة موارد DREADD يكي 25 مزيد من التعليمات لإعداد حلول CNO.
    2. يعد حل CNO جديد كل يوم أن يدار.
  3. حقن CNO البريتونى بجرعة 1 ملغم / كغم حوالي 30 دقيقة قبل الاختبار السلوكي. على سبيل المثال، وضخ 200 غرام الفئران مع 0.2 مل من 1 ملغ / مل حل CNO. وقد تم اختيار مسار الجرعة ووقت الإدارة CNO استنادا إلى تقارير نشرت سابقا 2،12.
    1. حقن CNO 30 دقيقة قبل كل دورة شروط مسبقة (المرحلة 1؛ مجموعه 4 أيام من الحقن) ولكن إدارة السيارة قبل جميع دورات سلوكية لاحقة.
  4. بعد 30 دقيقة، ووضع الفئران في غرف اختبار السلوكية والشروع رمز الكمبيوتر للدورة السلوكية المناسبة.
  5. عند الانتهاء من المهمة السلوكية، على الفور بإزالة الفئران من الدوائر وعودة الجرذان إلى مستعمرة الحيوانات.

6. التحليلات السلوكية البيانات

ملاحظة: المتغير التابع للجميع الدورات السلوكية هو مقدار الوقت الذي رأس فأر هو داخل الكأس المواد الغذائية والكشف عنها من قبل انقطاع الخلايا الضوئية الحمراء في الكأس الغذاء. البيانات (في ثانية) يتم جمعها وتسجيلها بواسطة برنامج كمبيوتر.

  1. لا إجراء تحاليل على البيانات التي تم إنشاؤها خلال مرحلة شروط مسبقة.
  2. لدورات تكييف: تحليل كل الفئرانبيليتي لتعلم جمعية الغذائية الخفيفة بمقارنة سلوك كوب المواد الغذائية خلال تقديم محفزات بصرية عبر جلسات السلوكية 5. على وجه التحديد، وحساب متوسط ​​الوقت الذي يقضيه في الكأس الغذائية خلال ضوء الحقبة 5 ثانية لكل من 8 محاكمات / الدورة (أي ما معدله 8 المحاكمات التي هي كل 5 ثانية في مدة / فأر). مقارنة متوسط ​​الرقابة والقيم التجريبية لكل من 5 جلسات يومية (انظر الشكل 3A).
    1. تحليل الدوافع الفئران للحصول على مكافأة الطعام بمقارنة سلوك كوب الطعام أثناء الولادة المكافأة الغذائية (5 ثانية العصر) عبر جلسات السلوكية 5 باستخدام نفس الحساب كما هو محدد في ضوء الحقبة 5 ثانية أعلاه. وهذه القيم يكون دائما أعلى من تلك التي تم الحصول عليها خلال عرض محفزات بصرية (انظر الشكل 3B).
  3. للدورة اختبار: حساب نسبة التمييز الذي يصف سلوك كوب الغذاء الفئران استجابة لبريهentations كل التحفيز السمعي.
    1. على وجه التحديد، لكل فأر، وتقسيم متوسط ​​الوقت الذي يقضيه في الكأس الغذائية التالية كل من 6 عروض من التحفيز الحسي شروطا مسبقة (أي لهجة) من خلال مجموع متوسط ​​الوقت الذي يقضيه في الكأس الغذائية التالية كل من 6 عروض لل التحفيز الحسي شروطا مسبقة (أي حافز لهجة) بالإضافة إلى متوسط ​​إجمالي الوقت الذي يقضيه في كأس الغذائية التالية كل من 6 عروض من التحفيز المفردة (أي ضجيج التحفيز الأبيض). كل عصر هو 10 ثانية في المدة.
      ملاحظة: A درجة التمييز من 0.5 أو أكثر تبين أن الفئران علمت جمعيات الكامنة في شروط مسبقة النموذج الحسي.

7. التأكيد من AAV التنسيب والتعبير

  1. تخدير ويروي الفئران transcardially باستخدام 4٪ لامتصاص العرق. يرجع ذلك إلى استخدام العلامات الفلورية، لا تتجاوز فترة ما بعد التثبيت من 2 ساعة إلى دقيقةفقدان imize من استضداد والحفاظ على إشارة الفلورسنت.
  2. يذوى العقول perfused لبنقلهم في وعاء الدماغ تحتوي على 30 مل من محلول السكروز 20٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (1X) لمدة لا تقل عن 2 أيام أو حتى الدماغ المصارف إلى أسفل الجرة الدماغ.
  3. استخدام انزلاق مشراح تجميد لجعل أقسام الدماغ الاكليلية (20-40 ميكرون) في جميع أنحاء كامل مدى rostrocaudal المنطقة من الفائدة.
  4. إجراء المناعية الموجهة ضد مستقبلات الموسومة أو البروتين مراسل للتأكد من مكان والتعبير عن مستقبلات مصمم و / أو مراسل (12). يتم توفير بروتوكول المناعية تلطيخ على صفحة موارد DREADD يكي 25.
  5. تحميل المقاطع على الشرائح-superfrost زائد وساترة باستخدام 100-200 ميكرولتر من وسط مائي التركيب.
  6. أداء مضان المجهر على أنسجة المخ للتحقق من وضع AAV وتعبير البروتين 12،24.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النتائج السلوكية

عند الانتهاء من التجربة، يجب كميا ونوعيا تقييم فعالية تعطيل مؤقت منطقة محددة. ينطوي هذا المثال نموذج 3-مرحلة السلوكي (شروط مسبقة الحسي)، والتي كانت تدار CNO لتخفيف النشاط العصبي في RSC خلال جلسات شروط مسبقة لاختبار فرضية أن RSC الضروري لتشكيل جمعيات بين المحفزات محايدة 12. الأهم من ذلك، والمجربون لا تقتصر على النموذج السلوكي أو التصميم التجريبي الموصوفة هنا مع اقتراب pharmacogenetic يمكن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية تطبيق نهج pharmacogenetic (DREADD) لمعرفة كيف تساهم منطقة محددة في الدماغ على مراحل متعددة المهام المعقدة التعلم. مع القدرة على مؤقتا وبعد إسكات النشاط العصبي في مناطق الدماغ منفصلة عبر مراحل التعلم، وهذا المزيج من النهج يوفر منبرا للتحقيق في مجموعة واسعة من السلوكيات، بما في ذلك أشكال أكثر دقة أو ملثمين التعلم. في المثال الموصوفة في هذا البروتوكول، ومراقبة تم اختبار الفئران والجرذان التي تعبر عن مستقبلات مصمم في القشرة خلف الطحال (RSC) في مهمة السلوكية 3-...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر واضعي روبنسون وآخرون. (12) لمساهماتها في المخطوطة التي يستمد جزئيا هذا البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ذكر ، فئران إيفانز الطويلة ، 55-60 يوماHilltop Lab Animals Inc
rAAV8 / hSyn-HA-hM4D (Gi) -IRES-mCitrineVirus Vector Coreتحذير: هذا مركب BSL-1
rAAV8 / hSyn-GFPناقل الفيروساتالحذر الأساسي
Clozapine-N-oxideR & D Systems4936-10الفئران المخدرات المصمم
(البولي كربونات)التصميم البديل FT 8XL-PCتستخدم لتغطية أقفاص 48-72 ساعة بعد التسريب
ورق الترشيح (الاستبدال)التصميم البديلFP-R-1018XADورق الترشيح الذي يتناسب مع أغطية القفص
ملزمة سطح الطاولةJETS2201-265لحمل أنابيب الطرد الدقيقة التي تحتوي على AAV في غطاء المحرك
أكياس القمامة Biohazardالدبابيس113444Medline biohazard بطانات
سلة المهملات Biohazardسلة مهملات مستطيلة الشكل Amazon.com UnitedSolutions سعة 34 جالونا مع مقبض خطاف وقفل
Isoflurane ، 100 ملPatterson Veterinary Supply Inc.07-890-8540مخدر
مزدوج صغير تجسيمي مع وحدة تحكم قراءة العرض الرقميديفيد كوبفموديل 942معدات جراحية
قضبان أذن غير ممزقة ، مجموعة من 2 (فأر)ديفيد كوبموديل 955معدات جراحية
قناع التخدير (فأر)ديفيد كبفموديل 906معدات
جراحيةتشتمل المثقاب التجسيمي عالي السرعة على وحدة تحكم في المحرك على الطاولة ، ودواسة القدم ، وقبضة ، وحامل قبضة مجسمةديفيد كوبفموديل 1474المعدات الجراحية
نتوءات Microdrill ، 0.9 ممFine Science Tools Inc19007-09الإمداد الجراحي
مضخة حقنة آلية مع وحدة تحكم micro4ديفيد كوبموديل UMP3-1معدات جراحية
شفرة سيراميك قابلة للفصل للحيوانات مجموعة المقصAhdis21420الإمداد الجراحي
منظف البشرة البيتادينمنتجات Perdue LP67618-149-04الإمداد الجراحي
مرهم مضاد حيوي ثلاثيMedlineSupply 53329-087-01الإمداد الجراحي
مرهم Puralube البيطريفقط الإمداد البيطري17033-211-38الإمداد الجراحي
مجهردينو لايتAD7013MTLبديل لنطاق التشريح التقليدي
Dino-lite الصلب على سطح الطاولة ذراع الرافعةالمجهرMS36Bالمعدات الجراحية
28 G 10 & ل حقنةهاميلتون80308-701SNالمعدات الجراحية
مقصورة مخففة للصوت MDFMed Associates، IncENV-018MD22 'W × 22 "H × 16" D
غرفة اختبار معيارية طويلة جداMed Associates، IncENV-007المعدات السلوكية
أرضية شبكة الفولاذ المقاومMed Associates، IncENV-005المعدات
السلوكيةضوء المنزلMed Associates، IncENV-215Mتستخدم كضوء المنزل وضوء
التحفيز موزع الحبيبات المعياريMed Associates، IncENV-203M-45المعدات السلوكية
وعاء الحبيبات ، نوع الكوبMed Associates، IncENV-200R1Mكاشف
دخول الرأس للفئرانMed Associates، IncENV-254-CBالمعدات السلوكية
كريات طعام دقيقة خالية من الغبار ، 45 مجمBio-ServF0165التوريد السلوكي
لغرفة الفئرانMed Associates، IncالسلوكيةENV-224AM
مولد الصوت القابل للبرمجةMed Associates، IncANL-926المعدات السلوكية
Smart ctrl 8 المدخلات / 16 حزمة الإخراجMed Associates، IncDIG-716P2المعدات السلوكية
خزانة كبيرة على سطح الطاولة وإمدادات الطاقةMed Associates، IncSG-6510Dحزمة واجهة PCI للمعدات السلوكية
Med Associates، IncDIG-700P2-R2المعدات السلوكية
MED Intel core الكمبيوتر pkg مع شاشة X Pro مقاس 19 بوصةMed Associates، IncCOM-103Vالمعدات السلوكية
بارافورمالدهيد (grannular) ، 1 كجمElectron Microsopy علوم19210المخاطر: مادة مسرطنة ، تزن في غطاء
محرك السيارة أجسام مضادة أحادية النسيلة للأرانب (HA-Tag)تقنيات إشارات الخلية3724Sكاشف الأنسجة
XP الأرانب الجسم المضاد أحادي النسيلة (GFP)تقنيات إشارات الخلية2956Sكاشف الأنسجة
المضاد للأرانب تقنياتإشارات الخلاياIgG 4412Sالأنسجة الشرائح
Superfrost plusVWR الدولية483111-703مستلزمات الأنسجة
من عمر : هذا مركب BSL-1 غطاء قفص طويلة جدا للصدأ متحدث قفص المعدات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  2. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
  3. Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
  4. Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
  5. Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
  6. Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
  7. Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
  8. Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
  9. Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
  10. Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
  11. Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
  12. Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
  13. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  15. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
  16. Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
  17. Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
  18. Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
  19. Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  20. Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
  21. National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
  22. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  23. Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
  24. Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
  25. wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
  26. Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
  27. Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
  28. Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
  29. Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
  30. Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة