يصعب تكرار العدوى البشرية المشتركة في المختبر. ومع ذلك ، يمكن بسهولة استزراع طفيليات الملاريا البشرية في المختبر ، وكذلك خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة المعزولة حديثا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية بشكل طبيعي. يوفر هذا نموذجا ممتازا لدراسة الاستجابات المناعية المبكرة لطففيليات الملاريا في سياق العدوى المشتركة بفيروس العوز المناعي البشري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد العدوى المصاحبة للملاريا وفيروس العوز المناعي البشري أولوية صحية متنامية. ومع ذلك، فإن معظم البحوث حول الملاريا أو فيروس العوز المناعي البشري تركز حاليا على كل عدوى على حدة. على الرغم من أن فهم ديناميكيات المرض لكل من هذه مسببات الأمراض بشكل مستقل أمر حيوي ، إلا أنه من المهم أيضا التحقيق في التفاعلات بين هذه مسببات الأمراض وفهمها.
لقد طورنا نموذجا متعدد الاستخدامات في المختبر للعدوى المشتركة لفيروس نقص المناعة البشرية والملاريا لدراسة الاستجابات المناعية للمضيف للملاريا في سياق عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. يسمح نموذجنا بدراسة العوامل المفرزة في المواد الطفية الخلوية ، وسطح الخلية وعلامات البروتين داخل الخلايا ، بالإضافة إلى مستويات تعبير الحمض النووي الريبي. يحد التصميم التجريبي والأساليب المستخدمة من التباين ويعزز موثوقية البيانات وقابليتها للتكرار.
جميع مسببات الأمراض المستخدمة في هذا النموذج هي مسببات الأمراض البشرية الطبيعية (المتصورة المنجلية وفيروس نقص المناعة البشرية -1) ، وجميع الخلايا المصابة مصابة بشكل طبيعي وتستخدم طازجة. نستخدم كريات الدم الحمراء البشرية المتطفلة مع المتصورة المنجلية ويتم الحفاظ عليها في الثقافة المستمرة في المختبر. نحصل على خلايا أحادية النواة أحادية الدم المحيطية المعزولة حديثا من متطوعين مصابين بفيروس نقص المناعة البشرية بشكل مزمن. كل حالة مستخدمة لها تحكم مناسب (المتصورة المنجلية المتطفلة مقابل كريات الدم الحمراء الطبيعية) ، وكل متبرع مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية لديه عنصر تحكم غير مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية ، يتم حصاد الخلايا منه في نفس اليوم. يوفر هذا النموذج بيئة واقعية لدراسة التفاعلات بين طفيليات الملاريا والخلايا المناعية البشرية في سياق عدوى فيروس نقص المناعة البشرية.
المقدمة
شارك العدوى، عدوى الالتهابات المتزامنة متعددة، هو القاعدة في البيئات الطبيعية. شارك في العدوى يمكن أن يكون لها تأثير كبير على علم الأمراض، وعلى التدبير العلاجي السريري لكل العدوى. في سياق التعاون العدوى، لقاح ونجاعة الأدوية، وكذلك الاختبارات التشخيصية، ويمكن أن يتأثر سلبا (إعادة النظر في 1). ومع ذلك، على الرغم من أهميته، فإن غالبية الأبحاث الممرض تعتبر التهابات واحدة فقط.
الملاريا وHIV-1 (HIV) هي الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات على مستوى العالم. مناطق توطن الملاريا وفيروس نقص المناعة البشرية تشترك في تداخل جغرافي واسع، ووضع الملايين من الأشخاص الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا البروتوكول يتطلب تجنيد مانحين للمصل وRBC لاستخدامها للثقافة الطفيلي، وفيروس نقص المناعة البشرية (+) وغير المصابة المانحين لPBMC العزلة. يجب مجالس المراجعة المؤسسية الموافقة على جميع الدراسات ويجب على جميع الجهات المانحة تقديم الموافقة المسبقة عن علم لسحب الدم.
تنبيه: العمل مع عينات دم الإنسان وطفيليات الملاريا البشرية يتطلب اتخاذ تدابير وقائية. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات، والعمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية المستوى 2. في حال التعرض العرضي عن طريق الجلد للإصابة بالملاريا الإنسان، تقريرا إلى الصحة والسلامة للعلاج وقائي. وينبغي أيضا وضع الاعتب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الرسوم البيانية تصور مستويات الإنتاج IFNγ من خلايا NKT (الشكل 2)، وذلك باستخدام CD56 + CD3 + γδ- بوابات للحصول على السكان الخلايا NKT (لا تظهر البيانات). كان المثقف الخلايا لمدة 72 ساعة قبل التلوين. مرة واحدة الملون، تم الحصول على 100،000 CD3 + الخلايا على قياس التدفق الخلوي للحصول على عدد كبير من السكان ما يكفي من NK، NKT وخلايا γδ (خلايا الفائدة). يتم عرض ما لا يقل عن 5600 الخلايا NKT على كل رسم بياني. يتم الحصول على إنتاج TNF بنفس الطريقة (لا تظهر البيانات). تظ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد تم تحسين بروتوكول لدينا من أجل دراسة أكثر واقعية المشارك العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية الملاريا في المختبر. أولا، يتعين على كرات الدم الحمراء البشرية الطازجة ومصل للثقافة طفيلي الملاريا. وهذا أمر حيوي للحصول على صحة السكان من طفيليات الملاريا. لست] الطفيليات لا يمكن أن تكون بديلا للطفيليات حية كما إنتاج السيتوكينات هو أسرع بكثير ومكثفة عند استخدام يعيش P. المنجلية المصابة RBC (PfRBC) 17،18. وبالإضافة إلى ذلك، وتفعيل أنواع الخلايا مثل الخلايا ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
< p class = 'jove_content'> C.A.M.F. و L.S. شاركت في تصميم البروتوكول ، والحصول على البيانات وتحليلها ، وصياغة المقالة.
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور كين والدكتور لوتفي والدكتور واسموث والدكتور آي على مساهماتهم.
C.F. تم دعمه من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من CTN / شبكة علاج فيروس نقص المناعة البشرية في أونتاريو (OHTN). LS مدعومة بجائزة تطوير الباحثين المبتدئين OHTN. تم دعم العمل الحالي من خلال منحة تشغيل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) (MOP-13721 و 115160) ، ومنحة CIHR New Investigator Catalyst.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المضادة للألانين | سيجما | A7377 | |
| (انظر الجدول الآخر) | |||
| BD Cytofix / Cytoperm مع BD GolgiPlug | BD | 555028 يشمل brefeldin A و cytofix / cytoperm buffer و perm / wash buffer | |
| BD Vacutainer ACD Solution A | BD | 364506 | |
| BD Vacutainer Sodium Heparin | BD 17-1440-02 | ||
| DPBS (خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم) | Corning | 21-031-CV | |
| مصل الأبقار الجنيني | Sigma | F1051 | يعطل الحرارة قبل الاستخدام |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| gentamycin (10 مجم / مل) | Gibco | 15710-064 | |
| Hema3 | Staining Set Fisher | 122-911 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| هيبوكسانثين | سيجما | H9636 | |
| Ionomycin | Sigma | I3909 | |
| MEM أحماض أمينية غير أساسية (10 ملم)مسحوق | Gibco | 11140 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| RPMI-1640 | Life-Technologies | 31800-022 | |
| RPMI-1640 مع L-glutamine و HEPES | Thermo | SH30255.01 | |
| علمي بيكربونات الصوديوم (مسحوق ، مزرعة خلايا) | سيجما | S5761 | |
| بيروفات الصوديوم (100 ملم) | جيبكو | 11360 | |
| تريس (قاعدة تريزما) | سيجما | T6066 | |
| تريزول | أمبيون | 15596018 | |
| تريبان بلو (0.4٪) | جيبكو | 15250-061 | |
| BD CompBead | BD | 552843 ، يعتمد 552845 | على الأجسام المضادة المستخدمة |
| خليط غاز الطفيليات | بأمر | 3٪ CO2< / sub> ، 1٪ O2< / sub> ، التوازن N2< / sub> | |
| Equipment< / strong> | |||
| 0.2 &# 956; وحدة | |||
| الشرائح الزجاجية | |||
| قوارير | |||
| T25 قوارير | |||
| أنابيب 50 مل 24 | |||
| لوحة | |||
| غير موصولة ماصات | |||
| موصولة ماصات | باستور | ||
| ماصات نقل معقمة مقياس | |||
| لمقياس | |||
| الدم (3 ليزر) | |||
| <قوي > الأجسام المضادة المستخدمة في قياس التدفق الخلوي < / قوي > | |||
| مضاد لعامل نخر | الورم eBiosciences | 551487 | FITC (الفلوروفور) 2 μ ل |
| مكافحة IFN&# 947; | Biolegend | 506507 | PE (فلوروفور) 20 μ ل |
| Anti-CD8 | Biolegend | 300914 | PE-Cy7 (الفلوروفور) 1 &# 956; ل |
| Anti-CD14 | Biolegend ؛ BD Biosciences | 325624 ؛ 551487 | البيوتين (الفلوروفور) 0.5 &# 956; l ستريبتافين PE-TR (فلوروفور) 0.1 μ ل |
| Anti-CD56 | Biolegend | 318322 | PerCP / Cy5.5 (الفلوروفور) 5 μ ل |
| مضاد &# 947 ؛ δ | Biolegend | 331212 | APC (فلوروفور) 5 μ ل |
| Anti-CD3 | Biolegend | 300426 | APC-Cy7 (الفلوروفور) 5 μ ل |
| Anti-CD4 | Biolegend | 317424 | Pacific Blue (فلوروفور) 1 &# 956; ل |
المراجع
- Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
- French, N., et al. I....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
