يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الحث المباشر للمكون للدم البطانة Endothelium والدم عن طريق overexpression من العوامل المحفزة النسخ في الإنسان الخلايا الجذعية

7.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52910

⸱

ديسمبر 3, 2015

 ,  , 
1Primate Research Center, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول التحريض الفعال للبطانة المنشأ وأسلاف المكونة للدم متعددة الإمكانات من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عبر التعبير القسري لعوامل النسخ.

الملخص

خلال التنمية، تنشأ الخلايا المكونة للدم من مجموعة فرعية متخصصة من الخلايا البطانية، البطانة مكون للدم (HE). تطوير النمذجة سعادة في المختبر أمر ضروري للدراسات الميكانيكية للانتقال-البطانية المكونة للدم ومواصفات المكونة للدم. هنا، نحن تصف طريقة لتحريض الفعال للسعادة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) عن طريق overexpression من مجموعات مختلفة من عوامل النسخ. يتم استخدام مزيج من ETV2 وGATA1 أو GATA2 TFS للحث على سعادة مع إمكانية عموم الدم النخاعي، في حين أن مجموعة من GATA2 وعوامل النسخ TAL1 يسمح لإنتاج سعادة مع محمر وإمكانات النواءات. إضافة إلى LMO2 GATA2 والجمع بين TAL1 يسرع إلى حد كبير التمايز ويزيد إنتاج خلايا محمر والنواءات. يوفر هذا الأسلوب وسيلة فعالة وسريعة لسعادة تحريض من hPSCs ويسمح لمراقبة البطانية-hematopoietiج الانتقالية في صحن الثقافة. ويتضمن البروتوكول إجراءات hPSCs تنبيغ وتحليل ما بعد تنبيغ معالي والأسلاف الدم.

المقدمة

قدرة فريدة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لتجديد الذات والتمايز إلى خلايا الطبقات الجرثومية الثلاث، بما في ذلك الدم، وجعلها أداة قيمة للدراسات الميكانيكية للتنمية المكونة للدم، والنمذجة من أمراض الدم، وفحص المخدرات، دراسات السمية، وتطوير العلاجات الخلوية. لأن تشكيل الدم في العائدات الجنين من البطانة مكون للدم (HE) من خلال الانتقال للدم البطانية 1،2، وتوليد سعادة في الثقافات سيكون ضروريا لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم البطانية إلى الانتقال للدم ومواصفات المكونة للدم. وتستند الأساليب الحالية للدراسات سعادة على تحريض التمايز hematoendothelial في المجاميع (EBS) مع إضافة السيتوكينات المكونة للدم 3-5، وcoculture من hPSCs مع خلايا انسجة-تكون الدم داعمة 6،7 أو في الثقافات ثنائية الأبعاد مع خارج الخلية المصفوفات وجytokines 8،9. وتستند هذه الأساليب التمايز الكلاسيكية على إدخال الإشارات الخارجية المؤثرة على سطح الخلية وبدء مجموعات من المسارات الجزيئية التي تؤدي في نهاية المطاف إلى تفعيل برنامج النسخي توجيه التنمية hematoendothelial. وهكذا، فإن كفاءة hPSCs التفرقة في هذه الأنظمة تعتمد على الاستقراء الفعال لتلك الإشارات، نقل الإشارة إلى النواة، وتفعيل الناتجة من المنظمين النسخي محددة. وبالإضافة إلى ذلك، ودراسة سعادة في الثقافات التمايز التقليدية تتطلب خطوة إضافية لعزل سعادة الخلايا باستخدام فرز الخلايا. هنا، نحن تصف بروتوكول بسيط للتحريض مباشر من معالي والدم عن طريق overexpression من عوامل النسخ المكونة للدم. يسمح هذا الأسلوب للتحريض الفعال للسعادة في طبق والملاحظة المباشرة من البطانية على الانتقال للدم دون الحاجة لعزل سعادة باستخدام إجراء فرز الخلايا المرهقة.

تشكيل معالي والدم من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان يمكن أن يتسبب بكفاءة عن طريق overexpressing عدد قليل من عوامل النسخ (TFS). الجمع الأمثل للTFS قادرة على إحداث قوية على عموم النخاعي تكون الدم من hPSCs يشمل ETV2 وGATA1 أو GATA2. في المقابل، مزيج من GATA2 وTAL1 يدفع erythromegakaryocytopoiesis 10. برمجة hPSCs من خلال overexpression من هذه العوامل يفرق hPSCs مباشرة إلى VE-نذل + CD43 - CD73 - سعادة الخلايا التي يكتسب تدريجيا النمط الظاهري للدم الذي حدده التعبير في وقت مبكر للدم علامة CD43 7. هذا الأسلوب القائم على lentiviral للبرمجة مباشرة لالبشري المحفزة طريقة الخلايا الجذعية ينطبق على الجيل معالي وخلايا الدم للدراسات الميكانيكية، دراسات البطانية إلى الانتقال للدم، وتنظيم النسخي التنمية المكونة للدم والمواصفات. على الرغم من أن جيصف بروتوكول urrent إنتاج الدم باستخدام التعبير التأسيسي للالجينات المحورة، يمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام تعديل مرنا 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الاستعدادات الفيروسات والنسخ عامل دمج

  1. إعداد الحلول مع pSIN-EF1α lentiviral التعبير البلازميد التي تحتوي على الحمض النووي تشفير البروتين لETV2، GATA1، GATA2، TAL1 وLMO2 (الجدول 1).
  2. قياس تركيز ونقاء الاستعدادات البلازميد المستخدمة لإنتاج lentiviral عن طريق تسجيل امتصاص الأشعة فوق البنفسجية مع معمل في 230 نانومتر و 260 نانومتر، و 280 نانومتر. تعتبر التحضيرات DNA مما يدل A260 / 280 و A260 / 230 القيم أكبر من 1.8 عموما نوعية جيدة: مذكرة. قد يشير انخفاض A260 / 280 القيم تلوث البروتين، في حين انخفضت A260 / 230 القيم تشير الشوائب مع أملاح أو بعض المذيبات مثل الفينول. الموصى بها تركيز البلازميد هو 1-3 ميكروغرام / ميكرولتر.
  3. إنتاج lentiviruses لtransductions كما هو موضح في البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا 11. تحريض سعادة مع إمكانية عموم الدم النخاعي يتطلب شارك في التعبير عن ETV2 وGATA1، أو ETV2 وGATA2.تحريض سعادة مع إمكانية erythro- والنواءات يتطلب GATA2 وTAL1. إضافة LMO2 تحسن كبير في العائد من الخلايا erythro النواءات من hPSCs بحضور GATA2 وTAL1 10.

2. بروتوكول الثقافة hPSCs

  1. تنمو الخلايا الجذعية المحفزة في مستعمرات ضيقة مع حواف حادة إلى 70-80٪ confluency قبل subculturing. المستعمرات علامة وإزالة متباينة بشكل عفوي قبل الركض الخلايا.
  2. تمييع التجاري جل المصفوفة خارج الخلية (انظر الجدول 2) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وألواح معطف 6 جيدا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، أو لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 ° C قبل استخدامها. قبل الركض الخلايا، ونضح المصفوفة، إضافة 2 مل من culturemedium كاملة تجارية جديدة (انظر الجدول 2) والحفاظ على لوحات في 37 ° C، 5٪ CO 2 حتى الخلايا جاهزة للزرع.
  3. hPSCs مرور
    1. ASPIRAالشركة المصرية للاتصالات المتوسطة من بئر واحد متكدسة لوحة 6 جيدا مع hPSCs وإضافة 1.5 مل من قبل تحسنت Dispase حل II (2 ملغ / مل في DMEM / F12، تعقيمها عن طريق الترشيح من خلال 0.22 ميكرون مرشحات). احتضان لمدة 5-7 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حتى حواف المستعمرات تبدأ لرفع من على سطح الأرض.
    2. حل نضح Dispase الثاني وبعناية غسل المستعمرات مرتين عن طريق إضافة وثم الشفط 2 مل من الطازجة المتوسطة DMEM / F12. ثم، وذلك باستخدام 5 مل المصلية ماصة الزجاج، فصل hPSCs مع 3 مل من جديد التجاري مستنبت كاملة (انظر الجدول 2) من قبل pipetting تعليق الخلية صعودا وهبوطا عدة مرات.
    3. إضافة 0.5 مل من خلية إلى تعليق كل بئر من لوحة 6 جيدا تحتوي على 1.5 مل من التجاري مستنبت كاملة (انظر الجدول 2). تستنهض الهمم لوحة ذهابا وإيابا واليمين إلى اليسار عدة مرات لضمان توزيع الخلية موحدة عند توضيع لوحة في الحاضنة. حفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 ل 18-24 ساعة.
    4. القادم المتوسطة التغيير يوم لالعذبة التجاري مستنبت كاملة (انظر الجدول 2) ودراسة hPSCs التشكل. النتائج الركض الناجحة في مستعمرات صغيرة تعلق جيدا الاحتفاظ hPSC التشكل. يجب أن تغذى hPSCs مع 2.5-3 مل freshmedium لكل بئر على أساس يومي وpassaged كل 4-5 أيام في ما لا يزيد عن 70-80٪ التقاء.
      ملاحظة: إذا كان الحفاظ على hiPSCs على الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS)، فإنها تحتاج إلى أن يتم تحويلها إلى ظروف خالية من تغذية وpassaged 2-3 مرات قبل تنبيغ لضمان كفاءة التمايز.

3. تحريض Hematoendothelial Pprecursors من hPSCs (اليوم 0، تنبيغ من hPSCs)

  1. لإعداد رد فعل المتوسطة الجمع بين 1.3 مل من التجاري الكامل المصل خالية المتوسطة (انظر الجدول 2)، فيروس، polybrene، وY27632 ROCK المانع (الجدول 1): إضافة 1.3 ميكرولتر من 10 ملي ROCK المانع إلى 1.3 مل المتوسطة إلى concentra النهائينشوئها من 10 ميكرومتر، وpolybrene إلى النهائي تركيز 6 ميكروغرام / مل.
    1. إضافة كمية مناسبة من التركيز الفيروسي (ق) بتركيز نهائي من 0،5-1،0 زارة الداخلية (تعدد العدوى) من كل فيروس لكل خلية. الحفاظ على رد فعل المتوسطة على الجليد أو على 4 درجات مئوية حتى تعليق خلية واحدة مستعدة لذلك.
      ملاحظة: نفس الكمية من وزارة الداخلية لكل الفيروس في GATA1 / ETV2، GATA2 / TAL1، وأخلاط GATA2 / TAL1 / رد فعل LMO2 هو الأمثل لتحريض التمايز. الثقافات ومع ذلك، في ETV2 / GATA2 transduced مضاعفة وزارة الداخلية لGATA2، نسبة إلى ETV2، يعزز التمايز. ويوصى 2 لوزارة الداخلية ETV2 و1 وزارة الداخلية GATA2 (على سبيل المثال إذا يقدر التركيز الفيروسي حوالي 6.8 × 10 7 الجسيمات / مل، إضافة 10 ميكرولتر من ETV2 و 20 ميكرولتر من GATA2 مركزات الفيروسية إلى: ذلك، لهذه الثقافات، ونسبة 1 0.68 × 10 6 خلايا في رد الفعل ETV2 / GATA2 واحد في 35 ملم بئر من لوحة 6 جيدا).
  2. إعداد hPSCs في المعل خلية واحدةension.
    1. تنمو hPSCs في ظروف خالية من وحدة التغذية كما هو موضح في القسم 2. في يوم 4 بعد مرور الماضي، نلاحظ كثافة الخلايا والتشكل تحت مجهر مقلوب. يجب hPSCs تنمو في مستعمرات ضيقة مع حواف حادة مع عدم وجود التمايز عفوية وتصل ~ 60-70٪ confluency في يوم تنبيغ.
    2. نضح المتوسطة، إضافة 1.5-2 مل من تفكك خلية التجاري كاشف (الجدول 1) لكل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 5-7 دقيقة.
    3. جمع الخلايا في كميات متساوية من المتوسط ​​كاملة التجاري (أنظر الجدول 2) مع 10 ميكرومتر من ROCK المانع، عد الخلايا وتحديد الجدوى. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق ثم الخلايا resuspend في المتوسط ​​كاملة التجاري مع 10 ميكرومتر من ROCK المانع إلى تركيز من 3،4-5 × 10 6 خلايا لكل مل.
      ملاحظة: بقاء الخلية أمر بالغ الأهمية لنجاح تنبيغ الفيروسية والتمايز لاحق.عادة، يجب أن بقاء الخلية قبل تنبيغ تتجاوز 90٪.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية، التي تحتوي على ،68-1 X10 6 خلايا، إلى 1.3 مل من وسط التفاعل أعد في 3.1.
  4. نضح حل مصفوفة من بين عشية وضحاها المغلفة لوحة 6 جيدا أعد في 2.2.، نقل خليط التفاعل إلى بئر واحدة من لوحة 6 جيدا وتوزيع الخلايا بالتساوي. احتضان عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة يجب أن ترفق لا يقل عن 80٪ من الخلايا إلى المصفوفة.

4. تحريض Hematoendothelial السلائف من hPSCs (يوم 07/01)

  1. 24 ساعة بعد تنبيغ، وإزالة المتوسطة المحتوية على الفيروس وغسل الخلايا المرفقة مع التجاري مستنبت خلايا غير مكتملة (انظر الجدول 1) ثم قم بإضافة 3 مل لكل بئر من التجاري مستنبت خلايا غير مكتملة تحتوي على السيتوكينات المكونة للدم: SCF 100 نانوغرام / مل، TPO 50 نانوغرام / مل، bFGF 20 نانوغرام / مل (يشار إليها فيما 3F المتوسطة).
  2. استبدال مجموع المتوسطة مع الطازجة 3F المتوسطة في أيام 2 و 3 و 4 يوم لإزالة الخلايا الميتة والحطام. بعد يوم 4، عندما العائمة الخلايا المكونة للدم في الظهور، استبدال نصف 3F المتوسطة كل يوم مع الحفاظ على الحجم الإجمالي في 4 مل.
    ملاحظة: pSIN-EF1α البلازميدات التعبير lentiviral تتضمن بوروميسين الجينات المقاومة مما يسمح لاختيار الإيجابية للخلايا transduced. 1 ميكروغرام / مل من بوروميسين يمكن أن تضاف إلى متوسطة خلال 1-2 أيام الأولى من التمايز للقضاء على أي hPSCs غير متمايزة المتبقية.
  3. مراقبة مورفولوجيا الخلايا في يوم 4 تحت مجهر مقلوب: مجموعات ضيقة من الخلايا البطانية مع التشكل نموذجية تبدأ في الظهور (أرقام 2A، 3A). خلايا الدم مستديرة تظهر من يوم 5 إلى يوم 7 من التمايز، في حين أن بعض المناطق قد تحتفظ hPSCs التشكل. تحليل معالي والتمايز للدم كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: تختلف hematoendothelial الناجحالنتائج ينتقم في إنتاج خلايا الدم التي تظهر خلايا الجولة سهل الانكسار كما فضفاضة يعلق على الخلايا البطانية مسطحة الأساسية. هذه الخلايا تتكاثر بنشاط تشكيل مجاميع صغيرة، وأخيرا فصل وتعويم (أرقام 2A و 3A). خلايا الدم الحية يمكن تمييزها بصريا من الخلايا الميتة والموت على أساس قدرتها على عكس ضوء وتوسيع في ظروف الثقافة.

5. تحليل مكون للدم البطانة Endothelium (HE) مرحلة التمايز.

  1. الكشف عن تشكيل سعادة بين أيام 3 و 4 من التمايز عن طريق الملاحظة المجهرية للخلايا مع التشكل البطانية. لا توجد العائمة خلايا الدم في الثقافة في هذه المرحلة من التمايز. ويمكن التأكد بحضور سعادة التي كتبها تلطيخ مناعي وتحليل تدفق cytometric باستخدام VE كادهيرين، CD73، CD43 CD226 والأجسام المضادة.
    1. لتقييم تشكيل سعادة بواسطة تدفق cytometric الخلايا استخدام التحليل في اليوم 3ويوم 4 من تجربة واحدة. جمع الخلايا التي يحتضنها الثقافات مع التجاري تفكك خلية الكاشف (انظر الجدول 1) لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 ثم استخدام ما يصل إلى 1 × 10 5 خلايا لكل رد فعل تلطيخ (التدفق الخلوي الإجراء تلطيخ هو موضح في 12).
      ملاحظة: VE كادهيرين + HE خلايا اكتساب التعبير في وقت مبكر للدم علامة CD226، ولكنها تفتقر إلى التعبير عن CD73 CD43 و6. في المقابل، خلايا غير HE-التعبير عن CD73 (أرقام 2B، 3B).
  2. تلطيخ المناعي للhPSC المستمدة-HE.
    1. غسل أحادي الطبقة تعلق الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ثم إصلاح الخلايا في 4٪ امتصاص العرق 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. غسل الخلايا مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني ثم permeabilize باستخدام 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. غسل الخلايا في PBS 2-3 مرات ثم احتضان فيعازلة تمنع تتألف من برنامج تلفزيوني مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، لمدة 30 إلى 120 دقيقة.
    4. يعد حل تلطيخ، تحتوي على كل الأجسام المضادة الأولية (1: 1000 تمييع) الماوس CD43 مكافحة الإنسان والأرنب مكافحة البشرية VE كادهيرين في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS، (الجدول 1).
    5. نضح عازلة تمنع من الخلايا وإضافة 1 مل لكل بئر من العازلة تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية المضافة؛ احتضان 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    6. غسل الخلايا ثلاث مرات عن طريق إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS.
    7. إعداد العازلة تلطيخ الثاني، التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية في 1: 500 التخفيف في برنامج تلفزيوني مع 5٪ FBS: حمار المضادة للأرنب مترافق مع صبغة الفلورسنت الأخضر، ومكافحة فأر مترافق مع صبغ أحمر فلوري (الجدول 1). إضافة 1 مل لكل بئر من العازلة تلطيخ الثانوي ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    8. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني دون المصل. خلايا صمة عار مع حل 300 نانومتر دابي العمل في DH2 O لمدة 10-15 دقيقة.
    9. غسل الخلايا مع PBS مرتين وإضافة 2-3 مل من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا بشكل جيد مع الملون. مراقبة مضان مع الأخضر والأحمر والأزرق مرشحات المجهر.

6. تحليل المستحثة لدم السلائف

  1. الحفاظ على الثقافات تمايز الخلايا العائمة حتى تتوسع بشكل ملحوظ، ما يصل الى 10-14 يوما، وتغيير نصف 3F المتوسطة، كما هو موضح في 3.1، كل يومين.
  2. فصل وجمع تمييز الطبقات الوحيدة من الخلايا عن طريق علاج الخلايا مع كاشف تفارق خلية التجاري (انظر الجدول 1) لمدة 5-10 دقيقة عند 37 ° C، 5٪ CO 2.
  3. أداء التدفق الخلوي باستخدام مكافحة VE كادهيرين، CD43 CD45 والأجسام المضادة لتقييم تكون الدم في الثقافات 12. لاحظ أن جزء كبير من الخلايا، وتصل إلى 40٪ من الخلايا ETV2 وGATA2 transduced، وشارك في يعبر عن VE-نذل وCD43. الأجسام المضادة التالية يمكن أن تستخدم لكشف الأنساب الخلية المحددة التالية هxpansion أو تمايز الناجم عن الأسلاف الدم: CD235a (خلايا محمر)، CD41a (النواءات)، CD32 (جميع أنواع خلايا الدم النخاعي)، CD66b (العدلات) وCD163 (الضامة).
  4. أداء CFC-فحص باستخدام وسيلة مولد الرمع التجاري (الجدول 1) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    1. نقل 1-2 × 10 4 خلايا في 3 مل من المتوسط ​​مولد الرمع التجاري (أنظر الجدول 3) لتقييم عدد من الخلايا المكونة للمستعمرة وأنواع المستعمرات المكونة للدم. كثافة البذر مثلى تسمح لتحديد وعزل المستعمرات واحد التي تنمو بشكل منفصل عن بعضها البعض وتتداخل لا. قد تختلف كثافة بذر بين التجارب اعتمادا على كفاءة التمايز، ولكن يجب أن لا تتجاوز 1 × 10 4 خلايا لكل 1 مل من المتوسط ​​مولد الرمع التجاري.
    2. خلط الخلايا في المتوسط ​​مولد الرمع التجاري من قبل vortexing لطيف، ونقل 3 مل من تعليق لمدة 35 ملم أطباق مرفق منخفضة للغايةلفحص مركبات الكربون الكلورية فلورية، 1.5 مل من التعليق على كل طبق. توزيع بالتساوي المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 14 يوما. تجنب إزعاج الأطباق. مراقبة تشكيل مستعمرة في يوم 7 ويوم 10 من الفحص.
    3. تحديد والاعتماد المستعمرات المكونة للدم وفقا لالأشكال التضاريسية بها في يوم 14.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر الرسم التخطيطي للسعادة وتحريض الدم من hPSCs التي كتبها overexpression من عوامل النسخ في الشكل 1. ETV2 مع GATA1 أو GATA2 مزيج يدفع تكون الدم عموم النخاعي، في حين أن GATA2، TAL1 +/- مزيج LMO2 يدفع في الغالب تكون الدم erythro-النواءات. كلا مجموعات TF يسببها مباشرة خلايا سعادة التي حولت لاحقا إلى الأسلاف الدم مع مجموعة متميزة من التمايز للدم. تمايز hPSCs من الدولة المحفزة للدم ينتج سعادة يأخذ في المتوسط ​​4 أيام. خلايا الدم الجولة الأولى ظهرت من يوم 5 من التمايز....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

طريقة المبين أعلاه للدم تمايز hPSCs التي كتبها overexpression من TFS، يمثل نهجا السريع والفعال للجيل معالي والنخاعي وerytho magakaryocytic الأسلاف من hESCs وiPSCs، مما يسمح للإنتاجية تصل إلى 30 ملايين خلايا الدم من مليون الخلايا الجذعية المحفزة 10. هذه الطريقة تعرض التمايز المستمر في عدة HESC وiPSCs خطوط 10. خلال التمايز التي كتبها ETV2 وGATA2، والعوامل GATA1 وكذلك GATA2 وTAL1 العوامل، تشكل خلايا البطانة الدم المنتجة، ومعالي وتخضع لالبطانة إلى الانتقال للدم. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

IS هو أحد المساهمين المؤسسين ومستشار لCynata.

شكر وتقدير

نشكر مات ريموند على المساعدة التحريرية. تم دعم هذا العمل بأموال من المعهد الوطني للصحة (U01HL099773 و R01HL116221 و P51 RR000167) ومؤسسة شارلوت جير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الفيروسات تفكك الخلايا وسط الخلية>
< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" fo: keep-with-previous.within-page = "دائما" ><قوي>الجدول 1.< / strong> تحريض تمايز hPSCs مع عوامل الانتقال وتحليل البطانة الدموية وخلايا الدم.< / strong>< / p>
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro AddgenePlasmid # 61061Lentiviral Vector
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro أدرجينبلازميد # 61063ناقلات الفيروسات
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro أدرجينبلازميد # 61062ناقلات الفيروسات الخالية
من الفيروسات pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro أدرجينبلازميد # 61062ناقلات الفيروسات
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro أدجينبلازميد # 61064ناقلات
الكريهة سداسي ديميثرين بروميد (بوليبرين)  Sigma-Aldrich107689-10Gبوليمر كاتيوني يستخدم لزيادة كفاءة العدوى
Y-27632 (ثنائي هيدروكلوريد) مثبط ROCKSTEMCELL Technologies72302مثبط مسار RHO / ROCK يثبط كاشف
تفكك خلايا ROCK StemProAccutase Life Technologies< / a>A11105-01كاشف
وسط ثقافة غير مكتمل (خال من عامل النمو)                                                                                           mTeSR1 تركيبة مخصصة معهد أبحاث WiCell (ماديسون ، ويسكونسن)MCF< اسم = "النطاق! D12 "> مصل خال من المصل mTeSR1 متوسط بدون bFGF و TGFb   ؛ < / a >
الإنسان SCFPeprotech300-07بشري من الدرجة الممتازة
TPOPeprotech300-18من الدرجة البحثية
البشرية FGF-basicPeprotech100-18Bدرجة ممتازة
CD144 (VE-cad) FITCBD Biosciences560411علامة البطانية (FACS)
CD226 PEBD Biosciences338305مكونة للدم ( FACS)
CD43 PEBD Biosciences560199مكونة للدم (FACS)
CD73 APCR & D SystemsFAB5795Aعلامة البطانة (FACS)
CD45 APCBD Biosciences555485مكونة للدم (FACS)
7AADLife TechnologiesA1310اختبار Live / Dead (FACS)
Paraformaldehyde   ؛Sigma-AldrichP6148-500Gتثبيت الخلية 
Triton X-100  سيجما ألدريتشT9284-500ML النفاذية 
FBSFisher ScientificSH3007003مصل الأبقار الجنيني
الفأر المضاد للإنسان CD43BD Biosciences551457النقي ، الجسم المضاد الأساسي لتلوين التألق المناعي (IF)
الأرانب المضادة للإنسان VE-cadherinBenderMedSystemBMS158الأولية (IF)
المضادة للأرانب Alexa Fluor 488 المترافقةJacksonResearch715-486-152الثانوية (IF)
مكافحة الفأر Alexa فلور 594 مترافقJacksonResearch715-516-150 المرحلة الثانوية (IF)
صبغة الحمض النووي DAPILife TechnologiesD1306 اختبار الحي/الميت (IF)
Clonogenic medium MethoCult H4435 EnrichedSTEMCELL Technologies4435CFC-assay
Wright Stain solutionSigma -Aldrich32857تلطيخ السيتوبينز
< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" fo: keep-with-previous.within-page = "دائما" >< / p>
< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" fo: keep-with-previous.within-page = "دائما" ><قوي> الجدول 2.< / strong> hPSCs culture.< p>
Human Pluri Potent Stem Cells (hPSCs) معهد أبحاث WiCell (ماديسون, ويسكونسن)hESCs (WA01, WA09) الخلايا الجذعية الجنينية البشرية; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة خالية من الجيناتhPSCs قادرة على التجديد الذاتي والتمايز إلى خلايا من ثلاث طبقات جرثومية
كامل خالية من المصل لثقافة hPSCs                                                                                                      mTeSR1 media   معهد أبحاث WiCell (ماديسون ، ويسكونسن)M500   ؛وسط خال من المصل مع عوامل نمو للثقافة الخالية من المغذيات من ESC / iPSCs
MatrigelBD Biosciences/ Corning مصفوفة 356234لصيانة ESC / iPSCs البشرية
DMEM / F-12 ، مسحوق   ؛Life Technologies12500-062Basal Medium 
مسحوق PBS من HyClone Dulbeccoفيشر ScientificdSH30013.04PBS
Dispase II ، مسحوقLife Technologies< / a>17105-041البروتياز المحايد ، تفكك
< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" fo: keep-with-previous.within-page = "دائما" ><قوي>الجدول 3.< / strong> بادئات للكشف عن التكامل الجيني للفيروس.< / strong>< / p
اسم التمهيدي < / قوي><قوي>إلى الأمام (Fwd)  5 ' -->3' < / قوي >< قوي > عكس (قعف) 5 '- > 3 ' Discription  < / strong>
pSIN EF1a FwdTTC CAT TTC AGG TGT CGT GA--EF1a تسلسل المروج
GATA1 Rev-TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC  ؛ منطقة الترميز 
GATA2 Rev-GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG &NBSP ؛ منطقة الترميز 
TAL1 Rev-AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT& NBSP ؛ منطقة الترميز 
LMO2 Rev-GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC&NBSP منطقة الترميز 
ETV2 Rev-GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC   منطقة الترميز 

المراجع

  1. Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
  2. Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
  3. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
  4. Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
  5. Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
  6. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
  7. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
  8. Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
  9. Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
  10. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372(2014).
  11. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
  12. Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6(2007).
  13. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ETV2 GATA1 GATA2 TAL1 LMO2
الحث المباشر للمكون للدم البطانة Endothelium والدم عن طريق overexpression من العوامل المحفزة النسخ في الإنسان الخلايا الجذعية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.