يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

11.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52976

⸱

يناير 13, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Biology, Spanish National Research Council (CSIC), Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC), 2Hospital de Santa Cristina, Healthcare Research Institute Princesa Hospital (IIS-Princesa)

في هذه المقالة

ملخص

هنا يرد بروتوكول لقياس التقاط البكتيريا عن طريق خلايا CD4 + T التي تحدث أثناء تقديم المستضد عبر transinfection من الخلايا الجذعية المصابة مسبقا (DC). وتبين لنا كيفية تنفيذ الخطوات الضرورية: عزل الخلايا الأولية، وإصابة DC، DC / T تشكيل المترافقة الخلية، وقياس البكتيرية ترنسفكأيشن الخلايا التائية.

الملخص

في الآونة الأخيرة ، أظهرنا ، على عكس ما هو موصوف ، أن خلايا CD4 + T ، نموذج الخلايا المناعية التكيفية ، تلتقط البكتيريا من الخلايا المتغصنة المصابة (DCs) من خلال عملية تسمى العدوى. هنا ، نصف تحليل عملية العدوى ، والتي تحدث أثناء عرض المستضد. تم الكشف عن هذه العملية باستخدام خلايا CD4 + T من الفئران المعدلة وراثيا OTII ، والتي تحمل مستقبلات الخلايا التائية (TCR) الخاصة بببتيد البيض (OVAp) ، والتي يمكن أن تشكل بالتالي مجمعات مناعية مستقرة مع الخلايا المتغصنة المصابة المحملة بهذا OVAp المحدد. يمكن مراقبة ديناميكيات البكتيريا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أثناء انتقال الخلايا التائية DC-T عن طريق تصوير الخلايا الحية ويمكن إجراء القياس الكمي للعدوى البكتيرية عن طريق قياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس العدوى الانتقالية بطريقة أكثر حساسية تعتمد على استخدام الجنتاميسين ، وهو مضاد حيوي أمينوغليكوزيد غير منفذ يقتل البكتيريا خارج الخلية ولكن ليس البكتيريا داخل الخلايا. تم استخدام هذه الطريقة الكلاسيكية سابقا في علم الأحياء الدقيقة لدراسة كفاءة الالتهابات البكتيرية. نوضح بموجب هذا بروتوكول العملية الكاملة ، من عزل الخلايا الأولية إلى القياس الكمي للعدوى المعبرة.

المقدمة

عندما يصيب الممرض مضيفه، عادة ما يكون هناك تفعيل الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، اللازمة لإزالة البكتيريا. المناعة الفطرية هي خط الدفاع الأول الذي يمنع معظم الالتهابات. المناعة الفطرية تميز في العناصر المحددة الطريقة التي يتم الحفاظ عليها في مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة (أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض، PAMPS) 1. آليات المناعة الفطرية وتشمل الحواجز المادية مثل الجلد، والحواجز المواد الكيميائية (الببتيدات المضادة للميكروبات، الليزوزيم) والكريات البيض الفطرية، والتي تشمل البالعات (الضامة، العدلات، والخلايا الجذعية)، الخلايا البدينة، الحمضات، الخلايا القاعدية، والخلايا القاتلة الطبيعية 2. هذه الخلايا تحديد وإزالة مسببات الأمراض، إما عن طريق مهاجمتهم من خلال الاتصال أو عن طريق البلعمة، والذي يتضمن العوامل المسببة للأمراض التي تجتاح والقتل. هذا النظام لا يسمح دفاع مدى الحياة، على النقيض من الحصانة على التكيف، والتي تمنح الذاكرة المناعية ضد صathogens. الجهاز المناعي التكيفي هو خط الدفاع الثاني وغير قادرين على التعرف والرد على مستضدات معينة من الجراثيم المتعددة والمواد غير الميكروبية 3. المكونات الرئيسية للجهاز المناعي التكيفي هي الخلايا الليمفاوية، والتي تشمل خلايا B و T. وتشارك خلايا B في الاستجابة الخلطية، إفراز أجسام مضادة ضد مسببات الأمراض أو البروتينات الخارجية. ومع ذلك، وخلايا T تمثل مناعة خلوية، تحوير الاستجابة المناعية مع إفراز السيتوكينات او قتل الخلايا المصابة الممرض 4.

مستضد الخلايا تقديم (ناقلات الجنود المدرعة) بما في ذلك الخلايا الجذعية أو الضامة، مكونات نظام المناعة الفطري، يمكن التعرف على مسببات الأمراض يبلعم ومكونات عملية البكتيرية إلى المستضدات، والتي يتم تقديمها في سطح الخلية التي كتبها مجمع على التوافق النسيجي الكبرى (MHC) 5-7. بعد ناقلات الجنود المدرعة وphagocytized مسببات الأمراض، وعادة ما تهاجر إلى الغدد الليمفاوية تجفيف، حيث تتفاعل مع Tالخلايا. يمكن أن الخلايا الليمفاوية T تعترف مجمعات محددة الببتيد MHC بواسطة مستقبلات الخلايا T بهم. المشبك المناعي (IS) يحدث في واجهة بين APC-تحميل مستضد والخلايا اللمفاوية خلال تقديم المستضد 8،9. يمكن لبعض البكتيريا البقاء على قيد الحياة البلعمة وتنشر بشكل منتظم داخل ناقلات الجنود المدرعة. في هذا الرأي، ناقلات الجنود المدرعة المصابة بمثابة خزانات البكتيرية أو "أحصنة طروادة" التي تسهل انتشار بكتيريا 10. في اتصال حميم بين ناقلات الجنود المدرعة والخلايا الليمفاوية التي تحدث أثناء تشكيل هي وظيفة أيضا كمنصة لتبادل جزء من الأغشية، والمادة الوراثية وexosomes ويمكن خطف لبعض الفيروسات لتصيب خلايا T؛ وهذا ما يسمى عملية transinfection 11-13.

بعض أنواع البكتيريا المسببة للأمراض (الليستريا المستوحدة، السالمونيلا الملهبة والشيجلا الفلكسنرية) قادرة على غزو الخلايا اللمفية تي في الجسم الحي وتعديل سلوكهم 14-16. لديناوصف مؤخرا أن الخلايا اللمفية تي هي أيضا قادرة على التقاط البكتيريا عن طريق transinfection من الخلايا الجذعية المصابة سابقا (DCS) أثناء تقديم المستضد 16. T خلية التقاط البكتيريا عن طريق transinfection جدا أكثر فعالية (1،000-4،000x) من العدوى المباشرة. T القبض على خلايا البكتيريا الممرضة وغير الممرض تشير من transinfection هو عملية يقودها خلايا T. لافت للنظر، transinfected T (تيط) خلايا قتل البكتيريا بسرعة القبض وفعلت ذلك أكثر كفاءة من البالعات المهنية 16. هذه النتائج، التي كسر عقيدة علم المناعة، وتبين أن خلايا المناعة التكيفية يمكن أن تؤدي المهام التي كانت حصرية من المفترض أن الحصانة الفطرية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرنا أن الخلايا تيط تفرز كميات كبيرة من السيتوكينات الموالية للالتهابات وتحمي من العدوى البكتيرية في الجسم الحي.

هنا نقدم البروتوكولات المختلفة المستخدمة لدراسة عملية transinfection البكتيرية فينموذج الفأر. ويستند هذا النموذج على استخدام خلايا CD4 + T من الفئران المعدلة وراثيا OTII والتي تحمل محددة TCR لالببتيد 323-339 من OVA (OVAp) في سياق I-أب 17 التي تتفاعل بشكل خاص مع العظام بكتيريا المصابة كوسا- البلدان النامية المشتقة (BMDCs) 18،19 محملة OVAp، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي المناعي مستقرة.

T خلية transinfection يمكن تصور وتتبع باستخدام المجهر مضان. بالإضافة إلى ذلك، التدفق الخلوي يمكن استخدامها للكشف عن الخلايا المصابة من خلال الاستفادة من مضان المنبعثة من البكتيريا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) 16،20. وعلاوة على ذلك، T خلية transinfection يمكن قياس باتباع نهج أكثر حساسية، وفحص بقاء الجنتاميسين التي تسمح بقياس عدد كبير من الأحداث. جنتاميسين مضاد حيوي لا يمكن اختراق الخلايا حقيقية النواة. ولذلك، باستخدام هذه المضادات الحيوية يسمح التفريق بين البكتيريا داخل الخلايا التي نجت إضافة الاب المضادات الحيويةتلك الخلية أوم الذين قتلوا 21.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية قبل لجنة أخلاقيات البحوث في جامعة مدريد المستقلة وأجرى تحت إشراف جامعة مدريد المستقلة رئيس العام لرعاية صحة الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية الإسبانية والأوروبية. كانت ولدت الفئران في معين الممرض الحر (SPF) الإسكان، حيث الموت الرحيم كانت من قبل أفراد مدربين ومؤهلين باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO 2) طريقة الاستنشاق.

1. ماوس نخاع العظام المستمدة من البلدان النامية التمايز والعدوى

ملاحظة: يلخص الشكل 1 هذه الخطوة الأولى. ينبغي تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء محرك السيارة من هذه النقطة، وذلك باستخدام وسائل الاعلام فقط العقيمة، والصكوك، نصائح ماصة والأطباق الثقافة.

  1. الماوس نخاع العظام المستمدة من البلدان النامية التمايز
    1. تشريح tibias وعظام الفخذ من واحد C57 / BL6 الماوس 22 ونقل في طبق من البلاستيك مع 10 مل من RPMI المتوسطة.
    2. قطع كل من الكردوس، مع مقص العقيمة وفضح نخاع العظام، والتي لديها سمات مشرق اللون الأحمر.
    3. يبث في داخل العظم مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 5 ملي ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) (PBS عازلة / BSA / EDTA) باستخدام محقنة معقمة على بتري معقمة طبق.
    4. جمع تعليق خلية وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب في 600 x ج في جهاز للطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية).
    5. Resuspend الخلايا في 1 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) الناشر العازلة (0.15 M NH 4 الكلورين، 10 ملي KHCO 3 و 0.1 ملي EDTA) واحتضان لمدة 30 ثانية في RT من أجل القضاء على خلايا الدم الحمراء.
    6. إضافة 10 مل من RPMI 1640 متوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) وتصفية من خلال مصفاة الخلية (70 ميكرون) لإزالة شظايا العظام وكتل الخلايا قبل الطرد المركزي في نفس السرعة (600 x ج) لأنه تم القضاء على كتل من قبل التصفية.
    7. عد الخلايا لد التكيف مع 5 × 10 5 خلية / مل مع RPMI 10٪ FBS (التي تحتوي على 50 ميكرومتر B-المركابتويثانول، 1 ملي البيروفات الصوديوم) وإضافة 20 نانوغرام / مل المؤتلف الفئران colony- عامل تحفيز-محببة بلعم (RM-GM-CSF) كما تركيز النهائي.
    8. هذا إضافة إلى تعليق العقيمة، والجودة الميكروبيولوجية، 15 سم طبق بتري، والثقافة في حاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2).
    9. كل ثلاثة أيام، وتدور أسفل كل من الخلايا غير ملتصقة وخلايا منفصلة مع 5 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل من كثافة الخلايا، مع المتوسطة الطازجة تحتوي على 20 نانوغرام / مل RM-GM-CSF.
  2. نضوج البلدان النامية ومستضد تحميل
    1. في يوم 9، resuspend الخلايا في 5 × 10 5 خلية / مل من الكثافة في المتوسط ​​تحتوي على 20 نانوغرام / مل RM-GM-CSF. ثم إضافة 20 نانوغرام / مل من lipopolysaccharide في (LPS) للسماح عالية التعبير MHC-II على الخلايا واحتضان في غير الأنسجة المعالجة ثقافة عقيمة طبق بيتري 15 سم لمدة 24 ساعة.
    2. بعد واحديوم LPS التحفيز، وصمة عار بعض الخلايا DC مع الأجسام المضادة ضد CD11c والماوس، MHCII وGR-1 للتحقق البلدان النامية التمايز التدفق الخلوي. ويرد مثال على تحليل التدفق الخلوي من البلدان النامية في الشكل 3A و 3B.
      1. احتضان البلدان النامية (5 × 5 10 خلايا / عينة) مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للفأر CD16 / CD32 على 2.5 ميكروغرام / مل تركيز النهائي في 50 ميكرولتر PBS / BSA / EDTA العازلة لكل عينة. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة ضد MHCII (IA / IE)، CD11c وو GR-1 مترافق مع fluorochromes مختلفة في 1: 100، 1: 200 و 1: 500 في برنامج تلفزيوني / BSA / العازلة EDTA على التوالي.
      2. وأخيرا، وغسل البلدان النامية مع برنامج تلفزيوني / BSA / العازلة EDTA وتحليل التدفق الخلوي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
        ملاحظة: إذا كانت الخلايا المتمايزة جيدا، وخلايا جاهزة للمستضد التحميل.
    3. غسل البلدان النامية مع RPMI 10٪ FBS (بدون المضادات الحيوية)، واحتضان لهم 10 ميكروغرام / مل OTII OVAp (OVA 323-339؛ ISQAVHAAHAEINEAGR) على أنبوب من البلاستيك في 1 مل من RMPI 10٪ FBS المتوسطة في 5 × 10 6 البلدان النامية للحد الأدنى 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ونتيجة لسيطرة سلبية، وترك البلدان النامية دون يحتضنها مع OVAp.
  3. إصابة البلدان النامية
    1. تصيب البلدان النامية في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10 البكتيريا (10 جرثومة لكل DC) لمدة 1 ساعة في حاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2).
    2. غسل الخلايا DC 3X في برنامج تلفزيوني و1X في RMPI 10٪ FBS والطرد المركزي في 450 x ج من أجل غسل معظم البكتيريا خارج الخلية. وأخيرا، وخلايا resuspend في RMPI 10٪ FBS المتوسطة (بدون المضادات الحيوية) في 20 × 10 6 خلية / مل.

2. عزل CD4 + T اللمفاوية من الفئران المعدلة وراثيا OTII

ملاحظة: يلخص الشكل 1 هذه الخطوة الثانية. وينبغي أن تستخدم الغدد الليمفاوية بدلا من الطحال لعزل خلايا CD4 + T، لأن نسبة CD4 + الخلايا الليمفاوية في العقدة اللمفاويةالصورة (~ 50٪) أكبر مما كانت عليه في الطحال (~ 25٪)، وبالتالي تنقية ستكون أكثر فعالية.

  1. جعل التعليق وحيدة الخلية من الغدد الليمفاوية
    1. إزالة الإربي، الإبطين، العضدية، عنق الرحم والغدد الليمفاوية المساريقي 23 من OTII الفئران المعدلة وراثيا ونقل في طبق من البلاستيك مع 10 مل من RPMI 10٪ FBS المتوسطة.
    2. الغدد الليمفاوية طحن تحت غطاء العقيمة باستخدام شريحتين المجهر بلوري. وضع الغدد الليمفاوية على الجانب متجمد من شريحة واحدة المجهر، وفرك مع الجانب متجمد من الشريحة الثانية حتى كانت أجهزة الأرض.
    3. يغسل تعليق خلية واحدة في المخزن PBS / BSA / EDTA.
    4. تصفية الخلايا على الرغم من مصفاة الخلية (70 ميكرون) لإزالة النسيج الضام، ويغسل مع PBS / BSA / العازلة EDTA.
    5. Resuspend الخلايا في 1 مل من ACK العازلة تحلل واحتضان لمدة 1 دقيقة في RT من أجل القضاء على خلايا الدم الحمراء.
  2. عزل خلايا CD4 + T
    1. يغسل مرة أخرى كما في الخطوة 2.1.3 والعدالخلايا ل resuspend لهم في 100 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني / BSA / العازلة EDTA. إضافة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز ضد CD8، الغلوبولين المناعي، B220، CD19، MHC من الدرجة الثانية (I-أب)، CD11b، CD11c وو DX5 في 1: 250 لمدة 30 دقيقة على الجليد لاختيار السلبية في وقت لاحق من خلايا CD4 + T.
    2. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني / BSA / العازلة EDTA واحتضان الخلايا (100 × 10 6 خلية / مل) مع بلي streptavidin في التركيز الموصى به في بروتوكول الشركة المصنعة لمدة 15 دقيقة على الجليد.
    3. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني / BSA / العازلة EDTA وتصفية لهم على الرغم من مصفاة الخلية (30 ميكرون) قبل CD4 + T زنزانة انفرادية.
    4. عزل خلايا CD4 + T عن طريق الانتقاء السلبية باستخدام المغناطيسية آلة فصل الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
    5. عد الخلايا وضبط 4 × 10 6 خلية / مل مع RPMI 10٪ FBS المتوسطة (بدون المضادات الحيوية).
    6. إصلاح والحفاظ على الجليد معزولة CD4 + T الخلايا (3 × 10 5 الخلايا) للتحقق من نقاء التدفقالكريات كما هو موضح 24. يظهر مثال CD4 + T الخلايا تنقية في الشكل 3C.

3. T خلية Transinfection قياس من قبل حماية جنتاميسين الفحص

ملاحظة: يلخص الشكل 2 هذه الخطوة الثالثة من البروتوكول.

  1. T خلية Transinfection
    1. احتضان خلايا CD4 + T معزولة مع الخلايا المصابة DC (1: 1) (أصيبوا في البلدان النامية لمدة 1 ساعة وغسلها للقضاء على البكتيريا الحرة) لمدة 30 دقيقة للسماح تشكيل المشبك المناعي في حاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2).
    2. إضافة 0.5 مل من الخلايا المعزولة CD4 + T (2 × 10 6 خلايا) و 0.1 مل من البلدان النامية المصابة (2 × 10 6 خلايا) على لوحة الثقافة 24 أيضا. كما سيطرة سلبية، تصيب بشكل مباشر 0.5 مل من خلايا CD4 + T في وزارة الداخلية من 10 البكتيريا لمدة 30 دقيقة.
    3. وتشمل الضوابط الإضافية التي تفصل البلدان النامية المصابين من خلايا T باستخدامحاجز البولي transwell (مع 3 ميكرون من حجم المسام)، التي تعوق DC-T الاتصال الجسدي. إضافة 0.1 مل من البلدان النامية داخل transwell و 0.5 مل من خلايا CD4 + T في حجرة أقل من البئر (لوحة 24 أيضا).
    4. وأخيرا، مع استكمال RMPI المتوسطة حتى يكون هناك 0.6 مل في كل بئر لجعل كميات متساوية في جميع العينات.
    5. بعد 30 دقيقة من تشكيل المشبك المناعي، إضافة 100 ميكروغرام / مل من جنتاميسين واحتضان لمدة 1 ساعة قبل جمع الخلايا في حاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2).
  2. إعادة عزل خلايا CD4 + T
    1. جمع الخلايا غير ملتصقة و resuspend لهم في المخزن PBS / BSA / EDTA. لا تزال تعلق معظم البلدان النامية إلى لوحة الثقافة البلاستيك. أنابيب دوامة بلطف لضمان تصنيف الخلية. تبقي 500 ميكرولتر من طاف الخلية عن السيطرة لإظهار أن الجنتاميسين عملت بشكل جيد.
    2. إعادة عزل خلايا CD4 + T من العينات التي تحتوي على البلدان النامية وخلايا T معا كما في الخطوة 2.2، على الرغم من أن معظم البلدان النامية يجب أن تعلق على لوحة. الحفاظ على عينات السيطرة على الجليد. تأخذ بعين الاعتبار التجارب فقط مع التلوث أقل من 2٪. يظهر مثال CD4 + T الخلايا تنقية بعد transinfection في الشكل 3D.
  3. ليز خلايا تي والبذور منها على البكتيريا لوحات المتوسطة أجار.
    1. غسل خلايا CD4 + T مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    2. عد الخلايا و resuspend لهم في 2 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100 في 500 ميكرولتر من الخلايا T ليز لهم في 1 × 10 6 خلية / مل، والإفراج عن البكتيريا داخل الخلايا من الخلايا T.
    4. تقديم 3 التخفيفات العشرية المسلسل من الخلايا هي lysed والبذور 50 ميكرولتر من كل تخفيف على البكتيريا لوحات أجار المتوسطة. تقسيم لوحات إلى 4 أجزاء والبذور التخفيفات مختلفة من الخلايا هي lysed في كل جزء. وتظهر نتائج ممثل في الشكل (4).
      1. كعنصر تحكم، وأيضا لوحة لعملت المخزنة طاف خلية من خلايا تقارن على أجار، للتأكد من أن الجنتاميسين جيدا. أيضا لوحة البلدان النامية المصابة كعنصر تحكم إضافية. في حالة حدوث انخفاض التلوث البلدان النامية (<2٪)، وطرح وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) المقابلة لانخفاض التلوث DC.

4. الكمي لT خلية Transinfection بواسطة التدفق الخلوي

ملاحظة: يلخص الشكل 2 هذه الخطوة.

  1. T خلية Transinfection
    1. تصيب BMDCs كما في الخطوة 1.3، ولكن استخدام GFP معربا عن البكتيريا في هذه الحالة.
    2. خلايا CD4 + T وصمة عار (معزولة من الغدد الليمفاوية في الخطوة 2.2) مع aminocoumarin تعقب خلية كلورو (تواجه المركز) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
    3. غسل المسمى خلايا CD4 + T مرتين مع RMPI 10٪ FBS (بدون المضادات الحيوية).
    4. احتضان البلدان النامية المصابة (بعد 1 ساعة الحضانة مع البكتيريا) مع صفت CD4 +خلايا T لمدة 30 دقيقة للسماح تشكيل المشبك المناعي عند 37 درجة مئوية بما في ذلك جميع الضوابط شرح في الخطوة 3.1.1.
  2. تلطيخ الخلايا المصابة CD4 + T
    1. بعد 30 دقيقة من DC-T تشكيل المشبك المناعي، وجمع الخلايا وغسلها في برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA.
    2. بعد سنتين يغسل مع PBS / BSA / EDTA العازلة، والخلايا مجمعة منفصلة من قبل vortexing بلطف الأنابيب.
    3. إصلاح عينات في 0.2 مل / أنبوب PBS تحتوي على 3٪ PFA لمدة 15 دقيقة في RT. ثم غسلها في برنامج تلفزيوني.
    4. احتضان مع مكافحة فأر CD16 / CD32 الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (2.5 ميكروغرام / مل) في 50 ميكرولتر / عينة من برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA لمدة 15 دقيقة على الجليد لمنع مستقبلات القطعة Fc من الخلايا الجذعية.
    5. إضافة أرنب المضادة للبكتيريا الأجسام المضادة (10 ميكروغرام / مل كما التركيز النهائي) في 50 ميكرولتر / عينة من برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA لمدة 30 دقيقة على الجليد وصمة عار البكتيريا خارج الخلية.
    6. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA واحتضان مع الأجسام المضادة ضد ماوس CD11c ومترافق مع فيكوإيريترين (PE) وحد ذاتهاالأجسام المضادة ضد condary أرنب مترافق مع تألقي الأخرى مثل اليكسا فلور 647 في 1: 200 في 100 ميكرولتر / عينة من برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    7. غسل الخلايا وتحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي. لا تنسى أن تشمل عينة من خلايا T transinfected باستخدام البكتيريا غير الفلورسنت السيطرة والعينات سلبية كما وصفت واحدة فقط من كل تألقي المستخدمة في التجربة لتعويض العينات وضبط التدفق الخلوي ضبط 25. ويظهر تحليل تمثيلي في الشكل (5).
      ملاحظة: إذا البكتيريا لا تعبر عن GFP، للتمييز بين الخلايا والبكتيريا خارج الخلية، والتسمية البكتيريا خارج الخلية، وإصلاح، وpermeabilize العينات مع تريتون X-100 عند 0.5٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. وصمة عار بعد ذلك مجموع البكتيريا (داخل الخلايا + خارج الخلية) مع تألقي مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا وصفنا كيفية أداء الفئران خلايا T transinfection بكتيريا من نخاع العظم المصاب المستمدة من البلدان النامية وكيفية قياس transinfection بكتيريا عبر نهجين مختلفين: التدفق الخلوي والجنتاميسين بقاء فحص يلخص الشكل 1 الإجراء للحصول على الخلايا. يتم إنشاؤها من قبل البلدان النامية حضانة خلايا نخاع العظام مع GM-CSF لمدة 9 أيام. ثم، يتم maturated البلدان النامية مع LPS لزيادة MHCII على غشاء لتحميلها في وقت لاحق مع الببتيد محددة من OVA (OVAp...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

خلايا T أو T الليمفاوية هي نوع من كريات الدم البيضاء التي تلعب دورا محوريا في مناعة خلوية وتنتمي إلى الاستجابة المناعية التكيفية 26. خلايا T هي صهر لإصابتها في المختبر ولكن تشير بعض التقارير أنها يمكن أن تصاب في الجسم الحي 14،15. الاتصالات الحميمة من خلايا APC وT خلال المشبك المناعي بمثابة منابر لتبادل المواد البيولوجية 13، بما في ذلك بعض الفيروسات مثل فيروس نقص المناعة البشرية (11). وقد تبين مؤخرا أن يتعارض مع العقيدة،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنح BFU2011-29450 و BFU2008-04342 / BMC من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية و PIES201020I046 من Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RPMIفيشر ScientificSH3025501
r-GMCSFPeprotech315-03
LPSSIGMAL2630-10mg
Na PyruvateThermo ScientificSH3023901
2-MEGibco31350-010
OVAp OTII (323 – 339)مصفاة خلية GenScript
70uMBD352350
  ؛ 30 ميكرومتر حقنة فيلكون معقمةBD340598
أوتوماك كلاسيكميلتيني بيوتيك130-088-887
جنتاميسيننورمون624601.6
ترانسويلكوستار3415
رطلبروناديسا1231
أجاربروناديسا1800
بارافورمالديهايد 16٪علوم المجهر الإلكتروني15710
Triton X-100
CD8 biotBD Biosciences553029
IgM BiotImmunoStepClone RMM-1
B220 BiotBD Biosciences553086
CD19 biotBD Biosciences553784
MHC-II Biot (I-A / I-E)BD Biosciences553622
CD11b biotImmunostep11BB-01mg
CD11c biotImmunostep11CB3-01mg
DX5 biotBD Biosciences553856
Gr-1 biotBD Biosciences553125
CD16 / CD32ImmunoStepM16PU-05MG
مضاد للسالمونيلاABD Serotec8209-4006
CD11cPEBD Biosciences553802
CD4-APCTonbo Biosciences20-0041-U100
Gr-1 APCBD Biosciences553129
MHC-II (I-A / I-E) FITCBD Biosciences553623
Alexa-Fluor 647 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) ،Invitrogenعالي الامتصاصA-21245
CMAC (7-أمينو-4-كلورو ميثيل كومارين)تقنيات الحياةC2110
BSASIGMAA7030-100G
Streptavidin MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-101
BD FACSCanto IIBD Biosciences

المراجع

  1. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
  2. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
  3. Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
  4. Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
  5. Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
  6. Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
  7. Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
  8. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
  9. Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
  10. Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
  11. Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
  12. Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740(2010).
  13. Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
  14. McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
  15. Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
  16. Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
  17. Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
  18. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
  19. Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  20. Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
  21. Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
  22. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1(2008).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765(2013).
  24. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
  25. Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
  26. Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Trans well Salmonella Enteritidis
T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.