يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فحص المواد الغذائية للفئة 1 Integrons وجين كاسيتات

8.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52889

⸱

يونيو 19, 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول الكشف عن الإنتجرونات من الفئة 1 وأشرطة الجينات المرتبطة بها في المواد الغذائية.

الملخص

مقاومة المضادات الحيوية هي واحدة من أكبر التهديدات للصحةفي القرن الحادي والعشرين. يعد اكتساب جينات المقاومة عن طريق نقل الجينات الجانبية عاملا رئيسيا في انتشار آليات المقاومة المتنوعة. من بين عناصر الحمض النووي التي تسهل النقل الجانبي ، كانت الإنتجرونات من الفئة 1 مسؤولة إلى حد كبير عن نشر محددات مقاومة المضادات الحيوية بين مسببات الأمراض سالبة الجرام. في المجموع ، اكتسبت هذه الإنتجرونات ونشرت أكثر من 130 جينا مختلفا لمقاومة المضادات الحيوية. مع استمرار استخدام المضادات الحيوية ، أصبحت الإنتجرونات من الفئة 1 منتشرة في كل مكان في الأمراض ومسببات الأمراض للإنسان وحيواناتهم المستأنسة. نتيجة لذلك ، يمكن العثور عليها الآن في جميع مجاري النفايات البشرية ، حيث تستمر في اكتساب جينات جديدة ، ولديها القدرة على العودة إلى البشر عبر السلسلة الغذائية. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل نهجا مبسطا للكشف عن الإنتجرونات من الفئة 1 وأشرطة جينات المقاومة المرتبطة بها في المواد الغذائية ، باستخدام الزراعة و PCR. باستخدام هذا البروتوكول ، يجب أن يكون الباحثون قادرين على: جمع وإعداد عينات لعمل ثقافات غنية وفحص الإنتجرونات من الفئة 1. عزل المستعمرات البكتيرية المفردة لتحديد العزلات الإيجابية للإنتجرون ؛ تحديد الأنواع البكتيرية التي تحتوي على إنتجرونات من الفئة 1 ؛ وتميز هذه التكامل وأشرطة الجينات المرتبطة بها.

المقدمة

كان اكتشاف المضادات الحيوية واحدة من أعظم الإنجازات العلمية في القرن التاسع 20. ومع ذلك، فقد أدى استخدام وإساءة استخدام المضادات الحيوية لتطور السريع للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية، وهذه تشكل الآن تهديدا خطيرا للصحة العامة في القرن الحادي و21. صعود سلالات بكتيرية مقاومة لمعظم خيارات العلاج يزيد من احتمال أننا ندخل عصر حيث العقاقير المضادة للميكروبات لم تعد فعالة 1،2.

الآلية الوراثية التي تمنح المقاومة للمضادات الحيوية هو نظام القديم، سبقت البشر والضغوط اختيار المضادات الحيوية من قبل الملايين من 3 سنوات. العناصر الجينية المحمولة، مثل البلازميدات والترانسبوزونات والجزر الجينومية والعناصر وintegrons اقترانية التكاملية يمكن نشر الجينات المقاومة للمضادات الحيوية (ARG) داخل وبين الأنواع البكتيرية 4 على حد سواء. من هذه، وقد لعبت integrons دورا مركزيا في انتشار ARG، على الرغم منحقيقة أنها تعتمد على البلازميدات والترانسبوزونات للتعبئة والإدراج في الجينوم البكتيري 5. Integrons التقاط أشرطة الجينات باستخدام integron-integrase، ومن ثم التعبير عن أشرطة باستخدام integron المشفرة المروج 6،7 (الشكل 1). Integron الجينات أشرطة عناصر المحمولة الصغيرة التي تتكون من واحد إطارات القراءة المفتوحة (ORF) الذي المنتجات يمكن أن تضفي مقاومة للمضادات الحيوية أو المطهرات 8. الفئة 1 integrons هي integrons تعافى الأكثر شيوعا من العزلات السريرية 5، حيث اكتسبت مجتمعة أكثر من 130 مختلفة أشرطة المقاومة للمضادات الحيوية الجينات 9.

انتشار الطبقة 1 integrons إلى المتعايشة والمسببة للأمراض البكتيريا المرتبطة الإنسان يولد تيارات النفايات البشرية التي تحتوي على أعداد كبيرة من هذه العناصر الجينية 10. يتم الافراج يقدر ب 10 19 البكتيريا التي تحتوي على الطبقة 1 integrons عن طريق مياه الصرف الصحي الحمأة كل ط العامن المملكة المتحدة (11). ولذلك ليس من المستغرب أن الطبقة 1 integrons يمنح المقاومة للمضادات الحيوية يجري حاليا الكشف عن الجراثيم في الطيور البرية والأسماك، وغيرها من 12-14 الحياة البرية الوطنية. الإفراج عن integrons مرة أخرى إلى البيئة يشكل خطرا كبيرا على الصحة العامة، منذ اقتناء أشرطة الجينات الجديدة وإعادة ترتيب معقدة مع عناصر المحمولة الأخرى مازالت تحدث، وخاصة في محطات معالجة مياه الصرف الصحي وغيرها من المسطحات المائية 15-18. البيئة الطبيعية ثم يصبح أرضا خصبة لتجنيد محددات مقاومة جديدة ومسببات الأمراض الانتهازية 19،20. يمكن للبكتيريا التي تحتوي على integron جديدة وسائط جديدة دائرة حول العودة الى المجتمع البشري من خلال المياه والأغذية الملوثة 21،22. مراقبة وسائط البيئية هي استراتيجية رئيسية لفهم وإدارة المقاومة للمضادات الحيوية في 23 في المستقبل. على وجه الخصوص، ينبغي إيلاء الانتباه إلى المواد الغذائية التي تؤكل نيئة أوالمطبوخة قليلا، لأن هذه تمثل أكبر تهديد لنقل عناصر متنقلة جديدة ومسببات الأمراض.

في هذا البروتوكول، واتباع نهج مبسط للكشف عن، تحديد وتوصيف الدرجة 1 integrons وأشرطة الجينات المرتبطة بها في المواد الغذائية وترد (الشكل 2). باستخدام مزيج من زراعة والبلمرة المتسلسل (PCR)، integrons يمكن الكشف عنها بسرعة في المجتمعات البكتيرية معقدة والعزلات الفردية. وترد أساليب لتحديد الأنواع من البكتيريا والتشكل والهوية من أشرطة الجينات المرتبطة integron. هذه الطريقة مناسبة لمجموعة واسعة من الأطعمة النباتية والحيوانية، ويتم إعطاء أمثلة على سير العمل النموذجية لكل من أنواع الطعام هذه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

المواد الغذائية التي تؤكل نيئة أو مطبوخة طفيفة هي الأكثر إثارة للقلق بالنسبة لصحة الإنسان. ومن الأمثلة سلطة الخضار والفواكه، والمحار والقشريات.

مجموعة 1. عينة

  1. جمع العينات تحت الظروف التي تقلل من التلوث، وتخزينها في منفصلة، ​​أكياس نظيفة أثناء النقل. مرة واحدة تم جمعها، يجب أن يتم تخزين العينات في 4 درجات مئوية، ومعالجتها في غضون 24 ساعة.

2. المخصب تحضير الثقافة

  1. فواكه وخضراوات:
    1. وضع حوالي 10 غرام من المواد في كيس من البلاستيك دائم. إذا تجهيز المواد بشكل اكبر، والتركيز على الجلد من الفاكهة أو الخضروات. إضافة 90 مل 0.1 M العازلة فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0 وعملية في خلاط المجذاف لمدة 30 ثانية. بدلا من ذلك، والمواد يمكن تحريكها يدويا إذا خلاط مضرب غير متوفر.
    2. جمع السائل الى قسمين 50 مل أنابيب الصقر. أنابيب الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 7 دقائق للبكتيريا بيليه. I>
    3. إزالة بعناية طاف ووقف البكتيريا مكعبات في 30 مل من معقم لوريا Bertani (LB) مرق.
    4. احتضان على شاكر O / N، وعقد أنبوب واحد عند 25 درجة مئوية والآخر في 37 ° C. يجب أن تهتز الثقافات في 200 التذبذبات في الدقيقة (OPM). متجر الثقافات في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
  2. المأكولات البحرية:
    1. تشريح خارج المعدة (المحار) أو الجهاز الهضمي (القريدس) باستخدام ملقط معقم وملاقط ومكان في أنبوب معقم 1.5 مل تحتوي على 200 ميكرولتر من 0.1 M الصوديوم العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0. أضعف العينة لإنشاء جناسة.
    2. الاستغناء عن 5 مل من مرق LB إلى قسمين معقمة 5 مل أنابيب، وتطعيم كل مع جناسة المأكولات البحرية.
    3. احتضان على شاكر O / N، وعقد أنبوب واحد عند 25 درجة مئوية والآخر 37 ° C. يجب أن تهتز الثقافات في 200 OPM. متجر الثقافات في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.

3. الثقافات للكشف عن Integrons

= "jove_content"> ملاحظة: يتم استخدام البروتوكولات PCR القياسية من خلال هذه المنهجية، وذلك باستخدام مخازن المتوفرة مع الإنزيم، والأخير تركيز MgCl 2 2.5 مم. إذا لزم الأمر، لورنز (2011) 24 وقد حددت PCR الأمثل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها الأساليب في قضية سابقة من هذه المجلة.

  1. المغلي إعداد DNA:
    1. الاستغناء عن 100 ميكرولتر من ثقافة غنية في العقيمة 0.5 مل PCR أنبوب. تسخين العينة إلى 99 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وذلك باستخدام حمام مائي أو كتلة الحرارة. المفاجئة البرد على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    2. microcentrifuge في 14000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير الحطام الخلية. العودة إلى جليد. عينات من الحمض النووي يمكن تجميد في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة، ولكن يجب إذابة على الجليد.
  2. الكشف عن فئة 1 integrons باستخدام PCR:
    ملاحظة: يتم فحص الثقافات المختلطة من O / N الحضانة لفئة 1 integrons باستخدام بروتوكول HS463a / HS464 PCR (الجدول 1).
    1. ذوبان الجليد جميع الكواشف PCR على الجليد، بعيدا عن أي سو المحتملين rces تلوث DNA. يشكلون 48 ميكرولتر PCR mastermix لكل عينة، بما في ذلك الضوابط السلبية (الجدول 2). الاستغناء عن 48 ميكرولتر من PCR مزيج الرئيسي لكل أنبوب، وذلك باستخدام نصائح الحاجز.
    2. إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي لإذابة أنابيب PCR الفردية باستخدام نصائح الحاجز. تشغيل البرنامج المناسب في thermocycler PCR.
    3. لتقييم نتائج التضخيم، electrophorese 7 ميكرولتر من الناتج PCR على 2٪ هلام الاغاروز سكب وتشغيلها في TBE العازلة (90 ملي تريس بورات، 2 مم EDTA). تتضمن علامة الوزن الجزيئي، مثل سلم 100 سنة مضت.
    4. آخر صمة عار الجل مع وصمة عار DNA، وتصور باستخدام الأشعة فوق البنفسجية نقل transilluminator. تأكد من أن لم يكن هناك تضخيم في السيطرة السلبية. فرقة قوية في حوالي 470 سنة مضت لأي عينة معينة تشير إلى أن ثقافة مختلطة تحتوي على البكتيريا التي تحمل فئة 1 integron. سيتم الآن عزل مستعمرات نقية من أي ثقافة المختلطة التي عاد PCR إيجابي.

> 4. فحص واحدة المستعمرات للفئة 1 Integrons

  1. التخفيفات المسلسل وانتشار لوحات:
    ملاحظة: لعزل المستعمرات واحد من الثقافات المختلطة PCR إيجابية، وتضعف ثقافة مختلطة متسلسل 10 أضعاف في المخزن فوسفات الصوديوم، ثم بالذهب لاستعادة المستعمرات واحد.
    1. إضافة 1 مل من ثقافة مختلطة إلى 9 مل من العازلة الفوسفات 0.1 M الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0 و تخلط بواسطة قلب. إضافة 1 مل من التخفيف إلى 9 مل مزيد من العازلة الفوسفات، وتكرار حتى التخفيف المتسلسل من 10 -8 يتم التوصل إليه.
    2. انتشار 100 ميكرولتر من 10 إلى 10 -4 -8 التخفيفات على LB أجار، في نسختين. احتضان لوحات O / N في نفس درجة الحرارة المستخدمة في ثقافة مختلطة الأولية. ويمكن بعد ذلك أن يتم تخزين لوحات في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة، ومع ذلك فمن الأفضل لمعالجة المستعمرات واحد على وجه السرعة إلى حد ما.
  2. اختيار مستعمرة واحدة وإعداد DNA المغلي:
    1. اختيار المستعمرات واحد من لوحات تخفيف المسلسل، وحد ذاتهاlecting العديد من أنواع مختلفة مستعمرة وقت ممكن، وذلك باستخدام معايير مثل حجم مستعمرة والشكل واللون. استخدام المسواك العقيمة لتحديد المستعمرات واحد من لوحة انتشار.
    2. لمس مسواك إلى المستعمرة، ثم نقل في أنبوب PCR تحتوي على 100 ميكرولتر من الماء المعقم. إذا أعداد كبيرة من المستعمرات ليتم عرضه، ثم مستعمرات يمكن تحضير صينية عيار مكروي. تدور مسواك بين الأصابع لطرد بعض الخلايا في الماء.
    3. باستخدام نفس مسواك، تطعيم لوحة LB مع مسحة من المستعمرة. ويمكن تخزين عدد كبير من المستعمرات على لوحات وصفت إذا كان كل خط حوالي 1 سم. كرر الخطوات من 1-3 حتى يتم اختيار عدد مناسب من العزلات.
    4. احتضان LB وحات O / N، في نفس درجة الحرارة التي استخدمت للثقافة غنية الأولية. ومن ثم يمكن تخزينها الثقافات في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
    5. لإعداد DNA من تعليق البكتيرية، اتبع الخطوات كما أووtlined في القسم 3.1. لفحص لست] ثقافة نقية، أداء HS463a / HS464 PCR على النحو المبين في الفقرة 3.2. يعزل التي ترجع سيتم استخدام PCR إيجابية لإعداد الحمض النووي الجيني (القسم 5)، وللمزيد من التحليلات.

5. المستعمرات واحد الجينوم استخراج الحمض النووي من Integron إيجابية عن طريق الخرزة الضرب 25

  1. تطعيم 5 مل من مرق LB مع عينة من ثقافة نقية معزولة في القسم 4.2. احتضان O / N، والهز في نفس درجة الحرارة التي تم استخدامها للثقافة غنية الأولية.
  2. خلايا بيليه في 4000 x ج لمدة 7 دقائق، ثم إزالة طاف. resuspend الخلايا مكعبات في 1 مل من محلول CLS-TC في الناشر مصفوفة E أنبوب الإعدادية سريع. باستخدام آلة حبة الضرب ومعالجة العينة عند 5.5 متر / ثانية لمدة 30 ثانية.
  3. أنبوب الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 5 دقائق واسترداد 700 ميكرولتر من طاف في أنبوب معقم 1.5 مل.
  4. إضافة 700 ميكرولتر من المصفوفة ملزمة المخفف 1: 5 مع 6 M قوانidinium ثيوسيانات وتخلط في RT لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة، طاف تجاهل.
  5. إضافة 800 ميكرولتر غسل الإيثانول الملح (70٪ من الإيثانول، 0.1 M خلات الصوديوم) ودوامة حتى يتم معلق بيليه بالكامل. يغسل لمدة 5 دقائق على RT، الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. ضمان تمت إزالة جميع طاف، باستخدام micropipette إذا لزم الأمر، ثم السماح للهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
  6. Resuspend ومصفوفة بيليه في 200 ميكرولتر TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1MM EDTA، ودرجة الحموضة 7.6) من قبل pipetting صعودا وهبوطا. في احتضان RT لمدة 3 دقائق. الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 3 دقائق ونقل 160 ميكرولتر من الحمض النووي مزال في أنبوب العقيمة. تشغيل قسامة من استخراج الحمض النووي الجيني على 2٪ ث / ت الاغاروز هلام للتحقق من المحصول وسلامة استخراج الحمض النووي. يتم تخزين الحمض النووي الجيني النقي عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، وديفروستيد على الجليد عند الحاجة لاختبار PCR.

6. إتمام المشروعات التشخيص وتسلسل الحمض النووي

ملاحظة:وسيتم استخدام الحمض النووي الجيني أعدت في القسم 5 لجميع تقارير إنجاز المشروعات التشخيص، والتأكد من ثبوت تعاطيه للفئة 1 integrons.

  1. ذوبان الجليد الحمض النووي الجيني على الجليد، دوامة لفترة وجيزة على عينة من الحمض النووي والنبض تدور في 14000 x ج لمدة 20 ثانية. تكرار PCR ل-integron integrase الجينات الدرجة 1 باستخدام HS463a / HS464 (الجدول 1)، مؤكدا أن عزل إيجابية لamplicon 471 سنة مضت (القسم 3.2).
  2. ويتحقق التعرف على الثقافات الإيجابية إلى مستوى الأنواع من خلال تحليل الصغيرة الجينات الوحيدات الريباسي (16S rDNA). تضخيم الجينات 16S باستخدام بادئات F27 / r1492 (الجدول 1). التحقق من المنتجات PCR باستخدام الكهربائي. يجب على جميع الأهداف البكتيرية تولد 16S amplicon حوالي 1450 سنة مضت.
  3. تسلسل الجينات 16S الريباسي amplicon لتحديد هوية الأنواع، ولكن لأن هناك من المحتمل أن تكون تقارير إنجاز المشروعات إيجابية متعددة من الخطوة 6.2، وكثير من هذه ايجابيات سيكون نفس الأنواع البكتيرية، ونحن سوف نميز أولا الأنواع المختلفة النقيبز تقييد هضم المنتج 16S PCR.
    1. هضم قسامة من PCR 16S مع انزيم التقييد Hinf 1. أي الانزيم الذي يعترف وانشقاق المواقع 4 بي بي القيام به، ولكن Hinf 1 يولد تنوع جيد من الأهداف 16S، وغير موثوقة وغير مكلفة الانزيم.
  4. اقامة تقييد 30 ميكرولتر الهضم mastermix (الجدول 2) في أنبوب معقم وإضافة 20 ميكرولتر من-purfied الامم المتحدة 16S PCR المنتج. احتضان في 37 ° C حمام الماء O / N. تحقق الخلاصة على هلام الاغاروز 2٪.
  5. تسجيل أنماط الهضم التي تنتجها Hinf 1. يعزل بنفس 16S الشخصي تقييد من المحتمل أن يكون من نفس النوع. بدلا من التسلسل كل 16S PCR المنتج، وتسلسل في معظم ثلاثة ممثلين من كل نمط تقييد Hinf 1.
  6. تنقية المنتجات 16S PCR باستخدام طقم التجارية. وحيد عدة نوكلياز خارجية تقطعت بهم السبل يمكن استخدامها، ولكن عمود تستند أو أساليب هطول الأمطار أيضا تعمل بشكل جيد لإزالة unincالاشعال orporated والسلطات الوطنية المعينة الذين تقطعت بهم السبل واحدة. تسلسل amplicons 16S باستخدام R910 التمهيدي (الجدول 1)، ووضع ردود الفعل على النحو المحدد من قبل مرفق التسلسل.
  7. استخدام تسلسل الحمض النووي مما أدى لاستجواب قاعدة بيانات الحمض النووي NCBI مع وظيفة blastn ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). تؤخذ عادة أكبر من 97٪ هوية النوكليوتيدات كما هوية الأنواع.

7. تعيين وتوصيف Integrons وكاسيت صالحة

ملاحظة: الفئة 1 integrons المنبثقة من النظم الإيكولوجية التي يهيمن عليها الإنسان من المحتمل أن يكون integrons الأكثر شيوعا في كل ما تبذلونه من العينات. هذه integrons كل لها أصل واحد مؤخرا، وبالتالي لديها تسلسل الحمض النووي الحفظ جدا 5.

  1. التفريق بين فئة 1 integrons النابعة من مصادر بشرية وتلك التي تحدث بشكل طبيعي في العينات البيئية عن طريق إجراءPCR مع التمهيدي تعيين intI1F165 / intI1R476 10 (الجدول 1).
    ملاحظة: الفئة 1 integrons من البكتيريا المتعايشة السريرية أو توليد منتج BP ~ 300، في حين أن الطبقة البيئية 1 integrons لا تولد أي منتج.
  2. تميز integrons السريرية عن طريق تضخيم مجموعة كاسيت مع مجموعة التمهيدي HS458 / HS459. وهذا PCR تضخيم المنطقة بين intI1 وقطاع الحفظ 3 'في محطة معظم صفائف الكاسيت. لأن عدد وهوية أشرطة متغير، فإن حجم المنتج PCR تختلف أيضا.
  3. تنقية amplicons وتسلسل الحمض النووي باستخدام كل من الاشعال التضخيم. استخدام تسلسل الحمض النووي لاستجواب قواعد البيانات باستخدام وظيفة blastn ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. ضمان تسمية من أشرطة اتبع تسمية موحدة 9، لأن العديد من ترسبات بيانات كاسيت integron الجيناتالصورة استخدام أسماء غير متناسقة أو غامضة. إيلاء اهتمام خاص لأشرطة جينة جديدة، لأن هذه قد ترميز الظواهر الجديدة، بما في ذلك الجينات التي تمنح زيادة على الانتقال، المرضية أو الفوعة 8،21.
    ملاحظة: قبل السريرية أشكال integron الدرجة 1 لا يزال يعمم في البيئات الطبيعية. على وجه الخصوص، تلك التي ترتبط النشطة تينيسي 402 الترانسبوزونات هي الأكثر أهمية 26. سوف صفائف كاسيت هذه integrons لا تضخيم مع مجموعة التمهيدي HS458 / HS459، ولكن يمكن أن تتضخم مع التمهيدي مجموعة MRG284 / MRG285 (الجدول 1)، وتوليد amplicons من حجم متغير يعتمد على محتوى الكاسيت. يجب تنقية المنتجات PCR وتسلسل الحمض النووي كما هو موضح في 7.2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

فحص الثقافات المختلطة والعزلات البكتيرية للintI1

مجموعة التمهيدي HS463a / HS464 PCR يمكن استخدامها للكشف عن وجود للintegron integrase الجينات الدرجة 1، intI1 (الشكل 1). هذه المجموعة التمهيدي يعمل بشكل جيد للكشف عن intI1 في الثقافات المختلطة، ويستخدم أيضا لفحص المستعمرات البكتيرية التي تحصد من انتشار لوحات (الشكل 2). يجب أن العزلات الإيجابية تولد فرقة قوية واح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تحديد integrons وأشرطة الجينات المرتبطة بها قد يمثل خطوة رئيسية في توقع ظهور مسببات الأمراض الانتهازية الجديدة، وتتبع مسارات لمسببات الأمراض في السلسلة الغذائية للإنسان، وتحديد مقاومة جديدة والفوعة محددات 8،21،26. وكان الهدف من هذه الورقة لوصف نهج مبسط لفحص عينات لفئة 1 integrons، واصفا صفائف كاسيت والتعرف على الأنواع البكتيرية التي يقيمون فيها. الخطوات الحاسمة في البروتوكول تنطوي على ممارسة الميكروبيولوجية جيدة، ومنع التلوث PCR التي من شأنها أن تولد ايجابيات كاذبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما ذات الصلة في الكشف عنها.

شكر وتقدير

بفضل قاعة ميكايلا، لاريسا بيسبو وغوستافو تافاريس للمساعدة التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
GoTaq Colourless MastermixPromegaM7132يستخدم في جميع PCRs
RNAse (ريبونوكلياز أ من البنكرياس البقري)SigmaR6513-10MGيستخدم في جميع PCRs
إنزيم تقييد HinFIPromegaR6201يستخدم لهضم 16S rDNA PCR poducts. يأتي الإنزيم مع عازلة مثالية وسلم BSA
100 نقطة أساس27400701GE Healthcareيستخدم كمعيار للحجم على جميع المواد الهلامية GelRed
DNA صبغةBiotium41003تنبيه: يجب ارتداء الحماية الشخصية عند التعامل مع هذه المادة
Guanidinium thiocyanateLife TechnologiesAM9422تنبيه: يجب ارتداء الحماية الشخصية عند التعامل مع هذه المادة
CLS-TC الحلMP Biomedicals6540409محلول إعادة التعليق المستخدم في بداية استخراج الحمض النووي الجيني
Lysing Matrix E FastPrep أنابيبMP Biomedicals116914500الأنبوب المطلوب للتعطيل الميكانيكي لجدران الخلايا البكتيرية. يستخدم هذا الرمز لحزم من 500 أنبوب ، وتتوفر كميات أقل.
مصفوفة ملزمةMP Biomedicals116540408مخففة 1: 5 مع 6 M جوانيدينيوم ثيوسيانات وتستخدم في طريقة استخراج الحمض النووي الجيني.
آلة الإعداد السريعMP Biomedicalsعدد الخيارات المتاحةMP Biomedicals على عدد من أجهزة FastPrep المتاحة للشراء. قم بزيارة http://www.mpbio.com< / a > لمزيد من المعلومات
يحتوي

المراجع

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4(2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865(2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017(2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

فحص المواد الغذائية للفئة 1 Integrons وجين كاسيتات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.