يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استنفاد الانتقائي للالدبقية الصغيرة من مخيخي الحبيبة الثقافات الخلية باستخدام L-ليسين استر الميثيل

8.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52983

⸱

يوليو 7, 2015

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Washington, 2Therapeutic Innovation Group, School of Life and Medical Sciences, University College London, 3Department of Neuroinflammation, University College London

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

Microglia يمكن أن تؤثر على الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الأخرى في الثقافة من خلال آليات مختلفة مستقلة غير خلوية. هنا ، نقدم بروتوكولا لاستنفاد الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل انتقائي من الثقافات العصبية الأولية. هذه الطريقة لديها القدرة على توضيح دور التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة ، مع الآثار المترتبة على الحالات التنكسية العصبية حيث يكون الالتهاب العصبي سمة مميزة.

الملخص

Microglia ، الخلايا المناعية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي ، تلعب أدوارا متعددة الأوجه في تعديل وظيفة الخلايا العصبية والتحكم فيها ، فضلا عن التوسط في المناعة الفطرية. لقد طورت نماذج زراعة خلايا القوارض الأولية بشكل كبير فهمنا للتفاعلات العصبية الدبقية ، ولكن في الآونة الأخيرة فقط تم استخدام طرق للقضاء على الخلايا الدبقية الصغيرة على وجه التحديد من الثقافات المختلطة. إحدى هذه التقنيات - الموضحة هنا - هي استخدام L-leucine methyl ester ، وهو عامل ليزومتروبي يتم استيعابه بواسطة الضامة والخلايا الدبقية الصغيرة ، حيث يتسبب في اضطراب الليزوزومات وموت الخلايا المبرمج اللاحق13،14. تتمتع التجارب التي تستخدم L-leucine methyl ester بالقدرة على تحديد مساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة في البيئة الخلوية المحيطة في ظل ظروف استزراع متنوعة. باستخدام بروتوكول محسن في مختبرنا ، نصف كيفية القضاء على الخلايا الدبقية الصغيرة من زراعة الخلايا الحبيبية المخيخية القوارض P5. يسمح هذا النهج للمرء بتقييم التأثير النسبي للخلايا الدبقية الصغيرة على البيانات التجريبية ، وكذلك تحديد ما إذا كانت الخلايا الدبقية الصغيرة تلعب دورا وقائيا للأعصاب أو سامة عصبية في نماذج ثقافة الحالات العصبية ، مثل السكتة الدماغية أو مرض الزهايمر أو مرض باركنسون.

المقدمة

ويتكون الدماغ البشري ما يقدر ب 85 مليار خلية عصبية وأخرى 85 مليار الخلايا غير العصبية بما في ذلك الدبقية 1. بالنسبة للجزء الأكبر من السنوات ال 100 الماضية ركزت علماء الأعصاب في الغالب على سكان الخلية العصبية، واعتبرت الخلايا الدبقية أن يكون أكثر قليلا من خلايا الدعم السلبي التي قدمت الدعم الهيكلي للخلايا العصبية - وبالتالي انجليزيه اليوناني "الدبق" مترجمة إلى الإنجليزية "الغراء". في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن العصبية الدبقية التفاعلات قد تكون أكثر أهمية بكثير من الجوانب الأساسية لعلم الأعصاب، علم وظائف الأعصاب، ونشأة وتطور العديد من الأمراض العصبية. خلايا المخيخ الحبيبية (CGCs)، والأكثر وفرة السكان العصبية متجانسة في الدماغ البشري، تهيمن على المخيخ ويشكلون أكثر من 90٪ من مكونات الخلوية لها. ونتيجة لذلك، وقد استخدمت هذه الخلايا على نطاق واسع في المختبر كنظام نموذج لروقال انه دراسة التنمية العصبية، وظيفة، وعلم الأمراض 2-6.

ومع ذلك، ثقافات CGC لا تزال تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية الأخرى بنسب كبيرة يمكن القول. ونتيجة لذلك، البيانات CGC عرض مزعومة الردود العصبية المباشرة للعلاجات مختلفة من الخلايا في الواقع قد تنشأ - في جزء أو في المجموع - من الاستجابة الثانوية غير المباشرة للالدبقية المجاورة في الثقافة. لتقييم ذلك، فإننا القضاء بشكل انتقائي دبيقي من CGC الثقافات العصبية بمساعدة-L يسين استر الميثيل (LME). LME هو عامل lysomotropic في الأصل تستخدم لتدمير انتقائي الضامة 7، ومنذ ذلك الحين استخدمت لتستنزف أيضا بشكل انتقائي الخلايا الدبقية الصغيرة من العصبية، نجمية، والثقافات الدبقية مختلطة 8،9،10. والمنضوية LME الضامة والخلايا الدبقية الصغيرة، حيث أنه يسبب اضطراب الليزوزومية وموت الخلايا المبرمج اللاحقة 13،14. الضامة والخلايا الدبقية الصغيرة غنية مميز في الجسيمات الحالة، مما تسبب لها أن تكون particulaعرضة RLY عند التعرض للعلاج LME. يوفر هذا البروتوكول وسيلة قوية، ولكن بسيطة وسهلة للتأكد من مساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة في التجارب باستخدام CGC وغيرها من نظم ثقافة الدبقية / العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجريت جميع التجارب الموصوفة هنا وفقا للالمملكة المتحدة الحيوانات (إجراءات علمية) لعام 1986.

1. إعداد الآلات، الثقافة وسائل الإعلام، وأطباق

  1. إعداد اثنين مختبر الفولاذ المقاوم للصدأ مقص تشريح واثنين من الفولاذ المقاوم للصدأ ملقط المختبر. الأوتوكلاف جميع الصكوك ومكان في O الثقافة هود / N تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV) النور للتعقيم.
  2. جعل 500 مل من وسائل الإعلام الحد الأدنى الضروري (MEM) مستنبت (10٪ من الجنين مصل بقري [FBS]، 20 ملي بوكل، 25 ملي NaHCO 3، 30 ملي مد الجلوكوز، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين و 6 ميكروغرام / مل الأمبيسلين) وفلتر تعقيم. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة أشهر.
  3. إعداد 24 لوحات ثقافة جيدا تحتوي على 14 مم، عدد 1 coverslips سمك. الأوتوكلاف لل coverslips ومعطف في 100 ملغ / L بولي د يسين (PDL) كما هو موضح سابقا 3. ضوء الأشعة فوق البنفسجية تعقيم O / N.

2. إعداد حلول CGC الثقافة

  1. إعداد 'حل A' (100 مل) في تعقيمها، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية المعالجة، درهم العقيمة 2 O تحتوي على 250 ملغ من الجلوكوز، 300 ملغ من الأبقار مصل الزلال [BSA]، 955 ملغ من الفوسفات مخزنة المالحة [PBS] (كا 2+ و ملغم + مجاني)، و 1 مل من 3.8٪ MgSO 4 · 7H 2 O.
  2. إعداد 'حل B' (10 مل) تحتوي على 1 مل من 5 ملغ / مل التربسين المخفف في 9 مل من محلول A.
  3. إعداد 'حل C "(10 مل) التي تحتوي على 1000 وحدة الدناز، و 0.5 ملغ من مثبط التربسين فول الصويا، و 100 ميكرولتر من 3.8٪ MgSO 4 · 7H 2 O، تضعف إلى 10 مل مع حل A.
  4. إعداد 'الحل D' (20 مل) تحتوي على 3.2 مل من محلول C، مخففة إلى 20 مل مع حل A.
  5. تحضير محلول الملح المتوازن (EBSS) حل BSA / ايرل تحتوي على EBSS، 25 ملي NaHCO 3، 3 ملي MgSO 4 · 7H 2 O، و4٪ BSA، ودرجة الحموضة 7.4، كما هو موضح سابقا 3.
  6. إعداد LME بإضافة النقي LME إلى 5 مل من MEM مستنبت لإعطاء تركيز النهائي من 150 ملي LME، وعودة حل لدرجة الحموضة 7.4 باستخدام الفوق متر الرقم الهيدروجيني، وتصفية تعقيم باستخدام 28 ملم البولي سلفون (PES) 0.2 ميكرومتر حقنة التصفية.

3. استزراع CGCs

  1. جمع مخيخات من الجراء 4-7 يوم الفئران القديمة كما هو موضح سابقا 3. المكان على الفور في طبق بتري تحتوي على 5 مل من محلول A على الجليد.
  2. تخلصي حل الزائدة من مخيخات ومكان الأنسجة في طبق بتري غطاء.
  3. ختم الأنسجة بدقة بشفرة حلاقة ملتهب بشكل جيد على الأقل في ثلاثة اتجاهات مختلفة.
  4. إضافة الأنسجة المفروم إلى حل B (شطف طبق بيتري مع حل لضمان الأنسجة محدودة، خسر) ومكان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يهز بلطف كل بضع دقائق.
  5. إضافة الحل D (20 مل) إلى أنبوب لتحييد التربسين، ويهز المائةrifuge في 65 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. تخلصي من طاف.
  7. resuspend في 4 مل من محلول C. يسحن جيدا (ما يقرب من 10 في كل مرة) مع ثلاثة الماصات الزجاجية ملتهب من تناقص القطر، وحتى تعليق غير متجانسة بقدر الإمكان.
  8. ببطء وبلطف إضافة بضع قطرات من هذا جناسة على رأس BSA / EBSS. إذا كان يبدأ في الغرق خلال BSA / EBSS، يسحن أكثر و / أو إضافة أكثر من ذلك بقليل حل C. جناسة يجب الجلوس في طبقة على رأس BSA / EBSS. لا تهزه. تدور في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
  9. إزالة وطاف Resuspend بيليه (لينة) في 1 مل من MEM المتوسطة.
  10. عد الخلايا باستخدام haemocytometer وطبق على 800000 خلية / ساترة في 500 ميكرولتر من MEM المتوسطة. مكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 6٪ CO 2.
  11. تغيير المتوسطة في اليوم التالي (24-36 ساعة بعد الإعدادية). جعل حل MEM المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر من دورة الخلية المانع arabinofuranosyl سيتيدين (أراك).
    1. لكلساترة، في الحفاظ على 250 ميكرولتر من متوسط ​​العمر في طازجة 24 لوحة جيدا، نضح بقية، إضافة 250 ميكرولتر من الطبيعي المتوسطة MEM ونضح هذا لغسل الخلايا، ثم إضافة 250 ميكرولتر من المتوسط ​​القديم مرة أخرى إلى الخلايا وتصل أعلى مع 250 ميكرولتر من التي تحتوي على أراك المتوسطة.
      ملاحظة: خلايا يمكن استخدامها من 6 أيام في المختبر (DIV).

4. انتقائي استنزاف الخلايا الدبقية الصغيرة (أجريت في 6 DIV)

  1. إضافة LME النقي إلى 5 مل من قسامة منفصلة من MEM المتوسطة لإعطاء تركيز النهائي من 150 ملي LME.
  2. العودة الحل لدرجة الحموضة 7.4 وتصفية تعقيم باستخدام 28 ملم البولي سلفون (PES) مرشح 0.2 ميكرومتر حقنة.
  3. تمييع الحل إلى تركيز من 50 ملم (2 × LME) في MEM المتوسطة ومكان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع العادي المتوسطة MEM للثقافات السيطرة.
  4. إزالة نصف (250 ميكرولتر) وسيلة MEM من الثقافات CGC والاحتفاظ بها في 37 ° C.
  5. خلايا علاجمع MEM المتوسطة التي تحتوي على 2 × LME (250 ميكرولتر)، أي المخفف 1: 1 إعطاء تركيز جيد من 25 ملم، أو مع درجة حرارة متوسطة قبل MEM دون LME (250 ميكرولتر) للثقافات السيطرة.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع CO 2 6٪ لمدة 1 ساعة.
  7. غسل الخلايا مرتين في جديدة قبل حرارة متوسطة MEM لإزالة LME التي تحتوي على وسائل الإعلام، ومن ثم استبدال مستنبت المدورة وحجم مساو من جديد قبل حرارة متوسطة MEM إلى الآبار المقابلة.
  8. عودة الثقافات إلى الحاضنة (مرطب مع CO 2 6٪ عند 37 درجة مئوية) وتترك لبقية لمدة 24 ساعة قبل أي علاج آخر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قدرة هذه التقنية للقضاء على الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل انتقائي من CGC و / أو ثقافات مختلطة تعتمد على قدرة لاحقة من المحقق لتحديد بدقة وتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة من الخلايا المحيطة بها. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام صانع خلية دبيقي محددة، مثل isolectin-B4، كما هو موضح في الشكل رقم 1. وكما هو موضح في الشكل رقم 2، لم تسجل أية التغيرات الملحوظة في نجمية وكثافة الخلايا العصبية والتشكل مع الاحترام لكل مجموعة العلاج الرئيسي. الأهم من ذلك، لوحظ عدم حدوث ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أهم الخطوات لضمان القضاء الانتقائي الناجح الخلايا الدبقية الصغيرة من CGC و / أو الثقافات المختلطة هي: 1) الحفاظ على الثقافة CGC معقمة وصحية؛ 2) فلتر تعقيم المتوسطة LME التي تحتوي على والعودة الحل لدرجة الحموضة 7.4. 3) الحفاظ على وسائل الإعلام CGC المدورة وLME التي تحتوي على وسائل الإعلام في 37 ° C لتجنب الصدمة الحرارية. و4) تعمل بسرعة للحد من الوقت يتم الاحتفاظ الخلايا خارج الحاضنة.

كنا 25 ملم LME في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

كان هذا البحث مدعوما من Aims2Cure ، المملكة المتحدة وجائزة UCL Impact ، منحة الدكتوراه في JMP ومنحة دكتوراه في بناء القدرات في MRC في الخرف إلى JMP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ملقط Sigma-AldrichF4142الطرف المنحني يسهل إزالة المخيخ  
مقص التشريح الدقيقSigma-AldrichS3146نقطة مستقيمة وحادة تسهل تشريح القوارض P4-7   ؛
L-leucine ميثيل إستر هيدروكلوريدسيجما-ألدريتش7517-19-3
محلول EBSS  سيجما ألدريتشE7510-500 مل
بولي دي ليسينسيجما ألدريتش27964-99-4أغطية معطف قبل يوم واحد من الاستخدام   ؛
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما ألدريتشA9418
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجما ألدريتشP4417
DNaseسيجما-ألدريتشD5025
مثبط التربسين فول الصويا Sigma-AldrichT6414
الفأر المضاد للجسم المضاد ED1  أبكامab31630
محلول

المراجع

  1. Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
  2. Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
  3. Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
  4. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  5. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  6. Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
  7. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
  8. Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
  9. Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
  10. Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
  11. Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
  12. Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
  13. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
  14. Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
  15. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
  16. Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استنفاد الانتقائي للالدبقية الصغيرة من مخيخي الحبيبة الثقافات الخلية باستخدام L-ليسين استر الميثيل
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.