يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ل

9.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52969

⸱

أكتوبر 6, 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Calgary, 2Toronto General Research Institute, University Health Network

في هذه المقالة

ملخص

يصعب تكرار العدوى البشرية المشتركة في المختبر. ومع ذلك ، يمكن بسهولة استزراع طفيليات الملاريا البشرية في المختبر ، وكذلك خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة المعزولة حديثا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية بشكل طبيعي. يوفر هذا نموذجا ممتازا لدراسة الاستجابات المناعية المبكرة لطففيليات الملاريا في سياق العدوى المشتركة بفيروس العوز المناعي البشري.

الملخص

تعد العدوى المصاحبة للملاريا وفيروس العوز المناعي البشري أولوية صحية متنامية. ومع ذلك، فإن معظم البحوث حول الملاريا أو فيروس العوز المناعي البشري تركز حاليا على كل عدوى على حدة. على الرغم من أن فهم ديناميكيات المرض لكل من هذه مسببات الأمراض بشكل مستقل أمر حيوي ، إلا أنه من المهم أيضا التحقيق في التفاعلات بين هذه مسببات الأمراض وفهمها.

لقد طورنا نموذجا متعدد الاستخدامات في المختبر للعدوى المشتركة لفيروس نقص المناعة البشرية والملاريا لدراسة الاستجابات المناعية للمضيف للملاريا في سياق عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. يسمح نموذجنا بدراسة العوامل المفرزة في المواد الطفية الخلوية ، وسطح الخلية وعلامات البروتين داخل الخلايا ، بالإضافة إلى مستويات تعبير الحمض النووي الريبي. يحد التصميم التجريبي والأساليب المستخدمة من التباين ويعزز موثوقية البيانات وقابليتها للتكرار.

جميع مسببات الأمراض المستخدمة في هذا النموذج هي مسببات الأمراض البشرية الطبيعية (المتصورة المنجلية وفيروس نقص المناعة البشرية -1) ، وجميع الخلايا المصابة مصابة بشكل طبيعي وتستخدم طازجة. نستخدم كريات الدم الحمراء البشرية المتطفلة مع المتصورة المنجلية ويتم الحفاظ عليها في الثقافة المستمرة في المختبر. نحصل على خلايا أحادية النواة أحادية الدم المحيطية المعزولة حديثا من متطوعين مصابين بفيروس نقص المناعة البشرية بشكل مزمن. كل حالة مستخدمة لها تحكم مناسب (المتصورة المنجلية المتطفلة مقابل كريات الدم الحمراء الطبيعية) ، وكل متبرع مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية لديه عنصر تحكم غير مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية ، يتم حصاد الخلايا منه في نفس اليوم. يوفر هذا النموذج بيئة واقعية لدراسة التفاعلات بين طفيليات الملاريا والخلايا المناعية البشرية في سياق عدوى فيروس نقص المناعة البشرية.

المقدمة

شارك العدوى، عدوى الالتهابات المتزامنة متعددة، هو القاعدة في البيئات الطبيعية. شارك في العدوى يمكن أن يكون لها تأثير كبير على علم الأمراض، وعلى التدبير العلاجي السريري لكل العدوى. في سياق التعاون العدوى، لقاح ونجاعة الأدوية، وكذلك الاختبارات التشخيصية، ويمكن أن يتأثر سلبا (إعادة النظر في 1). ومع ذلك، على الرغم من أهميته، فإن غالبية الأبحاث الممرض تعتبر التهابات واحدة فقط.

الملاريا وHIV-1 (HIV) هي الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات على مستوى العالم. مناطق توطن الملاريا وفيروس نقص المناعة البشرية تشترك في تداخل جغرافي واسع، ووضع الملايين من الأشخاص المعرضين لخطر الاصابات المشتركة، وبالتالي لخطر المرض السريري أكثر شدة 2-10. هذين المرضين تتفاعل سلبا. في الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، وارتفاع الأحمال الفيروسية فيروس نقص المناعة البشرية والانخفاضات المؤقتة في CD4 + T التهم الخلايا يمكن أن ينظر إليها خلال عدوى الملاريا، في حينالملاريا طفيلي أعباء ومخاطر الملاريا السريرية وشديد أعلى في المصابين شارك أفراد 2،3،5،7،8،10. الآليات التي يزيد فيروس نقص المناعة البشرية شدة الملاريا ليست مفهومة تماما وتبرر اجراء مزيد من التحقيقات.

نحن هنا وصف الطريقة التي الملاريا وشارك في الإصابة بفيروس نقص المناعة يمكن دراستها في المختبر وعلى وجه التحديد، ويسمح هذا الأسلوب لفحص ردود الملاريا محددة المناعية في سياق الإصابة بالفيروس. يصف بروتوكول لدينا نظام متعدد الاستعمالات شارك في الثقافة باستخدام خلايا الدم وحيدات النوى الطرفية المعزولة حديثا (PBMCs) معزولة عن مزمنة بفيروس نقص المناعة البشرية المانحين المصابة في المختبر مثقف P. مطفول المنجلية كريات الدم الحمراء (PfRBC). ويمكن أيضا أن تدرس تأثير العلاج المضاد للفيروس نقص المناعة البشرية على هذه الردود باستخدام PBMCs جمعت بأثر رجعي من فيروس نقص المناعة البشرية (+) الجهات المانحة قبل وبعد العلاج.

وقد استخدمنا هذا النظام للتحقيق في تأثير فيروس نقص المناعة البشريةعلى الاستجابات المناعية الفطرية الملاريا محددة 11،12، وتمكنوا من تحديد أن IFNγ وTNF الردود الملاريا محددة يعانون من ضعف في الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا NKT، γδ الخلايا التائية من فيروس نقص المناعة البشرية (+) الجهات المانحة قبل وبعد العلاج المضاد للفيروس نقص المناعة البشرية . بالإضافة إلى ذلك، كنا قادرين على استخدام هذا النظام لتحديد أن ظائف الوحيدات يتم تخفيض قيمة أيضا في فيروس نقص المناعة البشرية (+) الجهات المانحة، ولكن التعافي بعد فيروس نقص المناعة البشرية العلاج المضاد للفيروسات الرجعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

هذا البروتوكول يتطلب تجنيد مانحين للمصل وRBC لاستخدامها للثقافة الطفيلي، وفيروس نقص المناعة البشرية (+) وغير المصابة المانحين لPBMC العزلة. يجب مجالس المراجعة المؤسسية الموافقة على جميع الدراسات ويجب على جميع الجهات المانحة تقديم الموافقة المسبقة عن علم لسحب الدم.

تنبيه: العمل مع عينات دم الإنسان وطفيليات الملاريا البشرية يتطلب اتخاذ تدابير وقائية. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات، والعمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية المستوى 2. في حال التعرض العرضي عن طريق الجلد للإصابة بالملاريا الإنسان، تقريرا إلى الصحة والسلامة للعلاج وقائي. وينبغي أيضا وضع الاعتبار سلامة إضافية في المكان للعمل مع فيروس نقص المناعة البشرية (+) في الدم. ارتداء معطف المختبر إغلاق مرة أخرى. قفاز مزدوج (يجب اللاتكس كبار القفازات). أداء جميع في التعامل مع السلامة الأحيائية مجلس الوزراء المستوى 2. لا تستخدم أي الزجاج أو الأشياء الحادة. لا تستخدم الشافطة. وضع جميع المواد الملوثة في حل virox أو التبييض لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل رميه.غسل جميع الأسطح مع virox والأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 ساعة بعد الاستخدام. لاحظ أن كل مؤسسة سيكون لوائح السلامة الأحيائية الخاصة المحددة التي ينبغي اتباعها. التبليغ عن التعرض العرضي للدم بفيروس نقص المناعة البشرية في الصحة والسلامة للتقييم والنظر في إمكانية العلاج الوقائي بعد التعرض.

ملاحظة: سلالات مختلفة من P. وجود طفيليات الملاريا المنجلية. وقد استخدم ITG لهذه التجارب، ولكن سلالات مختلفة يمكن استخدامها. تتوفر تعليمات ممتازة على تجميد والذوبان المتصورة المنجلية الطفيليات على موقع MR4 13.

1. جعل RPMI-A لمكافحة الملاريا الطفيلي الثقافة

  1. جعل RPMI-0 عن طريق خلط 950 مل من ده 2 O، 1 علبة من مسحوق RPMI-1640، 6 غرام من HEPES، 2 غرام من بيكربونات الصوديوم، و 1.35 ملغ من هيبوزانتين.
  2. حرارة ذوبان المعطل المصل البشري من اثنين من مختلف الجهات المانحة. وأفضل ولكن يمكن استخدام أي المانحين AB إذا تزرع الطفيليات في O نوعخلايا الدم الحمراء (RBC). عكس أنابيب لخلط. إذا مصل يحتوي على جسيمات أو غير سميكة تدور في 2000 دورة في الدقيقة وثم تصفية الجزء السائل باستخدام وحدة 0.45 ميكرون التصفية.
  3. باستخدام وحدة مرشح 0.2 ميكرون تصفية 180 مل من RPMI-0، 20 مل من الدم البشري (10 مل من كل جهة مانحة)، و 0.5 مل من 10 ملغ / مل الجنتاميسين.
    ملاحظة: المصل البشري قد يعوق مرشح لذلك قد تكون هناك حاجة وحدة أكثر من مرشح واحد.
  4. تسمية زجاجة متوسطة مع RPMI-A، وتاريخ، ومصدر من المصل. بردت حتى المطلوبة. RPMI-A قد تتحول غائم عندما المبردة. وهذا أمر طبيعي، ولكن زيادة الغيوم هو علامة من التلوث.
    ملاحظة: قد تختلف نمو الطفيليات في الدم المانحة مختلفة. انها فكرة جيدة لاختبار كل دفعات المصل الإنسان للنمو الطفيل جيدا قبل استخدام.

2. إعداد خلايا الدم الحمراء البشرية للثقافة الطفيلي

وينبغي أن يكون المتبرعين بالدم نوع O.: مذكرة

  1. جمع 7-10 مل من الدم إلى حمض الاتصالات وتكنولوجيا المعلومات(ACD) أنابيب معدل سكر العنب. إرسال ID المتبرع وتاريخ جمع على الملصق.
  2. مخزن الدم عند 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. استخدام الدم للثقافات الطفيلي في حدود 1 في الشهر.
  3. يمسح الجزء العلوي من أنبوب مع الايثانول 70٪. إزالة بعناية سدادة وتجاهل. نقل الدم في أنبوب 15 مل. تدور لمدة 3 دقائق في 1000 ز س. إزالة البلازما بواسطة الطموح.
  4. تعليق RBC مع حجم مساو باب الحارة RPMI-0. تدور لمدة 5 دقائق في 1000 ز س. إزالة الغلالة الشهباء بواسطة الشفط، resuspend في 5 مل من RPMI-0 وتكرار غسل 2 مرات أكثر.
  5. إزالة طاف وإضافة ما يكفي من RPMI-A لإنتاج مزيج أن 50٪ RBC من حيث الحجم.
  6. تخزين عند 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.

3. الحفاظ على الثقافات الطفيلي

  1. قبل الدافئة RPMI-A إلى 37 درجة مئوية.
  2. وضع الطفيليات إذابة (انظر بروتوكول MR4 لإجراء ذوبان) في قارورة T25 مع 5 مل من RPMI-A و 75 ميكرولتر من غسلها RBC البشري لالهيماتوكريت ~ 3٪.ملاحظة: الهيماتوكريت يقيس حجم RBC بالمقارنة مع الحجم الكلي. لحساب الهيماتوكريت قياس حجم معبأة RBC إلى إجمالي حجم المتوسطة بالإضافة إلى RBC. نفترض أن الطفيليات إذابة سيسهم 75 ميكرولتر من RBC. وذلك بإضافة 150 ميكرولتر من الأسهم RBC (وهو ما يعادل إضافة 75 ميكرولتر من معبأة RBC) إلى قارورة هناك ما مجموعه 150 ميكرولتر من RBC إلى 5 مل من المتوسط، أي ما يعادل لالهيماتوكريت من 3٪ (150 ميكرولتر / 5000 ميكرولتر × 100٪ = 3٪).
  3. الغاز في قارورة لمدة 30 ثانية مع خليط الغاز الطفيلي (1٪ O 2، 3٪ CO 2، والتوازن N 2). ختم ووضع الجانب قارورة واسعة أسفل في C حاضنة 37 درجة للسماح لأكبر مساحة لتبادل الغازات.
  4. لتغيير المتوسطة والتحقق من وجود الطفيل (يجب القيام به يوميا)، نقل بعناية القارورة حتى لا تعكر صفو طبقة RBC. باستخدام العقيمة موصول ماصة باستير رسم قبالة مستنبت من دون إزعاج طبقة الدم.
  5. للتحقق سنوياrasitemia، وإزالة عينة 10 ميكرولتر من طبقة الدم، وضعه على شريحة زجاجية واستخدام شريحة زجاجية الثانية إنشاء فيلم دم رقيقة. السماح الشريحة لتجف.
  6. ضع 4 مل من جديد RPMI-A في قارورة، بلطف مزيج والغاز لمدة 30 ثانية، ووضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  7. وصمة عار على الشرائح باستخدام عدة تلطيخ Hema3 وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
    1. لتلطيخ الأمثل، وتراجع الشرائح في حل تحديد لمدة 10 ثانية، والحل الأول لمدة 10 ثانية، والحل الثاني لمدة 30 ثانية. شطف في الماء ويترك الشرائح لتجف.
  8. حساب الطفيل عن طريق حساب عدد من PfRBC (الملون الأرجواني الداكن) مقابل العدد الإجمالي للRBC (الوردي الملون). عد ما مجموعه 300 خلية لضمان الدقة.
  9. عندما وصلت الطفيليات على الطفيل من 5٪، وتوسيع الثقافة في قارورة T75، وذلك باستخدام 40 مل من RPMI-A، و 500 ميكرولتر من RBC.

4. الطفيلي التزامن

ملاحظة: قبل يوم واحد طنانه تجربة، وتزامن ثقافة الطفيلي عن طريق التعامل مع ألانين. والطفيليات مرحلة الحلقة الوحيدة وغير مصاب RBC البقاء على قيد الحياة هذا العلاج. وتزامن ألانين تعطيك الثقافة أتروفة نقية في اليوم التالي والتي يمكن استخدامها في التجارب الثقافة المشتركة. تأكد من أن تبدأ مع ثقافة الطفيلي الذي يحتوي على معظم الطفيليات مرحلة الحلقة.

  1. يعد حل ألانين عن طريق خلط 8.01 غرام من ألانين (300 ملم) و0.365 غرام من تريس (10 ملم) في 300 مل من ده 2 O. جلب الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. فلتر تعقيم باستخدام وحدة 0.2 ميكرون فلتر.
  2. حل ألانين قبل الدافئة إلى 37 درجة مئوية.
  3. تدور باستمرار ثقافة الطفيلي (5 دقائق س 1000 x ج)، وإزالة المتوسطة.
  4. بيليه resuspend في 19 مجلدا من حل ألانين (1 مل معبأة RBC إلى 19 مل من محلول ألانين). احتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
  5. تدور 5 دقائق س 1000 ز س. نضح طاف. يغسل في RPMI-0 مرة واحدة. نضح وطاف resuspend في RPMI-A وضبط الهيماتوكريت إلى ~ 3٪. Gكما القارورة والعودة إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: للحصول على التجارب ثقافة مشتركة مطلوب حد أدنى من الطفيل من 5٪ النواشط، مع تعتبر الأمثل 10٪ الطفيل.

5. الطفيلي وإعداد RBC للتجارب المشارك الثقافة

  1. استخدام نسبة 3 PfRBC في PBMC في التجارب ثقافة مشتركة للحث على استجابة التهابية. لحساب مجموع PfRBC، تحديد الطفيل عن طريق إجراء مسحة الدم رقيقة كما هو موضح في 3.5، والهيماتوكريت عن طريق حساب عدد من RBC لكل مليلتر من ثقافة الطفيلي باستخدام عدادة الكريات.
    عدد PfRBC =٪ الطفيل X المجموع RBC / مل س مل من الثقافة. على سبيل المثال: 10 مل من ثقافة في 10 × 10 6 RBC / مل و 10٪ الطفيل يساوي 0.1 × 10 6 / مل × 10 مل = 10 × 10 6 PfRBC.
  2. تدور ثقافة الطفيلي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج (RT). نضح المتوسطة، و resuspend في 6 × 10 6 PfRBC لكل مل في RPMI-S + (500 مل RPMI-1640 تستكمل مع الجلوتامين L-وHEPES، و 10٪ الحرارةالمعطل FBS، 1.5 مل جنتاميسين، 5 مل من 100 ملي البيروفات الصوديوم، 5 مل من 10 ملي MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، 5 مل من 5MM β المركابتويثانول).
  3. السيطرة الدم (غير مصاب RBC من نفس المانحة تستخدم للحفاظ على الثقافة الطفيلي)، وحساب الهيماتوكريت وresuspend في RPMI-S + في نفس العدد من RBC لكل مل باسم الثقافة الطفيلي.

6. عزل الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى (PBMC)

  1. جمع الدم الوريدي في أنابيب هيبارين الصوديوم (أعلى الأخضر) من كل من المزمن فيروس نقص المناعة البشرية (+) المانحة وفيروس نقص المناعة البشرية (-) السيطرة. لا تستخدم EDTA بوصفها مضادة للتخثر كما عمل خالب الكالسيوم EDTA ويؤثر على وظيفة الخلية. وفي المتوسط ​​توقع بين 5-10 × 10 6 PBMC لكل 10 مل من الدم. لتجربة نموذجية جمع 30 مل من الدم من كل جهة مانحة. ستحتاج حجم الدم ليتم تعديلها وفقا لمتطلبات التجريبية.
  2. في أسرع وقت ممكن، وبالتأكيد في غضون ساعة من الدم التي يتم جمعها،إزالة الدم من الأنابيب والمكان إلى البلاستيك أنبوب 50 مل. سيتم تفعيل حيدات بشكل خاص وعصا على الزجاج، لذلك من المهم أن تتم إزالة الخلايا إذا تم استخدام أنابيب جمع الدم الزجاج في أسرع وقت ممكن.
  3. تدور الدم في 1000 x ج لمدة 15 دقيقة، وجمع البلازما (وهذا يمكن أن تستخدم لدراسات أخرى إذا لزم الأمر - إن لم يكن هذه الخطوة يمكن تخطي). تمييع الدم في حجم مساو من DPBS البارد.
  4. وضع 15 مل من RT Ficoll في أنبوب 50 مل. ببطء، وذلك باستخدام معقم نقل البلاستيك ماصة، طبقة / DPBS حل الدم خلال Ficoll دون أي خلط. بحد أقصى 25 مل من الدم / DPBS حل يمكن الطبقات فوق بعضها 15 مل من Ficoll.
  5. تدور تدرجات لمدة 30 دقيقة في RT في 600 ز س. تأكد من الإعداد "لا الفرامل" على.
  6. مرة واحدة وقد نسج الخلايا، ابحث عن واجهة بين المرحلتين. هذا هو المكان الذي PBMC هي. باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة نقل جمع PBMC من واجهة (انظرالشكل 1). تقليل التلوث RBC.
  7. وضع الخلايا التي تم جمعها في 50 مل أنابيب، مع ما لا يزيد عن 20 مل لكل أنبوب. أعلى أنبوب يصل إلى 50 مل مع DPBS الباردة العقيمة.
  8. تدور الخلايا لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية في 300 ز س.
  9. تجاهل طاف، بيليه resuspend في 5 مل DPBS الباردة العقيمة وتجميع جميع الخلايا من نفس الجهات المانحة في أنبوب واحد. أعلى تصل إلى 50 مل مع DPBS العقيمة، وتكرار غسل الخطوات من 2 مرات أكثر.
  10. خلايا resuspend في 10 مل RPMI-S + المتوسطة.
  11. إزالة قسامة 20 ميكرولتر وتخلط مع 20 ميكرولتر من التريبان الأزرق. ماصة 10 ميكرولتر في haemocytometer والاعتماد على الخلايا الحية (الخلايا التي لم تتخذ حتى صبغة زرقاء - جميع الخلايا الزرقاء هي ميتة). استخدام haemocytometer لحساب عدد الخلايا في حل النحو التالي.
    ملاحظة: haemocytometer لديه شبكة من أبعاد محددة بحيث يعرف المنطقة التي تغطيها خطوط.
    1. تأكد من أن haemocytometer نظيف. وضع ساترة على countiمنطقة نانوغرام. تحميل 10 ميكرولتر من حل الخلية عن طريق وضع طرف ماصة في واحدة من الآبار على شكل حرف V. والمنطقة تحت ساترة ملء بفعل الخاصية الشعرية.
    2. وضع haemocytometer تحميل تحت المجهر. الشبكة الكاملة للhaemocytometer يحتوي على 9 مربعات من 1 مم 2 لكل منهما. عد كل الخلايا داخل كل مربع كبير. إذا العديد من الخلايا موجودة، وتمييع الحل أبعد من ذلك وإعادة فرز الأصوات.
    3. حساب تركيز الخلية على النحو التالي: مجموع خلية / مل = (مجموع الخلايا عدها / عدد المربعات) س التخفيف عامل X 10000 خلية / مل، على سبيل المثال، (500 خلية / 5 مربعات) س عامل التخفيف من 20 × 10000 خلية / مل = 20 مجموع × 10 6 خلايا.
  12. ضبط المتوسطة إلى تركيز النهائي من 10 × 10 6 لكل مل (RPMI-S + متوسطة).

7. الملاريا / المشارك عدوى فيروس نقص المناعة البشرية الثقافة

  1. لوحة 100 ميكرولتر من PBMCs معزولة و 400 ميكرولتر من RPMI-S + المتوسط ​​إلى 24 لوحة جيدا (1 × 10 6 PBMC لكل بئر). ضمانالتي تم تعيينها الآبار يصل في ثلاث نسخ: 3 آبار لغير مصاب RBC، 3 آبار مع PfRBC، 3 آبار مع متوسطة، و 3 آبار مع سلطة النقد الفلسطينية / Ionomycin. هذا هو على حد سواء لفيروس نقص المناعة البشرية (+) وفيروس نقص المناعة البشرية (-) عينة.
  2. لPfRBC الآبار، ضع 3 × 10 6 PfRBC في كل من الآبار (500 ميكرولتر من ثقافة الطفيلي أعد في 5.2).
  3. لغير مصاب RBC الآبار ووضع 500 ميكرولتر من ثقافة RBC غير المصابة أعد في 5.3 في كل من الآبار.
  4. للآبار متوسطة، وضع 500 ميكرولتر من RPMI-S + المتوسطة في كل من الآبار.
  5. لسلطة النقد الفلسطينية / Ionomycin الآبار، وإعداد سلطة النقد الفلسطينية / Ionomycin حل (2.5 غ / مل، 250 غ / مل على التوالي). وضع 500 ميكرولتر من هذا الحل في كل بئر.
    ملاحظة: كما التحفيز والتشجيع قوية من إفراز السيتوكينات الخلايا التائية، وتستخدم سلطة النقد الفلسطينية وIonomycin كعنصر تحكم إيجابية لضمان خلايا وظيفية.
  6. مكان لوحة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
  7. اختياري: استخدام الخلايا الزائدة للتحليل المظهري باستخدام التدفق الخلوي أو مخزن في RNوالحل لتحقيق الاستقرار في المستقبل لتحليل التعبير مرنا.

8. الكشف عن الردود الملاريا المناعي

ملاحظة: إجراء التجارب ثقافة مشتركة لطالما 4 أيام. مطلوب أي تغيير المتوسط ​​خلال هذه الفترة. فإن نقطة زمنية المثلى تعتمد على نوع من الخلايا في المصالح والسؤال المطروح. والحضانة من 12-48 ساعة هو الأمثل للاستجابات الوحيدات لPfRBCs، في حين أن الردود اللمفاويات وأفضل لوحظ في 72-96 ساعة. سوف تحتاج النقاط الوقت ليكون الأمثل على أساس تجريبي السؤال. فترات أقصر (2-4 ساعة) يمكن أن تستخدم إذا تفاعل بين سليمة PfRBC وPBMCs هو من مصلحة.

  1. لوحة تدور في 300 x ج لمدة 3 دقائق لخلايا بيليه. جمع 700 ميكرولتر من ثقافة طاف من كل بئر.
  2. تدور طاف في 1000 x ج لمدة 5 دقائق لواضح من أي حطام.
  3. قسامة مسح طاف حسب الحاجة، والتسمية، وتجميد بأسعار أقل من -20 ° C إلى تحليل العوامل يفرز هو أن تكون PERFOrmed.
  4. تحليل الاستجابات خلوى / chemokine بواسطة ELISA أو عن طريق مجموعة حبة (اتبع بروتوكولات اقترحت الشركة المصنعة).
  5. جمع الخلايا المتبقية في لوحة في حل RNA الاستقرار والاستفادة لتحليل مرنا التعبير الكمي في الوقت الحقيقي PCR 14-16.

9. بين الخلايا التدفق الخلوي للردود Ccytokine خلية محددة عن طريق شركة PBMC مثقف مع P. المنجلية المصابة RBC

ملاحظة: كما ذكر أعلاه طول شارك في الثقافة سيعتمد على نوع من الخلايا في المصالح. اذا كانت مهتمة في ردود الوحيدات لPfRBC فترة الحضانة أقصر هو مطلوب. ومرة تكون أطول بالنسبة للاستجابات الخلايا اللمفاوية الفطرية γδ خلايا T، خلايا NK، وخلايا NKT)، وتعد يزال لخلايا CD4 و CD8 T. سوف تكون هناك حاجة الأمثل.

  1. 8/6 ساعة قبل التحليل إضافة 1 ميكرولتر من 1،000x brefeldin A لجميع الآبار. العودة لوحة إلى 37 درجة مئوية الحاضنة. بعد 6-8 ساعة incubأوجه، لوحة مكان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  2. إزالة الخلايا من الآبار باستخدام pipetting لقوي ووضعها في أنابيب microcentifuge المسمى. قد تكون هناك حاجة كشط لإزالة حيدات.
  3. خلايا تدور لمدة 5 دقائق في 1000 ز س. إزالة supernatants. Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر التدفق الخلوي العازلة (1X DPBS، 2٪ الحرارة المعطل FBS، 0.02٪ أزيد الصوديوم).
  4. انقسام الخلايا حتى أن كل عينة لديه: أنبوب واحد لتلوين الأجسام المضادة الكامل (240 ميكرولتر)، وأنبوب واحد لتلطيخ ناقص فلوري واحد (FMO) مراقبة الأجسام المضادة (240 ميكرولتر). تجميع كمية صغيرة من كل عينة (20 ميكرولتر) لتدفق غير ملوثين الخلوي السيطرة (هذا سيتم استخدامها في إنشاء قياس التدفق الخلوي).
  5. خلايا تدور لمدة 5 دقائق في 500 ز س. إزالة supernatants.
  6. احتضان الخلايا مع اللامقترن CD16 مكافحة الإنسان / CD32 (5 ميكروغرام / مل) في 50 ميكرولتر التدفق الخلوي العازلة لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لمنع مستقبلات لكرة القدم.
  7. إضافة 1 مل من التدفق الخلوي العازلة لكل أنبوب. تدور مLLS لمدة 5 دقائق في 500 ز س. إزالة supernatants.
  8. خلايا Resuspend في 50 ميكرولتر من تدفق العازلة الخلوي مع تركيز معاير مسبقا من الأجسام المضادة fluorophore مترافق لعلامات سطح الخلية المطلوبة. قبل المزيج حل ما يكفي من الأجسام المضادة لجميع العينات لتكون ملطخة. احتضان خلايا في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. حماية من light.Note: ستصل كل الأجسام المضادة يجب أن يكون الأمثل. نحن وصمة عار بشكل روتيني لCD56، CD3، γδ، CD4، CD8، CD14. وتظهر كميات معاير لهذه الأجسام المضادة في الجدول 1.
  9. إضافة 1 مل من التدفق الخلوي العازلة لكل أنبوب. خلايا تدور لمدة 5 دقائق في 500 ز س. إزالة supernatants.
  10. إضافة 100 ميكرولتر من محلول cytofix / cytoperm إلى كل أنبوب. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. يحفظ بعيدا عن الضوء.
  11. إضافة 1 مل من العازلة بيرم / غسل (على النحو المنصوص عليه 10X التركيز - تمييع ل1x أخرى باستخدام ده 2 O) إلى كل أنبوب. خلايا تدور لمدة 5 دقائق في 500 ز س. إزالة supernatants.
  12. إضافة 100 μلتر من بيرم / غسل العازلة للسيطرة FMO أنابيب تلوين الأجسام المضادة وتخلط ل resuspend الخلايا.
  13. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة بيرم / غسيل مع تركيز معاير مسبقا من الأجسام المضادة fluorophore مترافق إلى علامات داخل الخلايا المطلوبة (أي السيتوكينات / كيموكينات) إلى ملء أنابيب تلوين الأجسام المضادة.
    ملاحظة: سوف قيمة كل الأجسام المضادة يجب أن يكون الأمثل. نحن وصمة عار بشكل روتيني مع مكافحة TNF والأجسام المضادة لمكافحة IFNγ. وتظهر كميات معاير لهذه الأجسام المضادة في الجدول 1.
  14. احتضان جميع الأنابيب لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. يحفظ بعيدا عن الضوء.
  15. إضافة 1 مل من بيرم / غسيل العازلة لكل أنبوب. خلايا تدور لمدة 5 دقائق في 500 ز س. إزالة supernatants.
  16. Resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر التدفق الخلوي العازلة مع 1٪ امتصاص العرق. ترك الجلوس لمدة لا تقل عن 15 دقيقة لتحييد فيروس نقص المناعة البشرية.
  17. تحضير عينات ملطخة الأجسام المضادة واحد باستخدام الخرز التعويض، لاستخدامها للحصول على تعويض وضعت على قياس التدفق الخلوي. نوع من التعويضوالخرز تعتمد على الأجسام المضادة المستخدمة (أي، ومكافحة فأر الإيج، ومكافحة فأر / الهامستر IG). الخرز دوامة. إضافة قطرة واحدة من الخرز في الأضداد. إضافة كميات متساوية من الأجسام المضادة المستخدمة لتلطيخ. إضافة 200 ميكرولتر من التدفق الخلوي العازلة. هذه هي الآن جاهزة للاستخدام. ليست هناك حاجة لغسل الخرز.
  18. الحصول على العينات على تدفق عداد الكريات في أقرب وقت ممكن وخلال 24 ساعة حصول على أفضل النتائج. الأصباغ جنبا إلى جنب عرضة للتفكك مع التخزين ولذا فإننا نوصي الاستحواذ على الفور إذا كان ذلك ممكنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الرسوم البيانية تصور مستويات الإنتاج IFNγ من خلايا NKT (الشكل 2)، وذلك باستخدام CD56 + CD3 + γδ- بوابات للحصول على السكان الخلايا NKT (لا تظهر البيانات). كان المثقف الخلايا لمدة 72 ساعة قبل التلوين. مرة واحدة الملون، تم الحصول على 100،000 CD3 + الخلايا على قياس التدفق الخلوي للحصول على عدد كبير من السكان ما يكفي من NK، NKT وخلايا γδ (خلايا الفائدة). يتم عرض ما لا يقل عن 5600 الخلايا NKT على كل رسم بياني. يتم الحصول على إنتاج TNF بنفس الطريقة (لا تظهر البيانات). تظ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد تم تحسين بروتوكول لدينا من أجل دراسة أكثر واقعية المشارك العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية الملاريا في المختبر. أولا، يتعين على كرات الدم الحمراء البشرية الطازجة ومصل للثقافة طفيلي الملاريا. وهذا أمر حيوي للحصول على صحة السكان من طفيليات الملاريا. لست] الطفيليات لا يمكن أن تكون بديلا للطفيليات حية كما إنتاج السيتوكينات هو أسرع بكثير ومكثفة عند استخدام يعيش P. المنجلية المصابة RBC (PfRBC) 17،18. وبالإضافة إلى ذلك، وتفعيل أنواع الخلايا مثل الخلايا ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

< p class = 'jove_content'> C.A.M.F. و L.S. شاركت في تصميم البروتوكول ، والحصول على البيانات وتحليلها ، وصياغة المقالة.

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور كين والدكتور لوتفي والدكتور واسموث والدكتور آي على مساهماتهم.

C.F. تم دعمه من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من CTN / شبكة علاج فيروس نقص المناعة البشرية في أونتاريو (OHTN). LS مدعومة بجائزة تطوير الباحثين المبتدئين OHTN. تم دعم العمل الحالي من خلال منحة تشغيل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) (MOP-13721 و 115160) ، ومنحة CIHR New Investigator Catalyst.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المضادة للألانينسيجماA7377
(انظر الجدول الآخر)
BD Cytofix / Cytoperm مع BD GolgiPlugBD555028 يشمل brefeldin A و cytofix / cytoperm buffer و perm / wash buffer
BD Vacutainer ACD Solution ABD364506
BD Vacutainer Sodium HeparinBD 17-1440-02
DPBS (خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم)Corning21-031-CV
مصل الأبقار الجنينيSigmaF1051يعطل الحرارة قبل الاستخدام
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
gentamycin (10 مجم / مل)Gibco15710-064
Hema3Staining Set Fisher122-911
HEPESFisherBP310-500
هيبوكسانثينسيجماH9636
IonomycinSigmaI3909
MEM أحماض أمينية غير أساسية (10 ملم)مسحوقGibco11140
PMASigmaP8139
RPMI-1640Life-Technologies31800-022
RPMI-1640 مع L-glutamine و HEPESThermo SH30255.01
علمي بيكربونات الصوديوم (مسحوق ، مزرعة خلايا)سيجماS5761
بيروفات الصوديوم (100 ملم)جيبكو11360
تريس (قاعدة تريزما)سيجماT6066
تريزولأمبيون15596018
تريبان بلو (0.4٪)جيبكو15250-061
BD CompBeadBD552843 ، يعتمد 552845على الأجسام المضادة المستخدمة
خليط غاز الطفيلياتبأمر3٪ CO2< / sub> ، 1٪ O2< / sub> ، التوازن N2< / sub>
Equipment< / strong>
0.2 &# 956; وحدة
الشرائح الزجاجية
قوارير
T25 قوارير
أنابيب 50 مل 24
لوحة
غير موصولة ماصات
موصولة ماصاتباستور
ماصات نقل معقمة مقياس
لمقياس
الدم (3 ليزر)
<قوي > الأجسام المضادة المستخدمة في قياس التدفق الخلوي < / قوي >
مضاد لعامل نخرالورم eBiosciences551487FITC (الفلوروفور) 2 μ ل
مكافحة IFN&# 947;Biolegend506507PE (فلوروفور) 20 μ ل
Anti-CD8Biolegend300914PE-Cy7 (الفلوروفور) 1 &# 956; ل
Anti-CD14Biolegend ؛ BD Biosciences325624 ؛ 551487البيوتين (الفلوروفور) 0.5 &# 956; l ستريبتافين PE-TR (فلوروفور) 0.1 μ ل
Anti-CD56Biolegend318322PerCP / Cy5.5 (الفلوروفور) 5 μ ل
مضاد &# 947 ؛ δBiolegend331212APC (فلوروفور) 5 μ ل
Anti-CD3Biolegend300426APC-Cy7 (الفلوروفور) 5 μ ل
Anti-CD4Biolegend317424Pacific Blue (فلوروفور) 1 &# 956; ل
الأجسام خاص الترشيح mT75ثقافة بئرباستور التدفق الخلوي

المراجع

  1. Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
  2. French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
  3. Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
  4. Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
  5. Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
  6. Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
  7. Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
  8. Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
  9. Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
  10. Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
  11. Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
  12. Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
  13. Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
  14. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  15. Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
  18. Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
  19. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
  20. Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102(2012).
  21. Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
  22. Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
  23. Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
  24. Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
  25. Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
  26. Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
  27. Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.