مقالة منهجية

مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

DOI:

10.3791/52948

⸱

يونيو 12, 2015

 ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, California State University, Long Beach, 2Ximedica, 3School of Engineering, Brown University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد هجرة الخلايا جزءا مهما من التنمية البشرية والحياة. من أجل فهم الآليات التي يمكن أن تغير هجرة الخلايا ، نقدم نظام انتشار متدرج مستو للتحقيق في الانجذاب الكيميائي في مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد ، والتي تسمح للمرء بالتغلب على قيود غرفة الانتشار الحديثة للمقايسات الحالية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن رؤية أهمية هجرة الخلايا من خلال تطور الحياة البشرية. عندما تهاجر الخلايا ، فإنها تولد قوى وتنقل هذه القوى إلى المنطقة المحيطة بها ، مما يؤدي إلى حركة الخلايا وهجرتها. من أجل فهم الآليات التي يمكن أن تغير و / أو تؤثر على هجرة الخلايا ، يمكن للمرء دراسة هذه القوى. من الناحية النظرية ، فإن فهم الآليات والقوى الأساسية الكامنة وراء هجرة الخلايا يبشر باتباع نهج فعالة لعلاج الأمراض وتعزيز الزرع الخلوي. لسوء الحظ ، عادة ما تقتصر غرف الانجذاب الكيميائي الحديثة التي تم تطويرها على بعدين (2D) ولها تدرجات انتشار معقدة تجعل من الصعب تفسير التجربة. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير ووصف غرفة المشاهدة المباشرة لدراسات الانجذاب الكيميائي ، والتي تسمح للمرء بالتغلب على عقبات غرفة الانجذاب الكيميائي الحديثة القادرة على قياس قوى الخلية والتركيز المحدد داخل الغرفة في بيئة ثلاثية الأبعاد لدراسة هجرة الخلية ثلاثية الأبعاد. والأكثر إقناعا ، يسمح هذا النهج للمرء بنمذجة الانتشار بنجاح من خلال مصفوفات الكولاجين ثلاثية الأبعاد وحساب معامل انتشار الجاذب الكيميائي من خلال تركيزات مختلفة متعددة من الكولاجين ، مع الحفاظ على النظام بسيطا وسهل الاستخدام للفحص المجهري لقوة الجر (TFM) وتحليل ارتباط الحجم الرقمي (DVC).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حركة يفضل الخلايا نحو الانحدار تركيز، والمعروفة باسم الكيميائي، تلعب دورا هاما في العمليات المرضية والفسيولوجية في الجسم. هذه الأمثلة هي الجلد والغشاء المخاطي التئام الجروح 1، 2 التشكل، التهاب 3، و4،5 نمو الورم. وقد تبين أيضا أن الخلايا السرطانية يمكن أن تهاجر من خلال استراتيجيات كل من الخلية الهجرة الفردية والجماعية 6. وعلاوة على ذلك، يمكن لآليات عدم الاستقرار الأنتشارى لحث على فصل الخلايا واحد أو عنقودية من الجسم ورمي / الكائن ومن ثم يمكن أن يهاجر نحو مصدر من المواد الغذائية، وبالتالي غزو المناطق والأنسجة 7 أوسع.

وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن آليات الهجرة المتنوعة يمكن أن تكون نشطة في 2D و 3D في، وذلك بسبب الأدوار المختلفة للجزيئات الالتصاق 8. لذلك، خطوة إلى أهمية من الناحية الفسيولوجية في فحوصات المختبر للتحقيق في الحركة خلية في measureablه وسيلة بسيطة غير ذات أهمية في فهم حركة الخلية الظواهر 9. لسوء الحظ، وصعوبة في تحليل الهجرة الخليوي، وفحص شامل الكيميائي الكمي وعادة ما يتطلب طريقة شاقة طويلة، تقوم على قياس حركية الخلية والظواهر النقل نماذج محايدة.

وتشمل النهج التجريبية الماضية للتحقيق الكيميائي خلية الغرفة بويدن 10 وتحت الفحص الاغاروز 11. ومع ذلك، في هذه المقايسات في وقت مبكر، والتجارب الهجرة الخلية لم ترصد الحركة في احترام لآخر. أكثر من ذلك، الأهم من ذلك، التدرجات تركيز المستخدمة في التجارب لم تكن واضحة المعالم أو مفهومة تماما مع الحفاظ فقط إشارات لمدة لا تتجاوز بضع ساعة. وعلاوة على ذلك، الكيميائي في وقت مبكر محاولات غرفة تقييد الهجرة الخلية على بعدين، ولم تسمح لأحد لمراقبة حركية الهجرة 12. أبحث في غرفة بويدن، وهو فحص نقطة النهايةلن يسمح للباحث لمراقبة الهجرة بصريا، ولا يمكن التفريق مباشرة الكيميائي (حركة الاتجاه) من تنشيط كيميائي (حركة عشوائية). بالإضافة إلى ذلك، العديد من المتغيرات على الاختلافات في حجم المسام وسمك الأغشية جعل غرفة صعبة للغاية لتتكاثر بسهولة وأخفى رد فعل المهاجرين من الخلايا لكيموكينات 13،14.

مع الفهم الجديد من على microfluidics، وقد تم التحقيق غرف جديدة والأجهزة الدقيقة كأداة لتحقيق تنقل الخلية تحت ظروف تدفق فراغي أو الكيميائي 15،16. في ظل هذه الأجهزة الجديدة، أدخلت مقاييس خلية جديدة والتحقيق، مثل تأثير إجهاد القص على خلية 17،18. للأسف، غرف الكيميائي ميكروفلويديك السابقة والحالية دراسات الهجرة خلية تقتصر على ركائز و2D نكسة مهمة لأن العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك غزو الخلايا السرطانية وورم خبيث، والتراسل الفوريهجرة الخلايا المناعية، تنطوي الهجرة 3D.

حل جاذب كيميائي في اتصال مع هلام 3D التي تحتوي على الخلايا كما تم ذكر فيها غرف للمراقبة المباشرة أيضا 19،20. هذه الدوائر واثنين من مقصورات، واحدة تحتوي على جاذب كيميائي واحدة تحتوي على الخلايا، وانضم بجانب بعضها البعض أفقيا 21 أو حلقات متحدة المركز 22. وأشار هذه النظم في الاتجاه الصحيح، ولكن لا تبقي نظام الكيميائي لفترة طويلة من الزمن.

وعلاوة على ذلك، درس الباحثون أيضا انتشارية من خلال الأغشية الكولاجين في خلايا غسيل الكلى، فضلا عن انتشار جزيئات التتبع من خلال عينات الكولاجين تعرض لضغط الهيدروستاتيكي 23-25. بعض التجارب نشر في المواد الهلامية الكولاجين تعتمد على التعديلات الفيزيائية والكيميائية للالجل باستخدام المجالات المغناطيسية والتأسيس الكيماوية 26. وهناك طريقة شعبية لنمذجة الانتشارية في أعناقالأنسجة genous تعتمد على التصوير مضان المستمر نقطة photobleaching من. وقد كشفت هذه الطريقة تباين في معاملات نشر من الجزيئات في الأنسجة الكولاجينية المنحى. بعد، وقد استخدمت photobleaching من في الغضروف المفصلي وليس الكولاجين المصفوفات. في حين ما شابه ذلك، يجب أن تتم التجارب النمذجة اللازمة من خلال فهم على وجه التحديد معامل انتشار المواد الهلامية الكولاجين. الأهم من ذلك أن الأنظمة لا تستخدم وسيلة لقياس الجيل قوة الخلية.

للأسف، يبدو أن معظم الأنظمة ليكون في عداد المفقودين واحد أو اثنين من العناصر الرئيسية للنظام مثالي: والسماح للتتبع الخلية، فهم نشرها التدرج مع عامل الكيميائي من خلال مصفوفة، مجموعة بسيطة نسبيا حتى مع سهولة استنساخ، والتقليل من التفاعلات خلية خلية، والقدرة على قياس وحدة الأبعاد لالكمي (أي السرعة، القوة، وتركيز معين). Moghe وآخرون. 27 اقترح نظاما الوفاء معظم هذه المتطلبات في الخلايا التي فرقت البداية في جميع أنحاء هلام بدلا من ركز على سطح المرشح، ولكن كان من الصعب قياس القوى التي تولد الخلية.

لهذا الغرض، نقدم نظام مستو التدرج نشرها للتحقيق الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D، الذي يسمح احد للتغلب على القيود غرفة نشر الحديثة للفحوصات الحالية، التي تقوم على أساس الوقت الفاصل بين المجهري، إلى جانب تقنيات تحليل الصور لقياس الخلية القوات في بيئة 3D. يوفر هذا البروتوكول وسيلة بسيطة، لكنها مبتكرة لخلق 3D بسيطة نشرها الغرفة التي يمكن استخدامها لتحقيق الكيميائي 3D في خلايا مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D قالب تصميم وأجزاء

  1. قالب
    1. قبل العمل، الحصول على عدة سيليكون المطاط الصناعي، وغرفة التصوير الخلية الحية، وكوب 22 ملم ساترة، وتشكيله المعادن مكعب مع أبعاد 10.07 مم × 3.95 مم × 5.99 ملم. إعداد الحية غرفة التصوير الخلية صب من خلال وضع ساترة في حامل القاع، وتجميع ما تبقى من الغرفة وفقا لتوجيهات من قبل البائع.
    2. المقبل، وذلك باستخدام ملقط، ضع تشكيله مكعب معدن الألمنيوم في وسط الحي التصوير الخلية غرفة السكن وعلى رأس ساترة، ثم توضع جانبا.
    3. مزيج حلول المطاط الصناعي السيليكون وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لجعل 5 مل من المطاط الصناعي.
    4. باستخدام مختبر ملعقة المتاح، صب سيليكون حل المطاط الصناعي في العيش التصوير الخلية إعداد غرفة وضمان عدم نقل ضعت تشكيله مكعب معدن الألمنيوم. وضع النظام على مقاعد البدلاء المختبر في موقع آمن O / N لعلاج.
    5. في صباح اليوم التالي، تفكيكغرفة التصوير الخلية الحية، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة وسحب العفن باستخدام الملقط. باستخدام ملقط، استخراج بعناية تشكيله مكعب معدن الألمنيوم من العفن. الذهاب إلى الحوض وشطف القالب بالماء منزوع الأيونات. وضع القالب على منشفة ورقية لتجف.
    6. الجاف مرة واحدة، وذلك باستخدام سكين فائدة هواية، وقطع الشقوق من خلال القالب، متباعدة 2.34 مم وبصرف النظر عن كل نهاية الطولية، داخل القالب السيليكون. ضمان إقامة العفن في مكان آمن وجاف حتى كنت على استعداد لبناء نظام للتجربة.
  2. مع الماء والزجاج مسعور إعداد Coverslips
    1. للسماح للمصفوفة الكولاجين التمسك السطح، وخلق coverslips ماء:
      1. باستخدام ماصة القابل للتصرف، وقياس من 150 ميكرولتر من 3 أمينو-trimethoxysilane وتصب حل في أنبوب 50 مل. إضافة 30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى أنبوب 50 مل مع ماصة المتاح الثانية وإغلاق الغطاء. دوامة الحل لمدة 2 دقيقة، وضمان خلط كاملة. Pالحل لدينا في طبق بتري الزجاج ويوضع جانبا.
      2. صب 15 مل من 100٪ الكحول الإيثيلي في طبق بيتري الثاني ويوضع جانبا (تأكد من تسمية الأطباق).
      3. باستخدام ماصة المتاح جديدة، وقياس من 30 مل من الماء منزوع الأيونات وتصب حل في أنبوب 50 مل. المقبل، وذلك باستخدام مقياس ماصة للتصرف جديد من 1875 ميكرولتر من غلوتارالدهيد وتصب الحل في نفس أنبوب 50 مل وإغلاق الغطاء. دوامة الحل لمدة 2 دقيقة، وضمان خلط كاملة. صب الخليط في طبق بيتري الثالث، ويوضع جانبا.
      4. باستخدام ملقط، واخراج واحد 22 ملم الزجاج جولة ساترة وشطف كلا الجانبين مع 100٪ خليط من الإيثانول باستخدام ماصة المتاح.
      5. وضع تشطف ساترة الزجاج إلى 3-أمينو-trimethoxysilane مع 30 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ طبق الحل والسماح للجلوس في حل لمدة 5 دقائق.
      6. بالملقط، واخراج الزجاج ساترة وشطف مرة أخرى مع 100٪ من محلول الإيثانول مع ماصة المتاح.
      7. إسقاط تشطف ساترة الزجاج في 1875ميكرولتر من غلوتارالدهيد و 30 مل من خليط الماء منزوع الأيونات ويوضع جانبا لمدة 30 دقيقة.
      8. بعد 30 دقيقة، وإزالة الزجاج ساترة مع ملقط وشطف مع الماء منزوع الأيونات ومكان على O الأنسجة الجافة / N لتجف في RT.
      9. تكرار غمس ساترة ونقل عن العديد من coverslips حسب الحاجة مع حلول لدت نفسها.
    2. جعل coverslips مسعور بواسطة بروتوكول معين.
      1. إضافة 500 ميكرولتر من tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl، 100 ميكرولتر من حمض الخليك و 19.4 مل من الهكسان في أنبوب 50 مل ودوامة لمدة 2 دقيقة. صب الحل في الزجاج طبق بتري وتوضع جانبا.
      2. باستخدام ملقط نظيفة، واخراج واحدة ساترة الزجاج وتسقط في تحضير محلول مختلط لمدة 2 دقيقة. بعد مرور 2 دقيقة، واخراج الزجاج ساترة مع ملقط وشطف مع الماء منزوع الأيونات باستخدام المتاح ماصة ومكان ساترة O الأنسجة الجافة / N لتجف في RT. متجر ساترة في أطباق بتري بلاستيكية حتى استخدامها.
      3. كرر ساترة DIPPجي والتحرك لأكبر عدد ممكن من coverslips حسب الحاجة مع حلول لدت نفسها.

الجمعية 2. القالب

  1. قبل استخدام القوالب، وذلك باستخدام ماصة المتاح شطف القالب مع 90٪ ايثيل الكحول أكثر من حاوية النفايات الكيميائية. بعد ذلك، وضع القالب في طبق بيتري مملوءة بالماء منزوع الأيونات والسماح للجلوس O / N.
  2. تأخذ قالب من الحل باستخدام ملقط ومكان على منشفة على الهواء الجاف قبل بدء التجمع العفن.
  3. في حين أن العفن هو تجفيف الهواء، وقطع لل coverslips ماء مربع الى قسمين المستطيلات أكبر قليلا من 3.95 مم × 5.99 مم باستخدام أداة يخدش الماس عالية الدقة. حرك كل ساترة قطع مستطيل في فتحات قطع في قالب السيليكون.
  4. الوجه العفن رأسا على عقب وتطبيق الشحوم فراغ على طول الجزء السفلي من القالب السيليكون باستخدام ماصة المتاح. المقبل، والوجه العفن الظهر من الناحية اليمنى فوق واضغط على الجزء السفلي من العفن على دائرية يغطي الزجاج ماءالشفاه لإنشاء ختم.
  5. مع القفازات القابل للتصرف، والتقاط العفن تجميعها ووضعها في طبق بتري المتاح ومن ثم إلى غطاء محرك السيارة الحيوي. تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية الحيوية غطاء محرك السيارة لمدة 1 ساعة لتعقيم العفن قبل حدوث التجريب.

3. الكولاجين الخلطات و مصفوفة 3D

  1. قبل إعداد مزيج الكولاجين، وصمة عار، وإعداد الخلايا لتصوير وفقا لبروتوكولات القياسية 28.
  2. باستخدام التقنيات المخبرية المعيارية والبروتوكولات 29،30، في القلنسوة الحيوية، مزيج سائل الاعلام الخلية وجاذب كيميائي في أنبوب 15 مل إلى تركيز جاذب كيميائي المطلوب. ماصة 5 مل من خلية حل معين وسائل الإعلام جاذب كيميائي التركيز في أنبوب 15 مل ونقل الحل في حمام الماء الساخن.
  3. باستخدام ماصة، استخراج 5 مل من وسائل الاعلام الخلايا عادلة في الثانية أنبوب 15 مل ومكان في حمام الماء الساخن لتسخين حل للتجارب المجهري.
  4. في القلنسوة الحيوي، ماصة 30 ميكرولتر من 10X العازلة الفوسفاتإد حل (PBS) في أنبوب الطرد المركزي الجزئي. إضافة 6 ميكرولتر من 1 هيدروكسيد الصوديوم N (هيدروكسيد الصوديوم) في نفس أنبوب الطرد المركزي الصغيرة ودوامة لمدة 15 ثانية.
  5. الحصول على الكولاجين أنا حل ذيل فأر من الثلاجة والانتقال إلى غطاء محرك السيارة الحيوي باستخدام التقنيات المخبرية المعيارية والبروتوكولات 29. ضمان الكولاجين لا يزال باردا. ماصة 168.3 ميكرولتر من الكولاجين في نفس أنبوب الطرد المركزي الجزئي.
  6. المقبل، إضافة 18 ميكرولتر من المجهرية المعدلة الكربوكسيل الفلورسنت الأصفر والأخضر باستخدام ماصة لنفس أنبوب الطرد المركزي الجزئي. دوامة أنبوب الطرد المركزي الجزئي مع جميع الحلول لمدة 30 ثانية.
  7. إضافة 77.7 ميكرولتر من المطلوب خليط الخلية خلية الإعلام (حوالي 2 × 10 6 خلية / مل تركيز) إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة وتخلط باستخدام ماصة لمدة 20 ثانية. عند الضرورة، تغيير كثافة مصفوفة باتباع الخليط الكولاجين مخصص تكييفها لإضافة الخرز الفلورسنت والجدول بقاء الخلية (الجدول 1).
  8. ماصة 300 & #181؛ ل من مزيج خلايا الكولاجين في مركز جيد (جيد # 2) من التجمع قالب استعداد. وضع القالب على طبق بتري المتاح ونقلها إلى الحاضنة القياسية لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  9. إزالة النظام من الحاضنة والمكان مرة أخرى إلى الحيوي غطاء محرك السيارة. باستخدام ملقط، إزالة كل زلات غطاء مسعور من قبل تحامل على الجزء العلوي من كل ساترة وسحب ما يصل، وبعيدا عن القالب.
  10. نقل النظام برمته إلى المجهر المطلوبة وصورة للتأكد من الجانبين الكولاجين العفن لا تزال على التوالي للسماح التدرج مستو نشرها.
  11. مع نظام لا يزال تحت المجهر، وذلك باستخدام 100 ميكرولتر على قناة واحدة ماصة، إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام الخلية إلى جانب # 1. المقبل، وذلك باستخدام 100 ميكرولتر على قناة واحدة ماصة إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام الخلية مع تركيز جاذب كيميائي المطلوب في بئر رقم 3.
  12. على الفور بعد إضافة الحلول في كلا البئرين، بدء التصوير.

4. التصوير وإنتشارتصميم

  1. إذا كان أحد يريد أن يجد معامل الانتشار لكثافة الكولاجين محددة لحساب تركيز محدد، اتبع بروتوكول أدناه:
    1. متابعة بروتوكول معين بعنوان فوق "الكولاجين الخلطات و مصفوفة 3D"، بدلا من توليد وسائل الاعلام الخلية مع تركيز جاذب كيميائي المطلوب، وجعل رودامين 5 ميكرومتر في أنبوب 15 مل باستخدام العمليات الحسابية والبروتوكولات 30 القياسية.
    2. صورة مصفوفات الكولاجين 3D مع نظام متحد البؤر التي شنت على مجهر مقلوب باستخدام الليزر الأرجون (488 نانومتر) لالتقاط مضان. صورة كل 2 أو 3 ثانية لمدة تصل إلى 7 ساعات.
  2. لإنتشار النمذجة: استخدام نموذج رياضي هو مبين أدناه، وكتابة رمز البرنامج الحاسوبي لمعالجة وتحليل هذه الخطوات العامة.
    figure-protocol-1
    1. استيراد الصور إلى برنامج حاسوبي لإعادة قياس وتطبيع كتبها أقصى intenSITY. تحويل الصور إلى اللون الرمادي اللون خريطة الصورة لتحديد الحافة. اختيار محور على طول وسط الصورة، إلى يمين الوسط ويسار الوسط.
    2. باستخدام رمز البرنامج الحسابي، رسم كثافة طبيعية، جنبا إلى جنب مع كثافة الحقيقية والفرق بينهما.
    3. المقبلة، وإدخال المعلمات الضرورية للتركيب (تركيز، والوقت، وطول).
    4. رسم تركيز تطبيع مقابل الوقت وبيان التركيز عبر محور س مع نوبة متعدد الحدود على البيانات.
    5. حساب معامل الانتشار باستخدام شفرة برمجية الحسابية.

5. القياسات التجريبية

  1. وبالعودة إلى معادلة الانتشار، إعادة كتابة المعادلة للعثور على تركيز معين في أي مكان داخل النظام كما هو مبين في أدناه.
    figure-protocol-2
    أين:
    L = طول عشرالبريد الكولاجين مصفوفة
    س = الموقع قيد التحقيق
    D = معامل الانتشار
    ر = الوقت المنقضي
  2. خلال التجارب الكيميائي، وضمان لتسجيل وقت محدد أن chemokine اللحظة التي تم إضافتها إلى النظام. مرة واحدة يتم العثور على حركة الهجرة الخلية، وضمان لتسجيل متحد البؤر تسجيل مرور الزمن، ولاحظ في الوقت المحدد والمكان من حافة حيث وقعت التصوير.
  3. خلال تحليل البيانات، والمكونات وأشار انقضى الوقت والمكان ومعامل الانتشار للخلية معينة في المعادلة للعثور على تركيز معين تطبيع في أي نقطة داخل الكولاجين لكلا نشر والتجارب الخلية.

6. تتبع هجرة الخلايا الاستفادة TFM

  1. لتتبع هجرة الخلايا باستخدام تقنيات TFM / DVC اتباع البروتوكول التالي:
    1. بعد إضافة تركيز جاذب كيميائي المطلوب في بئر رقم 3، بدء التصوير المصفوفات الكولاجين 3D مع نظام متحد البؤر التي شنت على ميكر مقلوبoscope للعثور على خلية للتحقيق.
    2. مرة واحدة تم العثور على خلية تتحرك، وضع الخلية في منتصف مجال الرؤية والاستفادة من محرك كهربائي ضغطي (للصورة في محور ض)، وصورة كل 1 أو 2 دقيقة.
    3. لحساب جيل قوة الخلية وتشوه، وتوليد رمز الحسابية للعثور على النزوح من الخرز مضان بعد بروتوكولات TFM / DVC 31.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدرة هذا الاختبار إلى تقييم دقيق للهجرة الخلية تعتمد على الإعداد الجيد للنظام. لذا، فمن الأهمية بمكان للتأكد من تصميم القالب نظام نشر بدقة وعناية كبيرة في وضع coverslips على حد سواء مسعور وماء، كما هو موضح في الشكل رقم 1. إذا تم تصميم النظام بشكل صحيح وخلال مرحلة نمذجة انتشار ضمان لإيجاد جدا حسن خط البداية الخطي، واحد قادر على تحقيق طيفة تتفلور الصور، كما هو مبين في الشكل 2، لتحليل نشر النظام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الأكثر أهمية للتجارب الناجحة نشر مع أو بدون الخلايا هي: إعداد بشكل صحيح تصل الجمعية العفن. تطوير ما يلزم من البراعة اليدوية لمنع الضرر أثناء استخراج coverslips مسعور. ضمان للعثور على خط الانطلاق خطي جيد جدا لحساب معامل الانتشار بشكل صحيح؛ تصحيح الحسابات التجريبية من كل من الكولاجين وجاذب كيميائي. استخدام صحيح للنظام تصوير الخلايا الحية لضمان مصفوفة لا تجف. والحفاظ على عقيمة، ثقافة صحية.

عند إجراء التجارب ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم للدكتورين جوناثان رايشنر وأنجل بيرد لرؤية تجربة الخلية. دعم برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم (GRFP) هذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم المطاط الصناعي من السيليكونDow Corning Corp182 SIL ELAST KIT .5KGعبارة عن رذاذ من جزأين مع غرفة تصوير الخلية الحية 10: 1 مزيج
Cell InstrumentCM-B18-1CMB ل 18 & nbsp ؛ مم أغطية مستديرة
22   ؛ مم غطاء زجاجيفيشر ScientificNC0180281Neuvitro Corp. غطاء زلة 22   ؛ مم 1.5
معدني من الألومنيوم تشكيله
سكين أداة هوايةX-ActoX3201
3- (أمينوبروبيل) ثلاثي ميثوكسيسيلانسيجما-ألدريتش281778-5 مل
جلوتارالديهايدPolysciences، Inc00216A-10جلوتارالديهايد ، درجة EM ، أنبوب 8٪
50 ملفيشر Scientific14-432-22الطابق القياسي طرد مركزي نموذجي ومنضدية
بتري زجاجيفيشر ساينتفيك08-747Aأطباق بتري قابلة لإعادة الاستخدام: كاملة (60 × 15   مم)
ملقطفيشر العلمي22-327-379ملقط النقطة
الدقيقة غطاء نظاراتفيشر Scientific12-518-105Aمستطيل ؛ 30 × 22   ؛ المليمتر; السماكة رقم 1
Tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctylGelestSIT8174.0
حمض الخليكSigma-Aldrich320099كاشف حمض الخليك ACS ، & ge ؛ 99.7٪
هكسانسيجما ألدريتش296090لامائي ، 95٪
كحول إيثيليسيجما-ألدريتشE7023200 دليل ، للبيولوجيا الجزيئية
أداة الكتابة الماسية عالية الدقةLunzerPV-081-3كاتب طرف ممتد مستقيم ، .020 "(.50   مم) بقطر .200 بوصة (5.0 & nbsp ؛ مم) طول الطرف
فراغ الشحومداو كورنينج14-635-5Cشحم عالي الفراغ
15 مل أنبوبفيشر Scientific14-959-49D15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية مع سطح كاره للماء وخامل بيولوجيا
10x محلول مخزن الفوسفاتفيشر ScientificBP399-5001.37 م كلوريد الصوديوم ، 0.027 م كلوريد البوتاسيوم ، و 0.119 م عازلة الفوسفات
1 & nbsp ؛ N هيدروكسيد الصوديومSigma-Aldrich38215مركز هيدروكسيد الصوديوم
الكولاجين الأول ، ذيل الفئرانBD Biosciences354236ذيل الفئران   ؛
أنبوب الطرد المركزي الصغيرفيشر سيانتيفك02-681-332الحجم: 2.0 مل ؛
OD × L: 13   ؛ x  40  المليمتر;
معقم ؛ أحادي الملفوف
[header]
الكريات المجهرية المعدلة بالكربوكسيلInvitrogen  ؛ F-8813كريات مجهرية معدلة بالكربوكسيل ، 0.5 وميكرو ؛ م ، فلورسنت أصفر وأخضر (505/515) ، 2٪ مواد صلبة
RhodamineSigma-Aldrich83689Rhodamine B للتألق
من Live مكعب طبق

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225 (2), 236(1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).
  3. Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).
  4. Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).
  5. Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).
  6. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).
  7. Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).
  8. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  9. Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell's sense of direction. Science. 284 (5415), 765-770 (1999).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  11. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  12. Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).
  13. Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).
  14. Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).
  15. Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).
  16. Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).
  17. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).
  18. Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).
  19. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  20. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
  21. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  22. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
  23. Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).
  24. Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
  25. Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).
  26. Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. dL. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).
  27. Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).
  28. Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).
  29. Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754(2012).
  30. Stephenson, F. H. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , Elsevier Science. (2010).
  31. Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
  32. Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).
  33. Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة