مقالة منهجية

استنادا الحرير الكولاجين المهندسة 3D نموذج الاستقطاب العصبية الأنسجة

12.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52970

⸱

أكتوبر 23, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Tufts University, 2Department of Pediatrics, University of Connecticut Health Center & Connecticut Children's Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

تتطلب البصيرة في الإجراءات المعقدة للدماغ أدوات بحث متقدمة. نعرض هنا نموذجا هندسيا ثلاثي الأبعاد جديد قائم على الكولاجين الحريري للأنسجة العصبية تشبه الهندسة المعمارية الشبيهة بالدماغ. يمكن استخدام النموذج لدراسة تجميع الشبكة العصبية والتوجيه المحوري والتفاعلات بين الخلية والنشاط الكهربائي.

الملخص

على الرغم من الجهود الهائلة لفك تشفير تشريح الدماغ وتكوينه ووظيفته ، إلا أنه لا يزال العضو الأقل فهما في جسم الإنسان. لاكتساب فهم أعمق للنظام العصبي ، يهدف العلماء إلى إعادة بناء الأنسجة بشكل مبسط عن طريق تجميعها في المختبر من اللبنات الأساسية باستخدام نهج هندسة الأنسجة. طورت مجموعتنا نموذجا ثلاثي الأبعاد يشبه الدماغ من الحرير والكولاجين القائم على الأنسجة يشبه المادة البيضاء والرمادية للقشرة. يتكون النموذج من إسفنجة حريرية مسامية ، وهي مبذرة مسبقا بخلايا عصبية مشتقة من دماغ الفئران ، مغمورة في مصفوفة الكولاجين الناعمة. لوحظ نمو الخلايا العصبية المستقطبة وتكوين الشبكة من خلال توطين منفصل لجسم المحور والخلية. تسمح هذه البنية المجزأة بالتطوير الفريد للمنافذ التي تحاكي الأنسجة العصبية الأصلية ، وبالتالي تمكين البحث عن تجميع الشبكة العصبية ، والتوجيه المحوري ، وتفاعلات الخلية بين الخلية ومصفوفة الخلية والوظائف الكهربائية.

المقدمة

الجهاز العصبي المركزي (CNS) يمكن أن تتأثر مجموعة متنوعة من الاضطرابات التي تنطوي على الأوعية الدموية، الهيكلية والوظيفية، المعدية أو التنكسية. ما يقدر بنحو 6.8 مليون شخص يموتون سنويا نتيجة للاضطرابات العصبية، وهو ما يمثل عبئا الاجتماعي والاقتصادي المتزايد في جميع أنحاء العالم 1. ومع ذلك، سوى عدد قليل من اضطرابات الحصول على العلاجات المتاحة. ولذلك، هناك حاجة ماسة لوضع استراتيجيات علاجية مبتكرة للمرضى الذين يعانون من الاضطرابات العصبية. للأسف، فشلت العديد من العلاجات CNS المستهدفة خلال التجارب السريرية، ويرجع ذلك جزئيا إلى الاستفادة من عدم كفاية نماذج الأبحاث ما قبل السريرية، التي لا تسمح بتقييم الآثار الحادة والمزمنة مع قراءات من الناحية الفسيولوجية الوظيفية ذات الصلة.

على الرغم من الجهود البحثية الهامة على مدى العقود الماضية، هناك كمية هائلة مجهولة حول بنية ووظيفة الجهاز العصبي المركزي. من أجل كسب المزيد من المعرفة، نماذج حيوانية هي في كثير من الأحيان لناإد لنموذج الحالات المرضية، مثل إصابات الدماغ (TBI) أو الخرف، وخاصة في الدراسات ما قبل السريرية. ومع ذلك، الحيوانات تختلف اختلافا كبيرا من البشر على حد سواء في تشريح الجهاز العصبي المركزي، وكذلك في وظيفة، التعبير الجيني والأيض 2-4. من ناحية أخرى، 2D الثقافات في المختبر هي طريقة شائعة للتحقيق في بيولوجيا الخلية وتستخدم بشكل روتيني لاكتشاف الأدوية. ومع ذلك، مزارع الخلايا 2D تفتقر إلى التعقيد والأهمية الفسيولوجية بالمقارنة مع الدماغ البشري 5-7. في حين لا يوجد بديل عن التكلفة المنخفضة وبساطة 2D دراسات ثقافة الخلية أو تعقيد المقدمة من النماذج الحيوانية، يمكن أن هندسة الأنسجة 3D توليد نماذج محسنة البحوث من أجل سد الفجوة القائمة بين 2D في التجارب المختبرية والنهج الجسم الحي. تقدم هندسة الأنسجة 3D الظروف التجريبية أكثر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي كتبها 3D التفاعلات خلية خلية والعظة خارج الخلية التي تقدمها السقالات بيولوجية تحقيقها. Despالفنار الأدلة كبير وراء قيمة الثقافات 3D، وهناك حاليا سوى عدد قليل 3D CNS نماذج الأنسجة مثل الجذعية المشتقة من خلية ثقافات عضوي الشكل 8-10، neurospheroids 11 ومشتتة الثقافات هيدروجيل 12،13. وقد تم استخدام الأساليب الفنية المتطورة بما في ذلك متعددة الطبقات الحجرية 14، و3D الطباعة 15 لدراسة الرئة والكبد وأنسجة الكلى. ومع ذلك، هناك عدم وجود نماذج 3D CNS التي تسمح للنمو الخلايا العصبية مجزأة، مثل محاكاة العمارة القشرية وعلم الأحياء. وقد تم فصل النمو من neurites التي من أجسام الخلايا العصبية سابقا أظهر في الثقافات 2D باستخدام التصنيع الدقيق 16،17 السماح للدراسة تتبع محور عصبي المسالك، تدفق الكالسيوم وهندسة الشبكات والأنشطة. ألهمتنا هذه الفكرة لتطوير الأنسجة العصبية الاستقطاب 3D حيث توجد أجسام الخلايا ومساحات محور عصبي في أماكن مختلفة تحاكي العمارة الطبقات من الدماغ 18 . ويستند نهجنا على استخدام فريدة من نوعها الحرير تصميم سقالة التي تستوعب كثافة عالية من الخلايا في حجم المحصورة ويسمح ثمرة من شبكة كثيفة محور عصبي إلى هلام الكولاجين. نحن هنا لشرح إجراءات التجميع الكامل لمثل الدماغ الأنسجة بما في ذلك تصنيع السقالة وثقافة العصبية.

البروتوكول

وتمت الموافقة على بروتوكول العزلة أنسجة المخ من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي جامعة تافتس ويتوافق مع المعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة B2011-45).

1. الحرير إعداد سقالة

  1. إعداد حل الحرير من الشرانق Bombyx موري كما هو موضح سابقا 19،20.
    1. قطع كل شرنقة إلى 8 قطع متساوية باستخدام مقص. استخدام حوالي 11 الشرانق لمدة 5 غرام من الشرانق مجزأة. (15 دقيقة)
    2. إعداد 2 لتر من 0.02 M نا 2 CO 3 الحل وجعله في الغليان باستخدام صفيحة ساخنة. (15 دقيقة)
    3. تزن 5 غرام من الشرانق مجزأة وسلقها في نا 2 CO 3 الحل لمدة 30 دقيقة. تحريك الحرير المغلي كل بضع دقائق مع ملعقة. هذه الخطوة، كما دعا اجتثاث جومينج، ينقي فبروين الحرير من البروتينات محبة للماء، sericins. (30 دقيقة)
      4. بكسر فبروين من قبل جهة وشطفه في الماء المقطر ثلاث مرات على الأقل لتغسل أي سيريسين والمواد الكيميائية المتبقية. (5 دقائق)
    4. وضع فبروين الرطب على طبق بتري وتجفيف استخراج فبروين في غطاء تدفق O / N.
    5. في اليوم التالي تزن كتلة فبروين الجافة ومكان فبروين في كوب زجاجي. (15 دقيقة)
    6. من أجل حل فبروين في 9.3 M LiBr الحل، وحساب حجم المطلوب (في مل) من LiBr بضرب كتلة فبروين الجافة التي كتبها 4. صب ببطء حل LiBr على فبروين الحرير وتزج جميع الألياف فبروين باستخدام الملعقة. تغطية الكأس لمنع التبخر ووضعه عند 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات للسماح للألياف بحل. (15 دقيقة)
    7. باستخدام حقنة، وجمع الحل فبروين من كوب وتحميله في أشرطة غسيل الكلى MWCO 3500. أداء غسيل الكلى ضد الماء المقطر لمدة 48 ساعة. تغيير الماء كل بضع ساعات.
    8. باستخدام حقنة، وجمع الحل فبروين منأشرطة الكاسيت إلى 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي مرتين في 9000 دورة في الدقيقة (~ 12700 x ج) في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. صب طاف في أنبوب جديد بعد كل خطوة الطرد المركزي وتجاهل بيليه. (40 دقيقة)
    9. قياس تركيز فبروين عن طريق تقدير الوزن الجاف. صب 1 مل من محلول الحرير في وزن القارب. تجفيف العينة في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. وزن فبروين الحرير الجاف وحساب تركيز محلول فبروين الحرير بضرب الوزن التي حصل عليها 100. تركيز المتوقع من حل الحرير هو 6-9٪ (ث / ت).
    10. ضبط تركيز الحرير إلى 6٪ (ث / ت) عن طريق تمييع في الماء المقطر.
      نقطة وقف: يمكن تخزين فبروين الحرير السائل عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد في حاوية مغلقة.
  2. إعداد السقالات التي يسهل اختراقها من حل الحرير.
    1. ينخل كلوريد الصوديوم الحبيبية لفصل حبيبات بحجم 500-600 ميكرون، والتي سيتم استخدامها في خطوات لاحقة. تجاهل الحبيبيةالصورة الحجم أقل من 500 ميكرون وأكثر من 600 ميكرون. (15 دقيقة)
    2. صب 30 مل من محلول الحرير 6٪ في تترافلوروإيثيلين (PTFE) قالب (الشكل 1). بلطف مبعثر 60 غرام من كلوريد الصوديوم المصفى على الحرير. اضغط على الحاوية للحصول على طبقة موحدة من الملح. احتضان 48 ساعة على RT لبلمرة الحرير.
    3. وضع القالب PTFE التي تحتوي على سقالة في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لاستكمال البلمرة وتتبخر أي السائل المتبقي.
    4. وضع محتوى القالب PTFE في دورق يحتوي على 2 لتر من الماء المقطر لمدة 48 ساعة ليتش من الملح. تغيير الماء 2-3 مرات في اليوم الواحد. إزالة السقالات الاسفنجة من قوالب عندما الملح ترشح تماما من نقطة التوقف: يمكن تخزين الإسفنج مغمورة في الماء عند 4 درجات مئوية في حاوية مغلقة لمنع السقالات من الجفاف.
    5. عندما تصبح جاهزة، قطع السقالات مع 5 ملم خزعة قطر لكمة. قبل قطع السقالات لتصل إلى حوالي 2 ملم في الطول. بوNCH ​​من وسط سقالة مع 2 مم خزعة قطر لكمة (الشكل 2A). (1 ساعة)
    6. الأوتوكلاف السقالات مغمورة في الماء لتعقيم لهم (دورة الرطب، 121 ° C، 20 دقيقة) نقطة وقف: يمكن تخزين الإسفنج مغمورة في الماء عند 4 درجات مئوية في حاوية مغلقة لمنع السقالات من الجفاف.
    7. قبل البذر الخلية المخططة، تزج السقالات في معقم 0.1 ملغ / مل بولي-D-ليسين (PDL) حل. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
    8. غسل السقالات 3X مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة غير ملزمة PDL. (30 دقيقة)

2. عزل الجرذ العصبونات القشرية

  1. تشريح القشور من يوم الجنينية 18 الفئران (E18) سبراغ داولي كما هو موضح سابقا من قبل Pacifici وبيروتزي 27 بعد الحصول على بروتوكول الحيوان المعتمدة. (2 ساعة)
  2. احتضان 10 القشور في 5 مل من 0.25٪ التربسين مع 0.3٪ الدناز I (من البنكرياس البقري) لمدة 20 دقيقة في 37 ° C.
  3. إبطال نشاط التربسين بإضافة حجم مساو من 1 ملغ / مل بروتين فول الصويا.
  4. يسحن القشور باستخدام 10 مل ماصة باستور قبل pipetting صعودا وهبوطا من 20 مرات حتى يتم إنشاء تعليق خلية واحدة. أن يكون لطيف وتجنب تشكيل فقاعة الهواء. (10 دقيقة)
  5. الطرد المركزي تعليق خلية في 127 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. اعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل من مستنبت (Neurobasal المتوسطة، 1X B27 تكملة، 1X Glutamax، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). عد الخلايا. تركيز الخلية المتوقع حوالي 2x10 7 / مل. (20 دقيقة)

3. بانشاء الجمعية والثقافة

  1. سقالة البذر مع الخلايا.
    1. نقل السقالات العقيمة وجميع الأواني اللازمة داخل الخلية هود الثقافة. باستخدام ملقط معقم مكان السقالات في 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا أن تخصيص سقالة واحد لكل بئر. (10 دقيقة)
    2. تزج السقالات في مستنبت الخلية لكي تتوازن لهم قبل الخلية البذورجي. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. (10 دقيقة)
    3. نضح الزيادة في المتوسط ​​من السقالات.
    4. تطبيق 100 ميكرولتر من تعليق خلية / سقالة. (10 دقيقة)
    5. احتضان الخلايا عند 37 درجة CO / N للسماح مرفق الخلية إلى السقالة.
    6. في صباح اليوم التالي نضح الخلايا غير المرفقة وتطبيق 200 ميكرولتر / بئر مستنبت الطازجة. (10 دقيقة)
  2. سقالة تضمين مع الكولاجين المصفوفة. (2 ساعة)
    1. وضع 10X PBS، المياه، 1 N هيدروكسيد الصوديوم والفئران ذيل أنا الكولاجين على الجليد. يعد حل عمل الكولاجين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحفاظ على الجليد حتى يبني المصنف خلية جاهزة (تصل إلى 1 ساعة).
    2. إزالة بنيات الحرير خلية المصنفة من الحاضنة ونضح تتجاوز المتوسط.
    3. باستخدام ملقط معقم نقل السقالات إلى الآبار الفارغة على لوحة جيدا وتزج كل سقالة في 100 ميكرولتر من 3 ملغ / مل حل الكولاجين. وضع لوحة زراعة الأنسجة الظهرفي الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح للبلمرة الكولاجين.
    4. تطبيق 100 ميكرولتر من قبل تحسنت مستنبت خلية / جيد. ثقافة يبني لمدة أسبوع واحد تغيير المتوسط ​​كل يوم عن طريق استبدال سوى نصف حجم المتوسط.

4. تحليل المجهر

  1. الحي / تلطيخ الميت (1 ساعة)
    1. إعداد محلول المخزون من يوديد propidium (PI) 1 ملغ / مل (1.5 ملم) في الماء المقطر.
    2. إعداد محلول المخزون من ثنائي الأسيتات فلوريسئين (FDA) 2 ملغ / مل في الأسيتون.
    3. يعد حل عمل تتضمن 10 ميكرومتر PI و 0.15 ميكرومتر ادارة الاغذية والعقاقير المخففة في برنامج تلفزيوني. قبل الحارة الحل إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    4. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت لإزالة esterases المصل. نضح في برنامج تلفزيوني.
    5. تطبيق حل الفريق استعد مسبقا على الخلايا لمدة 2 دقيقة ويغسل مع برنامج تلفزيوني.
    6. استخدام المجهر epifluorescent لصورة الخلايا (PI السابق λ = 490 نانومتر، م λ = 570 نانومتر، FDA السابق λ = 490 نم، م λ = 514 نانومتر). لا تزال وصمة عار مستقرة أكثر من 40 دقيقة. تلطيخ لفترات طويلة قد يؤدي إلى تلطيخ غير محددة الناتجة عن امتصاص PI من قبل الخلايا وشارك في توطين PI / FDA في الخلايا.
  2. المناعية
    1. في نقطة الوقت المطلوب للثقافة إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لمدة 30 دقيقة في RT. نظرا لسمية PFA أبخرة يجب أن يتم تنفيذ الخطوة تحديد في غطاء الدخان الكيميائية.
    2. غسل السقالات مع 3X PBS نقطة وقف: يمكن تخزين بنيات PFA الثابتة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أيام قبل الشروع في اتخاذ مزيد من الخطوات.
    3. احتضان السقالات في 0.2٪ تريتون، 0.25٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني يحتوي على الأجسام المضادة الأولية O / N عند 4 درجات مئوية.
    4. في اليوم التالي تجاهل حل تلطيخ وغسل السقالات 3 × 30 دقيقة مع PBS لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير منضم.
    5. احتضان هذه العينات مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 0.2٪ تريتون، 0.25٪ BSA في برنامج تلفزيوني ل2ساعة على RT.
    6. إزالة حل تلطيخ وغسل السقالات 3 × 30 دقيقة مع PBS لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير منضم.
    7. صورة السقالات باستخدام مجهر متحد البؤر مع الهدف 20X بأخذ 100 ميكرون ض أجزاء من العينة مع 1 ميكرومتر الخطوة. لتصور neurites التي رقيقة يجب أن تكون دقة وضوح الصورة من الحد الأدنى 1024 X 1024 بكسل.
  3. RNA، DNA والبروتين العزلة
    ملاحظة: يتم تنفيذ RNA، DNA والبروتين العزلة باستخدام التجاري AllPrep DNA / RNA / البروتين كيت البسيطة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    1. باستخدام ملقط معقم نقل السقالات من لوحة الثقافة إلى 2 مل أنبوب معقم. وضع السقالة واحدة في أنبوب.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة RLT إلى كل أنبوب.
    3. تعطيل بناء عن طريق تفتيت مع microscissors معقمة.
    4. لتجانس الأنسجة تعطلت، ونقل المحتوى من الأنبوب إلى عمود الدوران. تدور لمدة 2 دقيقة بأقصى سرعة في microcentrifuge.والمتجانس المحللة لأنها تمر من خلال عمود الدوران.
    5. جمع التدفق من خلال واستخدامها على الفور لعزل RNA، DNA والبروتين بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
    6. قياس العائد من الأحماض النووية أي طريقة أخرى متوافقة (على سبيل المثال، معمل NanoDrop).
    7. قياس العائد البروتين باستخدام BCA البروتين الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. قياس نتائج الفحص باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية الطول الموجي 562 نانومتر.
      ملاحظة: يتم عرض العائد المتوقع من الأحماض النووية والبروتين في بناء فيما يتعلق كثافة الخلية في الشكل (4).

النتائج

الصلبة الإسفنج الحرير قبل القطع على شكل دونات تمثل فكرة فريدة من نوعها وبسيطة لتحقيق بنية مجزأة تشبه الأنسجة العصبية (الشكل 2A). بنية مسامية عالية من السقالة مع حجم المسام من حوالي 500 ميكرون النتائج في مساحة مرتفعة بشكل استثنائي مما يتيح للزرع ونمو كثافة الخلايا عالية ضمن حجم صغير (2x10 7 / مل) (الشكل 2B). بالإضافة إلى ذلك، المسامية العالية للسقالة يسمح للنشر غير المقيد من المواد الغذائية والنفايات الناتجة في جدوى متفوقة من مزارع الخلايا كثيفة على مدى فترات زمنية طويلة. على بذر الخلايا العصبية إرفاق بسرعة وبشكل موحد على السطح من مسام سقالة.

بعد التعلق خلية كاملة ويتم معايرتها الخلايا على الركيزة الحرير، ويتم تعبئة سقالة الإسفنج مع مصفوفة الكولاجين لينة من أجل توفير بيئة 3D لتشكيل شبكة محور عصبي (الشكل 3 ). في غياب مصفوفة الكولاجين تجزئة من المحاور والهيئات الخلية غير ممكن كما تنمو الخلايا العصبية ملحقات فقط على سطح المسام مما أدى إلى شبكات مختلطة كما وجدت مع الأسطح 2D (الشكل 3B). في المقابل، يقدم جل الكولاجين كانت شبكة التي تدعم نمو محور عصبي واسعة في 3D، بينما تبقى الخلايا العصبية الهيئات تعلق على سقالة الحرير (الشكل 3C). هذا نمط النمو يؤدي إلى تجزئة أجسام الخلايا والشبكات محور عصبي نقية (الشكل 3D)، الذي يشبه المادة الرمادية والمادة البيضاء من القشرة في المخ.

وبصرف النظر عن المجهري، يمكن تقييم يبني مع مجموعة متنوعة من الأساليب الأخرى 18، اعتمادا على مسألة وراء التجربة. على سبيل المثال، وعزل DNA، RNA والبروتين من بنيات يمكن أن يكون بسهولة تنفيذها باستخدام مجموعات تجارية (الشكل 4). العائد من الأحماض النووية والبروتين البولي ايثيلينص بناء يعتمد على عدد من الخلايا المصنفة في البداية على السقالات الحرير. المصنفة على المزيد من الخلايا وارتفاع العائد من DNA، RNA والبروتين.

figure-results-1
الرقم العفن 1. PTFE تستخدم لإعداد الإسفنج الحرير سقالة الأبعاد: 10 سم القطر، 2 سم ارتفاع الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. نموذج 3D نسيج يشبه الدماغ. (A) المسامية سقالة الإسفنج الحرير. (B) لايف / تلطيخ القتلى من الخلايا العصبية في يوم 1 على البذر على سقالة الحرير قبل التضمين الكولاجين (خلايا خضراء حية، والخلايا الحمراء الميتة). لوحات على الجانب الأيمن تظهر أماهgnification من منطقة المأسورة في إطارات الحمراء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. العصبية ثمرة مجزأة في مثل الدماغ نموذج الأنسجة 3D (A) حجرات سقالة: الخلايا الحمراء مقصورة الجسم، مقصورة بلو محور عصبي. (B) نمط نمو الخلايا العصبية في يوم 1 على البذر قبل الكولاجين التضمين. (C). ثمرة العصبية في يوم 7 على البذر في المقصورة خلايا الجسم. (D) ثمرة العصبية في يوم 7 على البذر في المقصورة محور عصبي. الأخضر - βIIITubulin الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذاالشكل.

figure-results-4
الرقم 4. المتوقعة العائد من (A) RNA والحمض النووي، و (B) البروتين في بناء فيما يتعلق كمية من الخلايا المصنفة في سقالة (± SD، ن = 5). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .

المناقشة

وصفنا هنا الإرشادات لتجميع نموذج أنسجة ثلاثي الأبعاد يشبه الدماغ. يتميز النموذج بثقافة مستقطبة كثيفة للخلايا العصبية مما يؤدي إلى تطوير جزأين مختلفين شكليا: أحدهما يحتوي على أجسام خلوية مكتظة بكثافة ، والثاني يحتوي على شبكات محورية نقية. بشكل عام ، تحاكي بنية السقالة ونمط النمو الأنسجة القشرية للدماغ بما في ذلك الطبقات الرقائقية الست ومسارات المادة البيضاء21.

يسمح نموذج الأنسجة القائم على بروتين الحرير على شكل دونات بتعديل وضبط الخواص الميكانيكية والأشكال الهيكلية متعددة الاستخدامات وحشوات الهيدروجيل والمكونات الخلوية. وبالتالي ، فإن نموذج الأنسجة هذا يؤسس منصة أساسية لمجموعة واسعة من الدراسات. الحرير مرشح مناسب لمنصات المواد الحيوية نظرا لتوافقه الحيوي ومعالجته المائية وخصائصه الميكانيكية والتحلل القوية22. تعمل مصفوفة الحرير أيضا كمرساة مستقرة لتقليل تقلص هلام الكولاجين بمرور الوقت في الثقافة. تم تعديل الخصائص مثل تركيز الحرير ومسامية السقالة المستخدمة في هذا النموذج مسبقا لتحقيق النمو الأمثل للخلايا والخصائص الميكانيكية مما يؤدي إلى مرونة الأنسجة الشبيهة بالدماغ18،23،24. نقترح الحفاظ على هذه المعلمات ثابتة لضمان النتيجة الناجحة وقابلية التكرار للتجارب.

تم تحقيق تكوين شبكة الخلايا العصبية ثلاثية الأبعاد من خلال الجمع بين نوعين من المواد الحيوية ذات الخصائص الميكانيكية المختلفة: سقالة صلبة لتوفير تثبيت الخلايا العصبية ومصفوفة هلامية أكثر نعومة للسماح باختراق المحاور العصبية والاتصال في 3D. توفر تفضيلات المواد الانتقائية لسقالة الحرير والهيدروجيل الناعم المبدأ الأساسي لتقسيم الخلايا العصبية من الوصلات المحورية. نظرا للطبيعة الخاملة لسقالة الحرير ، فإن الوظيفة باستخدام poly-D-lysine مطلوبة للتعلق العصبي. ومع ذلك ، يمكن تطبيق عوامل أخرى معززة للالتصاق الخلوي مثل RGD25 أو fibronectin26. لتحقيق تكوين شبكة ثلاثية الأبعاد ، يجب ملء سقالة الحرير بالهيدروجيل في الوقت المناسب بمجرد ربط الخلايا العصبية بالسقالة. وبالمثل ، يمكن استبدال حشو مصفوفة الكولاجين بمواد هلامية مائية أخرى ، مما يسمح بدراسة تأثير البيئات ثلاثية الأبعاد خارج الخلية على تكوين الشبكة المحورية لتكون بمثابة منصة لتقييم الهلاميات المائية الجديدة من حيث توافق الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، بصرف النظر عن الخلايا العصبية القشرية للفئران ، يمكن استخدام مصادر عصبية أخرى مثل الخلايا العصبية الحصينية أو الخلايا العصبية المستحثة متعددة القدرات (iPSc). علاوة على ذلك ، يمكن استخدام نموذج الأنسجة لدراسة تفاعلات الخلايا غير المتجانسة من خلال تضمين الخلايا الدبقية جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية وبناء أنسجة أكثر تعقيدا شبيهة بالدماغ.

كما هو موضح سابقا ، يمكن استخدام نموذجنا لتقييم وظائف الخلايا العصبية في البيئة المكروية ثلاثية الأبعاد مع مجموعة متنوعة من المقايسات مثل قابلية الخلية للحياة ، والتعبير الجيني ، و LC-MS / MS والفيزيولوجيا الكهربية ، وبالتالي إظهار الأهمية الفسيولوجية للنموذج18. يمكن أيضا استخدام طرق أخرى ، والتي تستخدم بشكل متكرر لتقييم التركيبات المهندسة للأنسجة ثلاثية الأبعاد ، مثل التلوين المناعي والفحص المجهري8،9،11 لتقييم توزيع الخلايا ومدى تكوين الشبكة المحورية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه نظرا للكثافة العالية لمصفوفة الكولاجين ، فإن تغلغل الأجسام المضادة وعمق التصوير يقتصر على بضع مئات من الميكرومترات. علاوة على ذلك ، قد تتأثر نسبة الإشارة إلى الضوضاء بمضان الخلفية غير المحدد. يمكن التغلب على ذلك باستخدام متتبعات الخلايا المحبة للدهون والبروتينات الفلورية المعبر عنها وراثيا والتي تقلل من الحاجة إلى التلوين المناعي11. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء التصوير باستخدام الفحص المجهري 2 فوتون بدلا من تقنية الفوتون الواحد المعتادة ، والتي قد تقلل من فقدان الإشارة ، والتبييض الضوئي ، ويمكن تمديدها إلى عدة مئات من الميكرومترات من العمق.

باختصار ، توفر الأنسجة الشبيهة بالدماغ القائمة على الحرير والكولاجين منصة قوية لدراسة الشبكات العصبية في 3D وهي نقطة انطلاق لتطوير نماذج أكثر تقدما للاضطرابات العصبية في المستقبل. بغض النظر عن طريقة التقييم ، فإن البساطة النسبية لنموذج الأنسجة هذا تدعم فائدته ونجاحه وقابليته للتكاثر.

الإفصاحات

برعاية نشر هذا المقال الفيديو عن طريق كورنينج.

شكر وتقدير

نشكر مختبر الدكتور ستيفن موس على توفير أنسجة دماغ الفئران الجنينية. صمم MDT البروتوكول الأصلي. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. حصل K.C. على زمالة ما بعد الدكتوراه من مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) (CH 1400 / 2-1).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Na2CO3Sigma-Aldrich223530
LiBrSigma-Aldrich213225
MWCO 3500 أشرطة غسيل الكلى Thermo Fisher66110
لوحة تسخينفيشر ScientificIsotemp
الطرد المركزي 5804 REppendorf
SieveFisher Scientificرقم 270 ، رقم 35 ، رقم 30
قالب PTFEمصنوع في المنزل (<قوي>الشكل 1< / قوي>) قطر 10 سم ، ارتفاع 2 سم
NaClSigma-Aldrich71382
خزعة لكمة 5  ممالدقةالعالمية 501909
خزعة لكمة 2 &# 160 ؛ ممأداة الدقة العالمية501908
بولي D-lysineSigma-AldrichP6407-5MGالتركيز النهائي 10 & # 160; μ جم / مل ، مذاب في الماء
PBSSigma-AldrichD1283-500ML
TrypsinSigma-AldrichT4049-500ML
DNaseRoche10104159001التركيز النهائي 0.3٪
بروتين فول الصوياSigma-AldrichT6522-100MGالتركيز النهائي 1 & # 160 ؛ ملغ / مل
المتوسط العصبيالعصبي 21103049الاحماء حتى 37 &# 160 ؛ ° C قبل الاستخدام
B27 الملحق 50xGibco17504-044
GlutamaxGibco35050-061
Penicilin StreptomycinCorning30-002-CI
Collagen I ، ذيل الفئران ، 100 & # 160 ؛ ملغكورنينج354236التركيز النهائي 3 &# 160 ؛ ملغ / مل
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتشS2770
بروبيديوم يوديدسيجما ألدريتشP4170-10MGالفلوريسين السام
الأسيتاتسيجما ألدريتشF7378-5G
أوليمبوس MVX10أوليمبوس
بارافورمالدهيدسيجما ألدريتشP6148سام ، التركيز النهائي 4٪
بقري مصل الألبومينسيجما ألدريتشA7906-10G
مضاد وبيتا ؛ III الأجسام المضادة توبولين أرنب Sigma-AldrichT22001:500
مضاد للأرانب Alexa-546مجسات جزيئيةA11010ماعز 1:250
مصل الماعزSigma-AldrichG9023-5ML
Leica SP2 مجهر متحد البؤرLeicaobjective 20X
QIAshredderQiagen79654
AllPrep DNA / RNA / Protein Mini KitQiagen80004
كحول إيثيلي نقيسيجما ألدريتشE7023   ؛
2-MercaptoethanolSigma-Aldrich63689
NanoDrop 2000c / 2000 UV-Vis مقياس الطيف الضوئيThermo Scientific
23225
قارئ الألواح Spectramax M2الأجهزةامتصاص 562 نانومتر
مقص صغير ، اقتصادي ، من نوع VannasTedPella1346
أداة ثنائي BCA مقايسة البروتين Thermo Scientific الجزيئية

المراجع

  1. Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. Neurological Disorders. , World Health Organization. Geneva. (2005).
  2. Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).
  3. Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).
  4. Wesseling, H., et al. A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).
  5. Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures. Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).
  6. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  7. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  8. Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).
  9. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  10. Hogberg, H. T., et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S4(2013).
  11. Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly. Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).
  12. Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel. Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).
  13. Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells. Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).
  14. Gurkan, U. A., et al. et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures. Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).
  15. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).
  16. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature. 2 (8), 599-605 (2005).
  17. Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity. J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).
  18. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).
  19. Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).
  20. Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  21. Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts. Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).
  22. Vepari, C., Kaplan, D. L. Silk as a biomaterial. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).
  23. Yao, D., et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).
  24. Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).
  25. Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).
  26. Hopkins, A. M., et al. Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering. Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).
  27. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol. Vis. Exp. (63), e3965(2012).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استنادا الحرير الكولاجين المهندسة 3D نموذج الاستقطاب العصبية الأنسجة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.