هنا ، نستهدف بشكل انتقائي الأجسام المضادة ضد عضو معين من عائلة البروتينات المحفوظة للغاية عن طريق تحصين بمناطقها الأكثر تباينا متبوعا بإزالة الأجسام المضادة التفاعلية المتقاطعة عن طريق الامتزاز المسبق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنتاج Nurr-1 بولكلونل محددة الأجسام المضادة الحرة عبر التفاعل مقابل نظرائه Homologs إغلاق Nor1 وNur77
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
< p class = 'jove_content'>تتكون الفصيلة الفرعية للمستقبلات النووية 4 (NR4A) من 3 بروتينات ذات صلة تشترك في مجال ربط الحمض النووي (DBD) ومجال ربط الترابط (LBD). يلعب البروتين 1 المرتبط بالمستقبلات النووية (Nurr1 أو NR4A2) دورا رئيسيا في الحفاظ على نظام الدوبامين. تشمل اختلالات الدوبامين المرتبطة بجين Nurr1 مرض باركنسون والفصام والاكتئاب الهوسي وغيرها. علاوة على ذلك ، تشير الأدلة الحديثة إلى أن Nurr1 يتم التعبير عنه أيضا في مناطق الدماغ الأخرى مثل الحصين ويلعب أدوارا حاسمة في التعلم والذاكرة. الأعضاء الآخرون في الأسرة هم عامل نمو الأعصاب IB (Nur77 أو NR4A1) والمستقبلات اليتيمة المشتقة من الخلايا العصبية 1 (NOR1 أو NR4A3). للمساعدة في التحقيق في الأدوار الوظيفية الدقيقة ل Nurr1 في الاختلالات العصبية الدوبامينية وغيرها من الاختلالات العصبية المرتبطة بمنطقة الدماغ ، كانت هناك حاجة إلى الأجسام المضادة الخالية من التفاعلات المتبادلة ضد Nur77 و NOR1. نظرا لأن البروتينات أكثر تباعدا في LBDs منها في مجالات ربط الحمض النووي الخاصة بها ، فإن التحصين باستخدام LBDs المنقى يجب أن ينتج أجساما مضادة خاصة ب Nurr1 مع الحد الأدنى من التفاعلات ضد Nur77 و / أو NOR1. على الرغم من أن الأجسام المضادة ل Nurr1 تم إنشاؤها بنجاح ، إلا أنها أظهرت نشاطا مناعيا كبيرا ضد أفراد الأسرة الآخرين. أنتج كروماتوغرافيا التقارب على البروتين A الثابت متبوعا بالامتصاص المسبق ضد Nur77 و NOR1 LBDs الجمودة أجساما مضادة خاصة ب Nurr1 خالية من التفاعل المتبادل. هنا ، نستهدف بشكل انتقائي الأجسام المضادة ضد عضو معين من عائلة البروتينات المحفوظة للغاية عن طريق تحصين بمناطقها الأكثر تباينا متبوعة بإزالة الأجسام المضادة المتفاعلة عن طريق الامتزاز المسبق. الهدف من البروتوكول هو زيادة خصوصية الأجسام المضادة متعددة النسيلة من خلال الامتزاز المسبق ضد المستضدات المتقاطعة.
المقدمة
عامل النسخ Nurr1 وhomologs لها (Nur77 وNor1) تنتمي إلى فصيلة 4A مستقبلات النووي (NR4A) 1. بل هي أيضا مستقبلات اليتيمة لأنه لم يتم التعرف على بروابط الذاتية حتى الآن. تم استنساخ Nurr1 لأول مرة في عام 1992، وعلى الرغم من أن المعروف أن أعرب في الدماغ 2، تم الكشف عن دورها الأساسي للتنمية وصيانة الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط من الدراسات الماوس خروج المغلوب 3. بالإضافة إلى ذلك، دورها المهم في الحفاظ على الخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط وقد تجلى مؤخرا دراسة خروج المغلوب الشرطية 4. ونتيجة لهذه الدراسات أنيقة تظهر الأدوار Nurr1 الحاسمة لالخلايا العصبية الدوبامين الدماغ ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تكوين جميع الحلول المذكورة أدناه يمكن العثور عليها في جدول المواد / المعدات.
1. البروتين عمود جسم تنقية
- تتوازن بروتين A عمود الدوران وجميع المخازن المطلوبة لدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل البدء في إجراء.
- تمييع الدم المناعي 1: 1 مع بروتين A مفتش الاحتياطي ملزم. (5 مل من الدم ويوصى).
- بلطف استفادة من البروتين وعمود الدوران على رأس مقاعد البدلاء لطرد أي راتنج التي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مقارنة بين البروتين عمود تنقية الأجسام المضادة Nurr1 محددة مع البروتين المنقى أضداد Nurr1 تليها المرور عبر Nur77 الائتلاف الحزبي والأعمدة Nor1 الائتلاف الحزبي هو مبين في الشكل 1. كما يمكن أن يرى، البروتين المنقى A Nurr1 الأجسام المضادة أظهرت ملزم قوية لNurr1 الائتلاف الحزبي. ومع ذلك، فإنه أظهر أيضا كبير ملزمة لNur77 الائتلاف الحزبي وNor1 الائتلاف الحزبي. عندما تم تنقية البروتين المنقى A Nurr1 الأجسام المضادة أيضا ضد Nur77 الائتلاف الحزبي وNor1 الائتلاف الحزبي، وتق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نجاح هذا البروتوكول يعتمد على توافر البروتينات النقية لتوصيف الأجسام المضادة التي أثيرت ضد عضو محدد من عائلة البروتينات المثيرة للاهتمام. ليست هناك حاجة لتنقية الأجسام المضادة باستخدام بروتين A / G حتى ثبت بوضوح أن هناك نشاطية عبر الكبيرة التي ELISA والنشاف الغربي.
كما جاء في النص، فمن المهم تجنب تعليق البروتين (ق) أن تكون مرتبطة العابرة إلى العمود في وجود مخزن مؤقت التي تحتوي على الأمينات مثل تريس أو جليكاين. وع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NS070577 و NS084869).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجال ربط الترابط المنقى من Nurr1 و Nor1 و Nur77 | محلول تخزين العمود | ||
| AminoLink Coupling Resin and Kit | Thermo Scientific | 44890 | |
| بروتين عمود تدور | Thermo Scientific | 89978 | |
| Dulbecco's Dulbecco's Fossil-Bubble-Salt | Corning | 21-031-CV | |
| 96 Well Flate-bottom Plates ، شفة عالية, 330 & ل | Thermo Scientific | 3455 | |
| 10٪ مصل الماعز العادي | KPL | 50-675-69 | |
| حليب مخفف / مركز حجب ؛ | KPL | 50-82-01 | |
| IgG Elution | Buffer Thermo Scientific | 21004 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23235 | |
| فجل الحصان بيروكسيداز الماعز المترافق المضاد للأرانب IgG (H + L) | Thermo Scientific | 31460 | |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| 3 ، 3 '، 5 ' رباعي ميثيل بنزيدين | حراري علمي | 34028 | |
| 2N H2< / sub>SO4< / sub> | ماكرون للكيماويات الدقيقة | H381 05 | |
| بروتين A IgG ملزمة عازلة | حرارية علمية | 21001 | |
| IgG Elution Buffer | Thermo Scientific | 21004 | |
| محلول | مخزن الفوسفات محلول ملحي يحتوي على 0.02٪ أزيد الصوديوم | ||
| Spectra / Por 7 أنابيب غسيل الكلى المعالجة مسبقا | مختبرات الطيف | 132128 | |
| 10 مل أعمدة يمكن التخلص منها | Thermo Scientific | 29924 | |
| AminoLink Coupling Buffer | 0.1M فوسفات الصوديوم ، 0.05٪ NaN3 ، درجة الحموضة 7.0 | ||
| التبريد | 1M Tris. HCI ، 0.05٪ NaN3 ، درجة الحموضة 7.4 | ||
| محلول | 1M كلوريد الصوديوم ، 0.05٪ NaN3 | ||
| ELISA مانع المخزن | المؤقت 1٪ مصل الحصان العادي (NHS) ، 1٪ مصل الماعز العادي (NGS) في محلول تخزين | ||
| 1X KPL PBS درجة الحموضة 7.4 تحتوي على 0.02٪ ماصات دقيقة أزيد الصوديوم | |||
| : 10 & mu ؛ l; 20 & مو l; 200 مو ؛ l; 1000 مو ؛ ل |
المراجع
- Hawk, J. D., Abel, T. The role of NR4A transcription factors in memory formation. Brain Res. Bull. 85 (1-2), 21-29 (2011).
- Law, S. W., Conneely, O. M., DeMayo, F. J., O'Malley, B. W. Identification of a new brain-specific transcription factor, NURR1. Mol. Endocrinol.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
